免疫组织化学技术2010(课堂PPT).ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,免疫组化实验,主讲人：石娇,1,参考书目,1,实用生物组织学技术 刘世新 科学出版社,2,组织病理技术 李甘地 人民卫生出版社,文章题目,重度妊高征胎盘组织细胞凋亡与HSP70，bax的表达,4,1,2,方法,1,2,1,标本收集 胎盘娩出后，立即从母体面随机选取,2,块大小约为,3cm x 2cm xlcm,的组织,(,避开钙化灶,),生理盐水冲洗后，每块标本切取约,1cm xlcm xlcm,的组织，,40g/LPBS,甲醛溶液固定用于电镜检查的组织放入,25g/L,的戊二醛液中固定其余部分立即置入,70,冻存前者常规石蜡包埋，,4um,连续切片备染,1,2,2,光镜、电镜检查 所有的标本均行光镜检查切片用苏木精,伊红染色，分别由两人观察，每张切片观察,10,个高倍视野，蜕膜组织细胞不计数在内使用透射电镜各检查,4,例,SPIH,及正常胎盘组织所检标本与相对应的光镜检查切片取自同一胎盘组织块,1,2,3,免疫组化 切片脱蜡后行抗原修复，分别滴加,HSP,70,及,bax,抗体,4,过夜；,DAKOEnvisionn,加入后温育,1h,，,DAB,显色苏木精复染，脱水封片光镜观察阳性结果为细胞内有棕黄色颗粒出现，依显色程度分,3,级：阴性无显色，浅棕黄色为阳性，棕褐色为强阳性,5,免疫组织化学6,主要内容,石蜡切片技术,免疫组化技术,图像采集与分析,实验动物,7,1 实验动物的处死,一 实验动物,2 取材方法及注意事项,3 标本的固定,8,9,10,1 动物处死,1,、空气栓塞致死法,:,取,50-100ml,注射器,从兔的耳静脉或大动物的腹股沟的股静脉迅速注入,.,兔和猫的致死空气量为,20-40ml.,此方法迅速、方便，但各脏器淤血明显。,2,、脑、脊髓破坏法：用金属探针经枕骨大孔入，蛙类,3,、断椎发：大白鼠和小白鼠,4,、麻醉后处死法：试剂：乙醚或氯仿,5-20ml,吸入麻醉法：适用于小白鼠、大白鼠、豚鼠及兔,注射麻醉法：适用于狗、猴等较大动物。,5,、急性大失血处死法：,（1）眼球摘除放血：适用于小白鼠、大白鼠,（2）血管切开放血：狗、猴及兔,11,12,取材方法,(3),取材时严禁机械损伤，,(4),尽量注意脏器的完整性,;,管状或囊状组织不应斜切：剪开铺在硬纸板上，黏膜面朝上,(1),取材的先后：消化管，肝脏、脾脏等多血器官及神经组织，其他脏器。,(2),取材的大小：一般,2cm1.5cm0.3cm,较小的组织如淋巴结、脑垂体应整个固定。,脑组织较柔软，最好用纱布包裹后在固定，,13,取材,*,准确，快速，完整，有代表性,动物标本：,-,大型动物：快,-,小型动物：灌注固定,-,手术标本：尽量包括病灶部位,/,病灶与正常组织交界处,/,病灶周围正常组织,体外培养的细胞标本：,-,贴壁生长细胞：爬片,-,悬浮生长细胞：离心沉淀涂片,14,标本固定,目的：防止细胞自溶，物质定位在原有部位。经固定产生不同折光率，及对染料的不同亲和力，利于着色。,(1),常用的固定液：,(3)Bouin,液,甲醛：,10ml,苦味酸饱和水溶液,(0.9),75ml,蒸馏水：,90ml,甲醛,25ml,冰醋酸,5ml,(2),中性缓冲甲醛固定液：,多聚甲醛：,g,蒸馏水：,100ml,NaH,2,PO,4,.H,2,O:4g,Na,2,HPO,4:,6.5g,15,标本固定,目的：,防止细胞、组织溶解及腐败，以保持细胞与生活时的形态相似。,物质定位在原有部位。,经固定产生不同折光率，及对染料的不同亲和力，利于着色。,固定剂还有硬化作用。,对象：蛋白质,16,标本固定,目的：防止细胞自溶，物质定位在原有部位。经固定产生不同折光率，及对染料的不同亲和力，利于着色。