天然药物化学成分的提取方法.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,天然药品化学成份提取分离方法,1,天然药物化学成分的提取方法,第1页,化学成份提取分离方法,天然药品化学研究常从有效成份或生理活性成份提取、分离工作开始。在进行提取之前，应了解所用材料基源（如动、植物学名）、产地、药用部位、采集时间与方法等。,目标物为已知成份或已知化学结构类型，如从甘草中提取甘草酸、麻黄中提取麻黄碱，或从植物中提取某类成份如总生物碱或总酸性成份时，工作比较简单。普通宜先查阅相关资料，搜集比较该种或该类成份各种提取方案，尤其是工业生产方法，在依据详细条件加以选取。,从中草药或天然药品中寻找未知有效成份或有效部位时，情况就比较复杂。只能依据预先确定目标，在适当活性测试体系指导下，进行提取、分离并以对应动物模型筛选、临床验证、重复实践，才能到达目标。,2,天然药物化学成分的提取方法,第2页,一、有效成份提取,溶剂提取法,水蒸气蒸馏法,升华法,3,天然药物化学成分的提取方法,第3页,溶剂提取法,溶剂提取法系选择适当溶剂将中草药中化学成份从药材中提取出来。,天然药品中化学成份在溶剂中溶解度直接与溶剂性质相关。溶剂可分为水、亲水性有机溶剂和亲脂性有机溶剂。一些常见溶剂脂性强弱次序以下：,石油醚,苯,氯仿,乙醚,乙酸乙酯,丙酮,乙醇,甲醇,水,天然药品化学成份可经过结构预计它们极性。4,天然药物化学成分的提取方法,第4页,溶剂提取法,甙类分子中结合有糖分子，羟基数目多，能表现强亲水性，而甙元则属于亲脂性化合物，而生物碱盐，能够离子化，加大了极性，就变成了亲水性化合物。鞣质是多羟基衍生物，列为亲水性化合物。油脂、挥发油、蜡、脂溶性色素都是强亲脂性成份。,萜类、甾体等脂环类及芳香类化合物因为极性较小，易溶于氯仿、乙醚等亲脂性溶剂中；,糖苷、氨基酸等成份极性较大，易溶于水及含水醇中；,酸性、碱性及两性化合物，因为存在状态（分子或离子形式）随溶液而异，故溶解度将随,pH,而改变。,5,天然药物化学成分的提取方法,第5页,溶剂提取法,只要中草药成份亲水性和亲脂性与溶剂此项性质相当就会在其中有较大溶解度，即所谓“相同相溶”规律。这是选择适当溶剂自中草药中提取所需要成份依据之一。,6,天然药物化学成分的提取方法,第6页,水蒸气蒸馏法,水蒸气蒸馏法只适合用于含有挥发性、能随水蒸气蒸馏而不被破坏，与水不发生反应，且难溶或不溶于水成份提取。天然药品中挥发油、一些小分子生物碱如麻黄碱、烟碱、槟榔碱以及一些小分子酚性物质如牡丹酚等提取可采取水蒸气蒸馏法。,7,天然药物化学成分的提取方法,第7页,升华法,一些固体物质如水杨酸、苯甲酸、樟脑等受热在低于其熔点温度下，不经过熔化就可直接转化为蒸气，蒸气遇冷后又凝结成固体称为升华。天然药品中有一些成份含有升华性质，能利用升华法直接中药材中提取出来。但天然药品成份普通可升华极少。,8,天然药物化学成分的提取方法,第8页,二、有效成份分离与精制,9,天然药物化学成分的提取方法,第9页,化学成份分离精制惯用方法原理,依据物质溶解度差异进行分离,依据物质在两相溶剂中分配比不一样进行分离,依据物质吸附性差异进行分离,依据物质分子大小差异进行分离,10,天然药物化学成分的提取方法,第10页,依据物质溶解度差异进行分离,1,、利用温度不一样引发溶解度改变,2,、改变混合溶剂极性,3,、调整溶液,pH,值，改变分子存在状态,4,、沉淀法,5,、盐析法,11,天然药物化学成分的提取方法,第11页,1,、利用温度不一样引发溶解度改变,判定中草药化学成份，研究其化学结构，必须首先将中草药成份制备成单体纯品。中草药化学成份在常温下多半是固体物质，常含有结晶性通性，能够依据溶解度不一样用结晶法来到达分离精制目标。,中草药化学成份，一旦取得结晶，就能有效地深入精制成为单体纯品。纯化合物结晶有一定熔点和结晶学特征，有利于判定。所以，求得结晶并制备成单体纯品，就成为判定中草药成份、研究其分子结构主要一步。,12,天然药物化学成分的提取方法,第12页,1,、利用温度不一样引发溶解度改变,结晶法是选取适当溶剂，将混合物加热溶解，形成有效成份饱和溶液，趁热过滤除去不溶杂质，滤液低温放置或蒸去部分溶剂后再低温放置，使有效成份大部分析出结晶，因为初析出结晶总会带一些杂质，所以需要经过重复结晶即所谓重结晶方法，才能得到高纯度晶体。,13,天然药物化学成分的提取方法,第13页,杂质除去,结晶法所用样品必须是已经用其它方法提得比较纯时候才能采取此法精制。