NY∕T 539-2017 副结核病诊断技术(农业).pdf

ICS 11.220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准副结核病诊断技术Diagnostic techniques for paratuberculosis NY/T 539-2017 代替NY/T539- 2002 2017 -06-12发布2017-10-01实施中华人民共和国农业部发布NY/T 539一2017刚昌本标准按照GB/T 1. 1-2009给出的规则起草。本标准代替NY/T539一2002(副结核病诊断技术。与NY/T539一2002相比，除编辑性修改外，主要技术变化如下:一一修改了范围(见第1章); -一一增加了术语和定义(见第2章); 一一增加了临床诊断(见第3章); 一一修改了细菌学检查(见第4章); 增加了病原分离培养(见第5章); 一一删除了补体结合试验;一一修改了酶联免疫吸附(ELISA)试验(见第7章); 一一增加了琼脂扩散试验(见第8章); 一一增加了副结核病诊断方法的适用性(见附录A)和培养基配制(见附录。本标准参考采用世界动物卫生组织(OIE)(陆生动物诊断试验和疫苗于册)(2016年OIE官方网站在线版)中的副结核病章节。本标准由农业部兽医局提出。本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。本标准起草单位:中国动物卫生与流行病学中心、吉林农业大学。本标准主要起草人:张喜悦、姜秀云、高云航、徐凤宇、范伟兴、孙明军、王伟利、巩红霞、田莉莉、王岩、赵宏涛。本标准所代替标准的历次版本发布情况为:一一-NY/T53920020 I NY/T 539-2017 副结核病诊断技术1 范围本标准规定了副结核病的诊断技术。本标准的病原分离鉴定、组织病理学和粪便显微镜检查适用于临床病例的确诊;ELISA和琼脂扩散试验适用于感染率的流行病学调查以及免疫后个体或群体免疫状态的监测;变态反应试验适用于免疫状态的监测。各种诊断方法的适用性见附录A。2 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。2. 1 副结核病(约内氏病paratuberculosis(Johnes disease) 由禽分枝杆菌副结核亚种引起的反鱼动物的一种慢性肠炎性疾病。3 临床诊断3. 1 临床症状3. 1. 1 牛的症状表现为进行性消瘦和腹泻，腹泻牛在群中最初是间歇性出现，而后日益增加，直至腹泻牛在群中不断出现。3. 1.2 部分鹿感染后可能突发性腹泻、体重骤降，并在2周3周内死亡。3. l. 3 其他动物可能在元明显腹泻的情况下，几个月后出现极度消瘦。3.2 病理变化3.2. 1 临床症状的严重性与病变程度并无密切相关性。3. 2. 2 牛的小肠和大肠末端黠膜增厚，尤其是回肠末端，应检查其特征性的增厚和皱榴病变。早期病变可于强光下观察到散在的蚀斑。3. 2.3 鹿的小肠和大肠未端可见黠膜充血、廉烂和哥哥斑。3.2.4 山羊、绵羊的肠系膜淋巴结可见干酷样坏死或钙化。3.2.5 增生性肠炎病变样品经固定00%福尔马林)、切片、苏木紫一伊红染色，病变可见蒙古膜固有层浸润、淋巴集结和肠系膜淋巴结皮质有大的淡染上皮样细胞和多核朗罕氏巨细胞浸润;经妻一尼氏染色，可见两种细胞中有成丛的或单个的抗酸菌。3.3 流行特点3. 3. 1 该病常见于家养和野生反色动物。3. 3. 2 该病主要经消化道感染，也可垂直传播给胎儿。