,(2),中性缓冲甲醛固定液：,多聚甲醛：,g,蒸馏水：,100ml,NaH,2,PO,4,.H,2,O:4g,Na,2,HPO,4:,6.5g,(1),10%甲醛固定液：,甲醛,（市售含量为36-40%,）,10ml,蒸馏水：,90ml,(3)Bouin,液,苦味酸饱和水溶液,(0.9%-1.2%),75ml,甲醛,25ml,冰醋酸,5ml,17,固定注意事项,固定时间要快,固定液的用量为组织块体积的15-20倍,固定时间,固定液避光，以免发生化学变化,18,二 石蜡切片,1 石蜡切片组织固定后的处理,组织块的修整,洗涤:目的把组织中的固定液彻底洗掉，自来水流水冲洗。,（1）各种以水配置的固定液，必须的。,（2）固定液为酒精或酒精混合液，不需要。,19,脱水：,常用脱水剂：,（1）非石蜡溶剂的脱水剂：酒精,70%酒精开始逐渐过度到无水已醇 入 二甲苯,（70%-80%酒精可以作为组织的长久保存液）,（2）脱水兼石蜡溶剂的脱水剂：正丁醇、叔丁醇,每次更换新的脱水剂，把组织放到吸水纸上吸干，,装组织的容器，也要控感水分，呦,20,二 石蜡切片,透明,当组织浸入透明液立即变浑浊，表面像蒙了一层薄雾一样不透明，脱水不净,光线基本能透过组织，组织呈透明或半透明立即取出，避免时间过长,咋算透明达到效果，啊？,21,二 石蜡切片,浸蜡和包埋：,注意事项：,浸蜡温度60 横温箱中2个小时，注意温度和时间,包埋：,切面向下,包埋面必须平整，太细小的组织可以在脱水、透明时就开始用伊红染料稍微染色或用擦镜纸包埋,包埋温度与浸蜡温度一致,包埋速度要快,22,二 石蜡切片,切片前准备,磨刀,载玻片擦洗干净，表面涂上蛋白甘油,23,切片中容易出现的问题,解决办法？,24,染色,25,H E,染色,26,镀银染色,应用硝酸银、氯化金等金属盐染色法可显示组织和细胞的一些特殊结构。镀银染色染色是组织学常用的一种方法，可用来显示神经元纤维、突触、神经末梢、网状纤维等。,27,28,兔肝,PAS,染色,猫气管 阿利新蓝染色,碳水化合物组织化学染色,29,脂类组织化学染色,用苏丹红染兔皮下脂肪组织内的脂滴呈鲜红色,30,31,免疫组织化学与免疫细胞化学技术,Immunohistochemistry and immunocytochemistry,免疫电镜技术,亲和免疫组织化学技术,免疫酶组织化学技术,免疫荧光组织化学技术,32,概述,免疫组织化学，又称免疫细胞化学,带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原,-,抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。,将血清学,抗原、抗体特异性结合和显微镜示踪法相结合的一种技术方法；将免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜,(,包括荧光显微镜、电子显微镜,),的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质,(,如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等,),。,33,特点及优点,特点,:,特异性强,灵敏度高,优点,:,将形态学改变与功能和代谢结合起来,保存形态学观察的优点,克服免疫学只能定量和定性不能定位的缺点,34,发 展 简 史,时间,人物,技术,1941,年,Coons,荧光素标记抗体,1968,年,中根一穗,(Nakane),酶标记抗体,1974,年,Sternberger,辣根过氧化物酶,-,抗氧化物酶,(PAP),技术,1975,年,Koehler and Milstein,单克隆抗体,1981,年,许世明,(Hsu),亲合组织化学技术,-(ABC),法,随后,相继出现,免疫金银染色法,免疫电镜技术,原位杂交技术,35,-,抗原的提取与纯化；,-,制备特异性抗体以及抗体的纯化；,-,标记抗体；,-,标本的制备；,-,免疫细胞化学染色；,-,观察结果。,内 容,36,抗原,(antigen,Ag),抗原,(antigen,Ag),在适当的条件下，能剌激机体的免疫系统发生免疫应答，产生,抗原受体（抗体或致敏淋巴细胞）,并能与相应受体在体内或体外特异性结合的物质。,37,抗原,(antigen,Ag),特性：,-,免疫原性：能诱导机体产生抗体，由,抗原决定簇,决定,-,反应原性：能特异性地与抗体结合的能力,*抗原决定簇,（,antigenic determinant):,抗原分子表面的一些特殊的化学活性基团区域，是抗原与抗体特异结合的基本单位，不同种属的动物,抗原决定簇完全或部分相同，因此从一种动物提取的某一抗原制备的抗体可在多种动物中进行相同抗原检测。,分类：,-,蛋白质抗原,/,多糖抗原,/,核酸抗原,/,低分子量物质抗原,/,氨基酸抗原,38,抗体（,antibody,Ab),免疫球蛋白（,immunoglobulin,Ig),为机体受抗原刺激后，由,B,淋巴细胞（浆细胞）分泌产生的一种能与相应抗原发生反应的球蛋白,包括：,IgGIgAIgMIgDIgE,39,抗体（,antibody,Ab),结构：,-,两条重链（,H,链）,-,两条轻链（,L,链）,可变区（,variable region,V,区）：,L,链,1/2,及,H,链,1/4,区域内的氨基,酸排列顺序可变。,决定抗体的特异性,是识别并与抗原决定簇结合的部位,恒定区（,constant region,C,区）：同一种属动物同一型,Ig,的氨基酸排列顺序相同,这是制备二抗，应用间接法标记信号放大的理论基础,40,抗体（,antibody,Ab),种类：,-,多克隆抗体（,polyclonal antibody,PcAb):,血清抗体,-,单克隆抗体（,monoclonal antibody,McAb,-,基因工程抗体：采用,DNA,重组技术所生产的抗体,41,-,多克隆抗体（血清抗体）：机体接受抗原的主动或被动免疫后，从血清中分离提纯的抗体。,-,单克隆抗体,:Kohler,和,Milstein,在,70,年代初发明，,将抗原免疫小鼠后，用小鼠脾脏淋巴细胞与体外培养的人骨髓瘤细胞株在一定的条件下融合，形成具有长期存活并能分泌抗体的杂交瘤细胞，将其分离培养后形成单个瘤细胞的克隆。培养上清或将杂交瘤细胞注入裸鼠腹腔产生的腹水中都含有瘤细胞分泌的,Ig,即,McAb,具有高特异性和高稳定性,42,抗体的标记,抗原,-,抗体复合物（不可见）,+,标记物,=,发光或显色（可见）,标记物,特点：,1,）与抗体形成牢固共价键,2,）不影响抗原与抗体的结合,3,）放大的效益高,4,）原位显示,43,抗体的标记,标记物的种类：,/,荧光素,*,（免疫荧光组织化学技术）,/,酶,*,（酶标抗体法,免疫酶组织化学技术）,/,生物素,*,（亲合免疫组织化学技术）,/,铁蛋白,/,胶体金,*,（免疫金银标记技术）,/,葡萄球菌,A,蛋白,/,放射性核素,44,免疫荧光组织化学技术,免疫荧光细胞化学技术是采用荧光素标记的已知抗体,(,或抗原,),作为探针，检测待测组织、细胞标本中的靶抗原,(,或抗体,),，形成的抗原抗体复合物带有荧光素，在荧光显微镜下，由于受高压汞灯光源的紫外光照射，荧光素发出明亮的荧光，这样就可以分辨出抗原,(,或抗体,),的所在位置及其性质，并可利用荧光定量技术计算抗原的含量，以达到对抗原物质定位、定性和定量测定的目的。,45,将已知的抗原或抗体标记上荧光素,荧光素受激发光的照射，由低能状态进入 高能状态，电子越迁后，辐射光量子释放能量回到原来的低能态。这时发出明亮的荧光。被荧光显微镜扑捉，从而对抗原进行定位、定量。