3.3.3 初次感染禽分枝杆菌副结核亚种的牛群中，首先是2岁 3岁的牛出现症状。当牛群持续感染1年2年后，任何年龄段的牛均可出现症状，但3岁5岁奶牛的病例较多。3.4 结果判定反鱼动物出现3.1的临床症状、具有3.2的病理变化并符合3.3的流行特点时，可判为临床诊断阳性。1 NY/T 539-2017 4 病原显微镜检查4. 1 材料准备4. 1. 1 器材水浴锅、离心机、显微镜和载玻片。4. 1. 2试荆0.5%氢氧化铀溶液(0.5%NaOH)、妻一尼氏染色(Ziehl-Neelsen染色、ZN染色)试剂(配制及染色方法见附录B)。4.2 操作方法取待检粪样(尽可能取带混匀，55.CJ，j(浴乳化30mm离心30min，去上氏染色后镜检。4.3 结果判定4.3. 1 阳性在细胞内阳性。4.3.2 阴性未出现5 5. 1 材料准5. 1. 1 器材磁力5. 1.2 试剂膜蛋白酶(Duboss培养基5.2 样品准备5.2. 1 组织样晶为防止污染，用无从回盲瓣、肠系膜结节用4%NaOH调整pH至中性，去上清。沉淀用20mL o. 75% 5.2.2 粪便样品粪便样品处理前应一70.C冻存，不得使用防腐剂。的0.5%NaOH溶液，去沉渣后，再以3000r/ 。火焰固定，妻一尼f s或改良，不得使用防腐剂。2.5%)的无菌容器中。g3 000 g离心30min，弃的沉淀即为接种物。将19粪便放人装有20mL无菌蒸馆水的50mL试管中，室温振荡30min，静置30min。取最上层的5mL悬浮液，加至含有20mL o. 95% HPC的试管中，混匀后室温直立静置18h。试管底部的沉淀即为接种物。5. 3 接种培养取100L接种物，分别接种3个含分枝杆菌素和1个不含分枝杆菌素的Herrolds培养基，将样品均匀接种于斜面。将试管螺帽拧松后于37C斜面放置约1周，当水分从斜面上蒸发以后，将试管螺帽拧紧后垂直放置。37.C培养6个月，从第6周起，每周观察1次。NY/T 539-2017 5. 4 生长特性初代培养会在接种后5周至6个月长出菌落，在含有分枝杆菌素的Herrolds培养基上，禽分枝杆菌副结核亚种的初始菌落很小co.25 mml mm)，无色、半透明、半球状、边缘整齐、表面光滑、有光泽，随着时间延长，菌落变大(可达2mm)，不透明，菌落的形态从光滑变为粗糙，从半球状变为乳头状。5.5 结果判定如在含有分枝杆菌素的Herrolds培养基或含有分枝杆菌素的改良Duboss培养基上有符合禽分枝杆菌副结核亚种特性的菌生长，而在不含分枝杆菌素的培养基上无菌生长，镜检为抗酸染色阳性的红色成丛杆菌，出菌时间较长，且PCR鉴定为阳性(参见附录D、附录E)，判为禽分枝杆菌副结核亚种培养阳性。6 皮内变态反应试验6. 1 材料准备6. 1. 1 器材游标卡尺、灭菌的1mL注射器或连续注射器、针头和75%酒精棉。6. 1. 2 试剂禽分枝杆菌副结核亚种提纯蛋白衍生物(副结核PPD)或禽分枝杆菌提纯蛋白衍生物(禽结核PPD)。6. 2 操作方法6.2. 1 记录被检动物编号，在颈侧中1/3处的健康皮肤处剪毛，直径约10cm，用于捏起注射部位的皮肤，以游标卡尺测量皮肤皱榴厚度并记录，之后局部消毒。6.2.2 将副结核PPD或禽结核PPD以灭菌生理盐水稀释至0.5mg/mL，针头与皮肤呈15020。的角度进行皮内注射。无论动物种类及大小一律注射0.1mL。注射后，注射部位应呈现绿豆至黄豆大小的小包。如注至皮下或溢出，应于离原注射点8cm以外处补注一针，并在记录中注明。6. 2. 3 牛、羊也可在尾根无毛的皱裙部进行皮下注射。6. 3 结果判定6.3. 