,免疫荧光组织化学技术,一 原理,46,荧光标记物,异硫氰酸荧光素,（,Fluorenscein,isothiocyanate,FITC),-,性状：分子量为,389D,黄色结晶粉末,-,吸收光谱：,490495nm,-,发射光谱：,520530nm,，明亮黄绿色荧光,-1,个,IgG,最多可结合,15-20,个,FITC,分子,47,荧光标记物,四甲基异硫氰酸罗丹明（,tetramethyl rhodamine isothiocyanate,TMRITC),-,性状：紫红色粉末,-,吸收光谱：,550nm,-,发射光谱：,620nm,，橙红色荧光,48,免疫荧光组织化学技术,BACK,二 实验方法,1,直接法,又称一步法，,荧光标记已知特异性抗体,(,抗原,),直接用于细胞或组织抗原,(,抗体,),的检测,特点：特异性高敏感性差，不方便,49,免疫荧光组织化学技术,BACK,二 实验方法,间接法,又称,sandwith method,夹心法）,抗原,+,一抗,+,带荧光素二抗,(,抗种属特异性的,IgG,荧光抗体,),已知抗原,+,待测血清,+,带荧光素二抗,(,抗种属特异性的,IgG,荧光抗体,),特点：,-,不必标记一抗，多种一抗可使用相同二抗,-,敏感性高，但特异差,二抗,50,免疫荧光组织化学技术,BACK,二 实验方法,编号 品种 价格,BA1101,羊抗小鼠,IgGFITC 140,元,/0.1ml,BA1108,兔抗大鼠,IgGFITC 160,元,/0.1ml,二抗,51,免疫荧光组织化学技术,BACK,二 实验方法,3,双重免疫荧光组织化学标记方法,在同一组织标本上同时检查两种抗原,如分别用,FITC,标记的抗鼠,IgG,及,CY3,标记的抗兔,IgG,染标本,.,可以明确显示两种抗原的定位,.,52,免疫荧光组织化学染色方法,（一）标本制作,一般使用冰冻切片、细胞涂片，以冷丙酮固定,（二）荧光抗体染色方法,切片或涂片固定后，置于染色湿盒内,滴加未标记的特异性抗原作用切片于,37,，,30min,PBS,水洗,2,次，每次,5min,吹干,滴加特异性荧光抗体在切片上,37,，,30min,PBS,水洗,2,次，每次,5min,吹干,缓冲甘油封固，镜检,。,53,荧光标记抗体,优缺点：,-,随着免疫酶标抗体的出现而应用减少,-,仍用：能对活细胞染色，用于培养细胞、肾炎、皮肤免疫性疾病的研究及诊断，病原体及自身抗体的检测。,-,新用：流式细胞术（,FCM,）,/,荧光激活细胞分类器（,FACS,）,/,激光扫描共焦显微镜（,LSCM,）,BACK,54,免疫酶组织化学技术,用酶,(,如辣根过氧化物酶,),标记已知抗体,(,或抗原,),，然后与组织标本在一定条件下反应，如果组织中含有相应抗原,(,或抗体,),，抗原抗体相互结合形成的复合物中所带酶分子遇到底物时，能催化底物水解、氧化或还原，产生显色反应，这样就可以识别出标本抗原,(,抗体,),分布的位置和性质，通过图像分析并可达到定量的目的,55,一 酶标记抗体,理想的标记酶：,-,活性高且稳定,-,终产物稳定，不扩散,-,不影响抗原、抗体反应,-,组织及体内无内源性酶及底物,*没有完全满足条件的酶,免疫酶组织化学技术,56,（一）辣根过氧化物酶（,horseredish peroxidase,HRP),特点：,-,分子量：,40000D,，穿透性好,-PH3.512,范围内稳定,-,底物：,H2O2,-,反应式：,HRP+H2O2=HRP.H2O2,HRP.H2O2+DH2 HRP+D+2H2O,-D=,供氢体,常用,3,3-,二氨基联苯胺,(3,3-diaminobezidine,DAB),注意,:,有毒避光,-,反应式,:DAB,吲达氨聚合体,DAB,棕,(,棕色颗粒,),HRP,催化脱氢聚合 氧化,57,辣根过氧化物酶标记抗体,优点,:,-,稳定,-,反应效率高,25,分钟形成反应产物,问题,:,-,内源性过氧化物酶存在,(,如粒细胞,骨髓造血干细胞中,),对策,:,用,3%,过氧化氢溶液或,1%,过氧化氢,-,甲醇液处理切片,尤其冰冻切片,),-DAB,有毒,对策,:,戴手套,58,二 碱性磷酸酶,(alkaline phosphatase,AP),-,分子量,:80000D,-PH,值,:8.9,-,催化反应,:,-,萘酚磷酸酯,+H,2,O,萘酚,+,磷酸盐,萘酚,+,偶氮染料,(快红与快兰,),红色或兰色沉淀,AP,AP,采用戊二醛标记在抗体上,可以用于,Western Blotting,免疫细胞化学,ELISA,59,AP,标记抗体,问题,:,-,内源性,AP,的广泛存在,(,如肝,胎盘,小肠绒毛,骨基质,肾小管上皮,),对策,:,在孵育液中加入左旋咪唑抑制内源性,AP,或用石蜡包埋,-,适用于血细胞及骨髓切片的免疫组化染色,(HRP,强,),60,染色程序,免疫酶组化技术,:,/,酶标记法,:,将酶通过交联剂结合在抗体分子上，形成酶标记抗体,/,非标记抗体技术，将酶作为抗原与相应的特异性抗体连接进行的免疫反应,61,染色程序,1,直接法：,石蜡切片按免疫组化常规处理，,PBS,洗,5min,0.3%H,2,O,2,室温,10min,10%,正常羊血清封闭，室温,15min,滴加适当稀释的酶标一抗，,37,，,30min,PBS,水洗,2,次，每次,5min,加酶的底物溶液（,DAB,或,-,萘酚磷酸酯,）孵育,10min,镜下观察特异性染色清晰，封片。,62,二 酶标记抗体染色程序,1,间接法：,石蜡切片按免疫组化常规处理，,PBS,洗,5min,0.3%H,2,O,2,室温,10min,10%,正常羊血清封闭，室温,15min,滴加适当稀释的特异性抗体,(,一抗,),，,37,，,30min,PBS,水洗,2,次，每次,5min,滴加适当稀释的酶标二抗孵育,37,，,30min,加酶的底物溶液（,DAB,或,-,萘酚磷酸酯）孵育,10min,镜下观察特异性染色清晰，封片。,63,亲和组织化学（,affinity histochemistry):,利用某些,亲和物质对,之间的高度亲和特性，将酶、荧光素等标记物与亲合物质连接，对抗原或者其他靶物质进行定位和定量的方法。,亲和物质对,：生物素,/,亲和素、激素,/,受体、植物凝集素,/,糖类、葡萄球菌,A,蛋白,/IgG,亲和免疫组化技术,64,生物素（,biotin),又称维生素,H,或辅酶,R,-,性质：分子式,C,10,H,16,C,3,N,2,S,；分子量,244,-,作用：羧化酶的辅酶，,亲和素（,avidin),又称卵白素或抗生物素：,-,性质：分子量,68kD,碱性蛋白，由,4,个,128,个氨基酸组成的亚基构成,结合：,-,方式：非共价键结合，不可逆,-1,分子亲和素：,4,分子生物素,-PH1.5,时可完全分离,生物素,-,亲和素系统,65,生物素,-,亲和素系统优点,-,生物素分子量小,1,个抗体,:150,个生物素分子,-,不影响抗原抗体结合的能力,-,酶与生物素结合,不影响催化活性,-,亲合素也可与荧光素,酶等标记物偶联,-,灵敏度高,特异性强,稳定性好,无放射性污染,方便快速,66,亲和素,-,生物素方法,ABC,法特点：,-,敏感性高,-,背景清晰,-,适用于单克隆抗体,ABC,复合物,ABC,复合物,67,分类：,亲和素,-,生物素,-,过氧化酶复合物技术（,avidin biotin-peroxidase complex technique,ABC),SABC(StrepAvidin biotin-peroxidase complex),(,链霉亲和素,-,生物素,-,过氧化酶复合物技术,),酶标亲和素,-,生物素技术,(labeled avidin-biotin technique,LAB,技术）,68,S,ABC,和,LAB(,SP,),方法染色程序,材料,:,冰冻切片或石蜡切片材料,:,冰冻切片或石蜡切片,阻断内源性酶,阻断内源性酶10%,正常羊血清,室温,15min,10%,正常羊血清,室温,15min,适当稀释的一抗,室温,30min,适当稀释的一抗,室温,30min,PBS,洗,3,次,每次,5min,PBS,洗,3,次,每次,5min,加生物素标记的二抗,30min,加,25-50ug/ml,生物素标记的二抗,60min,PBS,洗,3,次,每次,5min PBS,洗,3,次,每次,5min,加,ABC,复合物,室温,30min,加,25-50ug/mlHRP,标记的亲合素,60min,PBS,洗,3,次,每次,5min PBS,洗,3,次,每次,5min,加底物显色,封片,.,加底物显色,封片,69,双重免疫组化染色,阻断法：先染第一种抗原，显色后用酸洗去已标记的,Ag-Ab,复合物，再进行第二重染色。