1 判定方法注射72h后观察反应，检查注射部位有无红、肿、热、痛等炎性反应，并以游标卡尺测量注射部位的皮肤皱榴厚度。6.3.2 判定标准具体判定标准如下:a) 变态反应阳性c+):局部有炎性反应，皮皱差注4mm;b) 变态反应疑似(土):局部炎性反应不明显，皮皱差为2.1 mm3. 9 mm; c) 变态反应阴性(一):局部无反应或炎性反应不明显，皮皱差2.0mm。6. 3. 3 疑似反应的判定变态反应疑似，应于3个月后复检。复检时，应于注射部位对侧的相应部位进行皮下注射，72h后仍为变态反应疑似的，则判为变态反应阳性。6. 3. 4 其他情况的判定尾根试验中有反应者(不论皮皱差大小和炎性反应轻重)均判为变态反应阳性c+)，鹿有任何形式的肿胀均判为变态反应阳性(十)，无任何反应者判为变态反应阴性(一)。7 酶联免症吸附试验7. 1 材料准备3 NY/T 539-2017 7. 1. 1 器材酶标仪、恒温箱和加样器等。7. 1.2 试剂禽结核分枝杆菌副结核亚种抗原包被板、酶标抗体、阳性对照血清、阴性对照血清、样品稀释液(含草分枝杆菌吸收抗原)、洗涤液、底物溶液和终止液等ELISA试剂。上述试剂应于20C80C保存，使用前恢复至室温Cl80C260C)。7.2 操作方法7.2. 1 血清处理将待检血清、阳性对照血清混匀后370C作用30min性反应成分。7. 2. 2 加样将处理后的血洗涤液洗涤3次。7. 2. 4加每孔当延长或8. 1 材料准备8. 1. 1 器材平皿、加样器、打孔器、8. 1. 2 试剂菌吸收抗原)进行稀释，抗原去除血清中的非特异OC)作用1h，使用180C260C) 色变化适(取甘氨酸75.0g、巴比妥铀2.6 g、叠氮铀3.8g，加蒸馆水至1000mL，用0.2mol/L盐酸调pH8.的等。8. 2 操作方法8.2. 1 琼脂平板制备用含叠氮铀的巴比妥缓冲液CpH8.的配制0.75%的琼脂糖平板。8. 2. 2 打孔、封底使用7孔梅花形打孔器打孔，用针头将孔内琼脂块挑出。为防渗漏，需用酒精灯火焰加热封底。8. 2. 3 加样在中央孔加入抗原，周围孔分别加人阳性对照血清、阴性对照血清和待检血清，各孔均以加满不溢4 为度。然后，置3 7C湿盒扩散72h,24 h初判，72h终判。8. 3 结果判定8. 3. 1 阳性NY/T 539-2017 当阳性对照血清孔与抗原孔之间形成沉淀线、阴性对照血清孔与抗原孔之间无沉淀线，被检血清孔与抗原孔之间出现沉淀线，且与阳性对照血清沉淀线末端相吻合时，被检血清即判为阳世。8. 3. 2 阴性当阳性对照血清孔与抗原孔之间形成沉淀线、阴性对照血清孔与抗原孔之间无沉淀线，被检血清孔与抗原孔之间无沉淀线出现时，被检血9 综合判定。3.4或4.3阳性，且5 NY/T 539-2017 附录A(规范性附录)副结核病诊断方法的适用性副结核病各种诊断方法的适用性见表A.l。表A.l副结核病诊断方法的适用性副结核清净调运前副结核根除运动中的临床病例的免疫后个体方法阴性个体的流行率的调查或群体免疫牛群的监测复核监测确诊状态的监测组织病理学十十+十十病原粪便ZN染色+ 鉴定病原分离培养+ + + + + 民疫学琼脂扩散试验. + + 十+ 十+ELISA + + + 十+ 十+试验变态反应+ 十十+注:+为推荐方法;+为适宜方法;+为某些情况下可以应用，但成本、可靠性或其他因素影响其使用;一为不适用川仅用于屠宰后;养特适用于绵羊和山羊。6 B.1 染色液的配制B. 1. 1 石炭酸复红液取碱性复红4g，加9 59份，混合，滤纸过滤。B. 1. 