,*如：第一重染色用过氧化物酶标记的亲和素,-,生物素系统显示第一种抗原,/,第二重染色用碱性磷酸酶标记的亲和素,-,生物素系统显示第二种抗原,70,免疫组化染色选择原则,-specificity,特异性,-sensitivity,敏感性,-simplicity,简便性,-safely,安全性,-save of time and money,省时省钱,71,非特异性染色,非特异性染色（,non-specific staining),也称背景染色,原因：,-,组织自发荧光,-,内源性酶,-,内源性生物素,-,抗体或酶不纯,-,标记过量,72,非特异性染色,解决方法：,例：,-,一抗前用二抗同种动物血清封闭组织中,FC,受体及电荷，避免其与第二抗体的非特异性结合,-3%H,2,O,2,封闭内源性过氧化物酶,-0.010.05%,伊文思蓝稀释荧光抗体，将背景染成红色荧光，与特异性黄绿色荧光形成对比。,-10%,牛血清白蛋白封闭法，消除游离醛基与,IgG,产生非特异性染色，提高特异性染色,73,抗体的保存,方法：,-,长期不用：冻存，密封，有效期可长达数年,-,短期内频繁使用：,4,，可保存数周,-,稀释抗体：一周内用完,74,抗体的浓度,可按推荐浓度，或自行测定稀释度,用,0.01mol/L PBS,缓冲液稀释抗体,(,如稀释抗体需长期保存,可在,100ml 0.05mol/L PH 7.4 TBS,加牛血清白蛋白,1g,NaN,3,0.2g,明胶,0.1g,稀释抗体,),*,前带效应,(prozone effect):,抗体浓度过高,阳性反应反而减弱或呈假阴性的现象,可能是由于一抗分子过多,竟争抗原结合位点,导致抗原,-,抗体结合不稳及脱落。,75,染色结果判断,标准：,-,阳性颗粒分布于胞质内、膜上或核内，细胞边界和核结构清晰,-,细胞间抗原含量不同，染色强度应有区别,如相同，可能是非特异性染色,*边缘效应：在石蜡切片的组织周围常见有深染区，向中心区逐渐变淡，称边缘效应。为非特异染色，也可在刀痕、折叠及坏死与受挤压的部位出现,76,77,78,对照实验,阳性对照：,-,用已知抗原为阳性的标本与待检测标本同时进行染色,阴性对照：,-,与上述相反,-,不加一抗,79,组织细胞的标本制备,原则：尽可能多地保存抗原和尽可能多地保存组织与细胞的形态学,80,常用固定剂,4%,多聚甲醛缓冲液,-,配法：取多聚甲醛,40g,，溶于,0.1mol/L pH7.4 PBS 500ml,搅拌均匀，加热至,60,，滴加,1N NaOH,至溶液清澈，补,PBS,至,1000ml,4,保存。,-,应用：光镜免疫组化,-,时间：温和，可长期保存组织,81,常用固定剂,戊二醛,-,多聚甲醛缓冲液在上液中加入,0.25%1%,戊二醛,-,应用：光、电镜免疫组织化学研究,82,常用固定剂,丙酮及醇类固定剂,-,原理：使组织中的蛋白质和糖沉淀,-,特点：穿透性好，但小分子蛋白及多肽保存差,83,包埋,石蜡包埋：,优点：组织结构好，抗原定位好,注意：,-,尽量在低温环境进行,-,组织块尽量小,-,用低温蜡,84,包埋,冰冻包埋：,优点：抗原性保存好，快,注意：,*冰晶,-,用高渗（,2030%,蔗糖缓冲液，,4,过夜）溶液渗泡后加包埋剂,-,速冻：液氮法,/,干冰丙酮法,85,抗原修复,抗原修复（,antigen retrieval,AR),原因：甲醛固定造成抗原失活,-,由于甲醛所致蛋白质的交联，反应产物的水解过程受某些侧链的限制。