2 3% 取浓盐酸3将制好稍冷，倾去染洗，干燥。NY/T 539-2017 附录B(规范性附录)妻一尼氏染色法Ziehl-Neelsen染色法)01%的氢氧化腾为度，7 NY/T 539-2017 C.1 草酸、孔雀石绿混合液附录C(规范性附录)培养基配制取草酸10g、孔雀石绿0.02g溶于100mL蒸馆水中，用0.45m滤膜过滤除菌。C.2 两性霉素B、新霉素混合液取两性霉素B5mg、新霉素5mg溶于100mL蒸馆水中，用0.45m滤膜过滤除菌。C. 3 Herrold s卵黄培养基取蛋白陈9.0 g、氯化铀4.5g、牛肉浸膏2.7g、甘油27.0mL、丙嗣酸铀4.1g和琼脂15.3g，将上述6种成分加入到870mL蒸馆水中加热溶解。用4%氢氧化铀溶液调pH6. 97. 0，并通过试验保证固体培养基的pH7. 27. 3。将2mg分枝杆菌素溶解至4mL乙醇中后加到培养基中。121.C高压25mlno冷却至56.C后无菌加人120mL(约6个)蛋黄和无菌的5.1mL 2%孔雀石绿水溶液。轻轻振荡后，分装到无菌试管中。加人50mg氯霉素，10万IU青霉素和50mg两性霉素B(含两性霉素B的Herrold s培养基在4.C下保存1个月)。C.4 改良的Dubos培养基取酷蛋白氨基酸2.5 g、天门冬酷胶0.3g、无水磷酸氢二铀2.5g、磷酸二氢饵1.0g、拘橡酸铀1.5g、结晶硫酸镜0.6g、甘油25.0mL、1%吐温80溶液50.0mL和琼脂15.0g，将各种盐以微热溶于蒸馆水中，使体积为800mL。加人0.05%分枝杆菌素酒精溶液(2mg溶解在4mL乙醇中)，而后将培养基水浴加热到100.C，然后将培养基115.C高压灭菌15mino水浴冷却至56.C，加入抗生素00万IU青霉素，50mg氯霉素和50mg两性霉素B)和血清(200mL经过滤除菌、并56.C灭能的牛血清)。培养基充分混合后，将其分装到灭菌的试管中。这种培养基的优点是透明，有利于菌落的早期检测。8 D.l 样品处理附录D(资料性附录)病原菌PCR试验NY/T 539-2017 病原分离培养物经800C灭活2h，取100mg，加3mL PBS，海匀，放置30min或300r/min室温离心5min。取上清液，室温放置30min或300r/min室温再次离心5min。取上清液，12000r/ min室温离心15min，弃上清液，加人400LTE。D.2 DNA模板提取将处理样品于800C水浴加热20min，冷至室温。加50L溶菌酶，370C振荡培养1h。加75LSDS/蛋白酶K(70mL 10% SDS中加人5mL 10 mg/mL蛋白酶K)，混匀，6 50C水浴加热10min。加100L 5 mol/L NaCl和100L650C预热5min的CTAB/NaCl(4. 1 g NaCl溶于80mL水，加人10g CTAB，加水至100mL)，上下颠倒混匀，直至液体变为白色(奶状)，650C水浴加热10min。加750L三氯甲烧:异戊醇(24: 1)，混匀，12000r/ min室温离心5min。取上层水相于新管，加等体积的三氯甲炕:异戊醇(24: 1)，混匀，12000r/ min室温离心5min。取上层水相于新管，小心加人O.6体积的异丙醇沉淀核酸，小心手摇混匀，一200C放置30min, 12000 r/ min室温离心15mino弃上清液，加入500L预冷的70%的乙醇，12000r/ rnin室温离心5min，弃上清液。小心吸走液体，室温下干燥10min左右，用50LTE溶解，40C保存。D.3 PCR反应D.3. 1 引物正向引物:Primer90: 5-GTT CGG GGC CGT CGC TTA GG-3;反向引物:Primer91: 5-GAG GTC GAT CGC CCA CGT GA-3。扩增副结核分枝杆菌基因中的400bp DNA片段。D. 3. 2 扩增程序及反应条件950C预变性5min;930C变性1min580C退火1min720C延伸3rnin，共3 3个循环;720C延伸10口llnoD. 3. 3 反应体系设阳性对照、阴性对照和空白对照，用副结核标准菌株的模板DNA做阳性对照，用其他非副结核杆菌的模板DNA做阴性对照，用蒸馆水做空白对照模板。PCR反应总体积2 5L，依次加入以下试剂:无菌去离子水15.75L;不含镜离子10XTag缓冲液2.5L;25 mmol/L氯化镇1.5L;3.2mol/LdNTPs 2. 0 L; 100 pmol/L Primer90 O. 5L; 100 pmol/L Primer91 0.5L;5 U/L Taq酶O.25 L;DNA模板2.0 L。D. 3. 4 PCR扩增产物电泳检测用TAE电泳缓冲液配制成1%琼脂糖平板(澳化乙链终浓度O.5g/mL)。将平板放人水平电泳槽中，加入1XTAE电泳缓冲液刚刚高出凝胶表面，将PCR扩增产物6L与6L上样缓冲液混合，分别加入样品孔中，取5LDNA Marker DL 2000加入到标准分子量对照孔内。5V/ cm恒压电泳40mm。凝胶成像分析系统检测，并记录结果。9 NY/T 539一2017D.4 结果判定D. 4.1 阳性PCR后，阳性对照会出现一条400bp的DNA片段，阴性对照和空白对照没有核酸带。待检样品中如出现400bp的DNA片段，经测序后符合附录E的序列，即为PCR鉴定阳性。D. 4. 2 阴性在阳性对照、阴性对照和空白对照成立的情况下，未出现400bp的DNA片段，即为PCR鉴定阴性。10 NY/T 539-2017 附录E(资料性附录)PCR扩增产物的参考序列GTTCGGGGCCGTCGCTTAGGCTTCGMTTGCCCAGGGACGTCGGGTATGGCTTTCATGTGGTTGCTGTGTTGGATGGCCGMGGA GATTGGCCGCCCGCGGTCCCGCGACGACTCGACCGCTAATTGAGAGATGCGATTGGATCGCTGTGTAAGGACACGTCGGCGTGGTCGTC TGCTGGGTTGATCTGGACAATGACGGTTACGGAGGTGGTTGTGGCACAACCTGTCTGGGCGGGTGGACGCCGGTAAGGCCGACCATT ACTGCATGGTTATTMCGACGACGCGCAGCGATTGCTCTCGCAGCGGGTGGMCGACGAGGGCGCTGCTGGAGTTGATTGCGGCG GTGACGACGTTGGCCGATGGAGGCGAGGTCACGTGGGCGATCGACCTC 11 NY /T 539-2017 中华人民共和国农业行业标准副结核病诊断技术NY/ T 539-2017 争导* 9毛中国农业出版社出版(北京市朝阳区麦子店街18号楼)(邮政编码100125网址.ccap. COll1. cn) 北京印刷一厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经销* 关美开本880rnrnX1230=丑1/16印张l字数20千字2017年9月第1版2017年9月北京第1次印刷书号16109 4205 定价24.00元版权专有侵权必究举报电话[phone]