,解决方法：,可在高温及强碱的条件下恢复,86,加热,AR,法,要点：,-,玻片需用粘片剂处理，,AR,前切片置,60,至少,1h,-,加热保证切片完全浸于水溶液中（加大容器或分两次处理）,-,容器应洗净,-AR,处理前用蒸馏水洗切片，以防,AR,液与其他缓冲液反应,87,推荐加热,AR,法,步骤：,-,切片脱蜡后，水洗，置,AR,液（常用：,0.01mol/L,枸橼酸缓冲液,PH6.0),中,-,置微波炉中，加热,5min,，补加,AR,液，再加热,5min,，时间共计,10-20min,。,-,加热后切片置室温,15min,降温，蒸馏水洗，染色,88,免疫酶组织化学技术,89,亲和免疫组织化学技术,ABC,法,90,亲和免疫组织化学技术,91,免疫电镜技术,免疫电镜技术,(Immune electron microscopy,，,IEM):,抗原抗体反应的特异性与电子显微镜的高分辨力相结合，在亚细胞和超微结构水平上对抗原物质进行定位分析的一种高度精确、灵敏的方法,特异性抗体用电子致密物质，如铁蛋白、胶体金等标记后，使之与组织超薄切片中的抗原结合，在电镜下观察到标记物所在位置，即为抗原抗体反应的部位。,92,三、免疫电镜技术的实验过程,简易流程,抗体,悬浮态,抗原,标记,抗体,抗体,抗原,复合物,负染色,悬浮态,抗原,细胞内、外,抗原,抗体,抗原,复合物,固定、切片,染色等处理,93,予被标记抗体可以是与被检测的抗原相应特异性抗体（一抗），亦可为二抗。但抗体本身没有内在电子致密性，不宜用电镜观察，因此需要使抗体与电子致密的标记物结合形成特殊的标记抗体。,常用的抗体标记方法有三种：,1.,铁蛋白标记抗体,2.,酶标记抗体,3.,胶体金标记抗体,（一）、抗体的标记,94,A.,铁蛋白标记抗体制备,铁蛋白,:,是一种含,Fe,2+,的蛋白质，内含直径,55,60nm,的铁胶粒核心，有,2000,3000,个铁原子，这些铁原子使之成为电子致密物。,双功能试剂,:,（,如戊二醛等）分子量低，能同时与铁蛋白和抗体结合。,铁蛋白标记抗体,:,将铁蛋白、双功能试剂、欲标记抗体混合即得之。,B.,反应机制：,1,铁蛋白标记抗体,95,铁蛋白分子,96,C,特点,研究悬浮液、细胞表面、细胞内的抗原的定性或定位，如：病毒、细菌、红血球、腹水癌细胞和淋巴细胞等抗原的定位等，,用于病理学中研究抗体的形成及其在细胞内的定位等。,97,2,酶标记抗体,A.,酶标记抗体制备,酶,（常用辣根过氧化物酶）（碱性磷酸酶适于标记植物细胞的抗体）。与抗体交联后仍能保持活性,抗体,（一抗或二抗）,底物,在酶的作用下形成致密物，可用电镜检测；,B.,反应机制：,酶复合物与抗原作用，形成免疫复合物，再与适宜的底物作用，生成电子致密的反应产物。,98,电镜酶标记技术,以,HRP,标记抗体，通过,H,2,O,2,DAB,底物系统被酶分解的呈色反应，来显示抗原抗体反应部位,DAB,分解产物为不溶性的棕色吩嗪衍生物，经过,Os0,4,处理后变黑，具有高电子密度，十分适合于电镜观察,HRP,的分子量,(40kDd),比铁蛋白,(750kDa),将近小,20,倍，酶标抗体较易透过经适当处理后的组织细胞膜，能用于定位细胞内抗原,但酶反应产物的分辨率不如颗粒性标记物高,(,如铁蛋白，胶体金,),。,99,100,101,C.,特点,优点：酶分子量较铁蛋白小，更适合细胞内抗原定位研究。染色强度随反应时间增长而增强。,缺点：反应产物易堆积、扩散使分辨率降低。动、植物体内的组织和细胞中含有大量的抑制性内源酶，往往会产生各种非特异性的反应。,102,电镜酶标记技术,103,3,胶体金标记抗体,A.,胶体金标记抗体制备,胶体金,是一种由极小的金颗粒组成的、带负电荷的、疏水性的胶状体。胶体金与抗体先结合，再与细胞中相应的抗原发生特异性免疫反应，形成抗原与胶体金标记的抗体复合物。,B,反应机制：,104,电镜胶体金标记技术,105,胶体金标记技术,106,C.,特点：,胶体金性能稳定、对细胞无毒性、金颗粒形状规则、电子密度高、便于观察和分析。,选择直径规格不同可对同一细胞中的不同种抗原进行双重或三重标记，以便进行抗原的定性和定位的比较研究。,因为胶体金颗粒的直径小，容易渗透到细胞质里，甚至细胞质中的一些细胞器里。,通过分析金颗粒的相对密度的高低，还能进行半定量的研究。,107,（二）、免疫电镜样品制备,细胞内抗原的定位法：,（,1,）前固定：,1,2,的戊二醛轻微固定。,（,2,）打开细胞膜：,铁蛋白的分子量较大，为了使其能渗透到细胞内进行标记，免疫反应前先使细胞膜打开。（冻融法、冷冻切片、药物处理）,（,3,）免疫反应：,直接免疫反应：,把样品浸入免疫铁蛋白溶液中，,37 C 40,60,分钟。然后用缓冲液彻底清洗。,间接免疫反应：,把样品浸入无标记的特异性抗体中，室温下作用,20,30,分钟。用缓冲液充分洗去没结合上的抗体之后，再与免疫铁蛋白作用。,（,4,）固定、脱水和包埋、切片,。,1,、铁蛋白免疫样品制备,108,细胞表面抗原的定位法：,（,1,）,1,2,戊二醛固定样品,1,15,分钟。,（,2,）把样品浸在铁蛋白标记物中,1,时，,（,3,）用戊二醛缓冲液固定,1,3,小时。,（,4,）常规脱水、包埋和超薄切片。,病毒和生物大分子等,（,1,）铜网膜上加一滴牛血清蛋白略干，,（,2,）将样品悬液滴其上，滤纸吸干，,（,3,）滴一大滴铁蛋白,抗体复合物，反应,5min,（,4,）缓冲溶液漂洗。,（,5,）甲酸铀负染。,109,病毒感染的细胞：,（,1,）前固定：多聚甲醛固定,2,3,小时，彻底清洗。,（,2,）加酶标记抗体：放在,37C,恒温水浴中作用,45,分钟，再转入,4C,冰箱中作用,6,12,小时，清洗。,（,3,）中间固定：,2,5,戊二醛缓冲液，,4C,下，,1,小时，清洗。,（,4,）加底物：在,37C,下孵育,30,分钟。,（,5,）后固定：,1,俄酸，,4 C,，,30,60,分钟，清洗。,（,6,）脱水、常规包埋、超薄切片。,2,、,免疫酶样品制备,110,细胞表面（或细胞外）抗原,(1,）前固定：用 戊二醛固定,1,15,分钟，清洗。,（,2,）免疫酶染色：在,20,37 C,下，染,30,60,分钟，清洗。,（,3,）中间固定：用,3,戊二醛固定,1,3,小时。,（,4,）加底物：,（,5后固定：,l,俄酸,10,30,分钟，,4,。,（,6,）常规脱水、包埋、超薄切片。,111,细胞内抗原的染色,：,（,1,）固定：,（,2,）脱水、包埋和制作超薄切片：,（,3,）溶去包埋介质、彻底清洗。,（,4,）免疫反应：把载网漂浮在酶标记的抗体溶液上，室温下作用,30,分钟，清洗。,（,5,）加底物：,（,6,）饿化：,1,饿酸处理,10,15,分钟。,112,免疫胶体金标记悬浮样品的抗原：,（,1,）沾样：,取一滴悬浮样品点滴在蜡盘上，把已有支持膜的载网膜面朝下放在液滴上，室温下作用,5,7,分钟。清洗,.,（,2,）封闭：,取一滴,1,BSA,，把切片的膜面朝下放在液滴上，,37C,下作用,30,分钟（用以除去非特异的染色）。清洗,（,3,）一抗处理：,把载网膜面朝下漂浮在单克隆抗体的液滴上,37C,下,30,分钟。清洗,（,4,）桥接：把载网膜面朝下漂浮在免抗鼠,IgG,液滴上，,37C3 0,分钟。清洗,（,5,）二抗处理：,把载网放在羊抗兔,IgG,胶体金的液滴上清洗,（,6,）自然干燥后电镜观察。,3,、,免疫胶体金样品制备,113,1.,研究组织细胞的形态功能，细菌、病毒等病原物的形态结构和性质。,2.,在研究细胞表面和细胞内某种抗原的定位和定性。,3.,抗体合成过程中免疫球蛋白的分布情况。,4.,抗原一抗体复合物的精细结构，以及鉴定免疫损伤引起的细胞病理变化。,总之，这一技术把细胞超微结构及其功能的研究结合起来，在病理学、生理学、免疫学等学科的研究中研究中得到了广泛的应用,。,（三）免疫电镜技术主要应用,114,固定的不适当 酶失活 反应阴性,切片处理不当 酶定位的变化,孵育液,pH,值不准确 底物的非酶分解 最终反应,产物的扩散,孵育液底物不纯 特异性的变化 （没有和结构,的对应关系）,捕捉剂不当,孵育液向切片内 酶反应阴性 局部定位的异常,渗透不好,孵育温度时间不当 捕捉反应的变化,表,II,人工产物与原因及其关系,115,