,结晶乃同类分子自相排列，假如杂质过多，则妨碍分子排列。假如粗提取部分纯度很差则极难得到结晶。,14,天然药物化学成分的提取方法,第14页,杂质除去,用溶剂溶出杂质，或只溶出所需要成份。,用少许活性炭等进行脱色处理，以除去有色杂质。,经过氧化铝、硅胶柱色谱处理（注意所需要成份也可能被吸附而损失）。,制备其晶态衍生物（如游离生物碱可制备各种生物碱盐类，羟基化合物可转变成乙酰化物，碳基化合物可制备成苯腙衍生物结晶）。,15,天然药物化学成分的提取方法,第15页,溶剂选择,适宜溶剂是在冷时对所需要成份溶解度较小，而热时溶解度较大。溶剂沸点亦不宜太高。普通惯用甲醇、丙酮、氯仿、乙醇、乙酸乙酯等。,有些化合物在普通溶剂中不易形成结晶，而在一些溶剂中则易于形成结晶。比如葛根素、逆没食子酸（,ellagicacid,）在冰醋酸中易形成结晶，大黄素）在吡啶中易于结晶，萱草毒素在,DMF,中易得到结晶，而穿心莲亚硫酸氢钠加成物在丙酮一水中较易得到结晶。又如蝙蝠葛碱通常为无定形粉未，但能和氯仿或乙醚形成为加成物结晶。,16,天然药物化学成分的提取方法,第16页,结晶溶液制备,制备结晶溶液为过饱和溶液。普通是应用适量溶剂在加温情况下，将化合物溶解再放置冷处。假如在室温中能够析出结晶，就不一定放置于冰箱中，以免伴随结晶析出更多杂质。,无定形粉未状物质，远较晶体物质溶解度大，易于形成过饱和溶液。普通经过精制化合物，在蒸去溶剂抽松为无定形粉未，加入少许溶剂，往往马上能够溶解，稍稍放置即能析出结晶。比如长春花总弱碱部分抽松后加入,1.5,倍量甲醇溶解，放置后很快析出长春碱结晶。又如蝙蝠葛碱在乙醚中极难溶解，但当其盐水溶液用氨液碱化，并马上用乙醚萃取，所得乙醚溶液，放置后即可析出蝙蝠葛碱乙醚加成物结晶。,17,天然药物化学成分的提取方法,第17页,结晶溶液制备,制备结晶溶液，除用单一溶剂外，也常采取混合溶剂。普通是先将化合物溶于易溶溶剂中，再在室温下滴加适量难溶溶剂，直至溶液微呈浑浊，并将此溶液微微加温，使溶液完全澄清后放置。,一细辛醚重结晶时，可先溶于乙醇，再滴加适量水，即可析出很好结晶。,虎杖中提取水溶性虎杖甙时，在已精制饱和水溶液上添加一层乙醚放置，现有利于溶出其共存脂溶性杂质，又可降低水极性，促使虎杖甙结晶化。,18,天然药物化学成分的提取方法,第18页,(4),结晶纯度判定,结晶纯度可由化合物晶形、色泽、熔点和熔距、薄层色谱或纸色谱等作初步判定。,一个单体纯化合物普通都有一定熔点和较小熔距，同时在薄层色谱或纸色谱中经数种不一样展开剂系统检定，也为一个斑点者，普通能够认为是一个单体化合物19,天然药物化学成分的提取方法,第19页,结晶纯度判定,注意，有化合物在普通层析条件下，即使只展现一个斑点，但并不一定是单体成份。比如鹿含草中主成份为高熊果甙、异高熊果甙极难用普通方法分离，经重复结晶后，在纸层及聚酞胺薄层上都只有一个斑点，易误认为单一成份，但测其熔点在,115,125,，熔距很长。经制备其甲醚后，再经纸层层析检定，能够出现两个斑点，异高熊果甙比移值大于高熊果甙。,HPLC,是近年来能够用作判断有效成份纯度一个主要伎俩。,另外，,GC,、,UV,光谱等，都有利于检识结晶样品纯度。,20,天然药物化学成分的提取方法,第20页,单晶结构测定,单晶,X,射线衍射,单晶,X,射线分析是提供晶态下分子三维结构，确定分子立体结构（构型、构象等）最有效方法。,21,天然药物化学成分的提取方法,第21页,2,、改变混合溶剂极性,在溶液中加入另一个溶剂以改变混合溶剂极性，使一部分物质沉淀析出，从而实现分离。,在药材浓缩水提取液中加入数倍量高浓度乙醇，以沉淀除去多糖、蛋白质等水溶性杂质（水,/,醇法）；,在浓缩乙醇提取液中加入数倍两量水稀释，放置以沉淀除去 树脂、叶绿素等水不溶性杂质（醇,/,水法）；,在乙醇浓缩液中加数倍两乙醚（醇,/,醚法）或丙酮（醇,/,丙酮法），可使皂苷沉淀析出，而脂溶性树脂等类杂质则留在母液中。,22,天然药物化学成分的提取方法,第22页,3,、加酸碱调整溶液,pH,值,对酸性、碱性或两性有机化合物来说，常可经过加入酸、碱以调整溶液,pH,值，改变分子存在状态（游离型或解离型），从而改变溶解度而实现分离。,内酯类化合物不溶于水，但遇碱开环生成羧酸盐溶于水，再加酸酸化，又重新形成内酯环从溶液中析出，从而与其它杂质分离（碱,/,酸法）；,生物碱普通不溶于水，遇酸生成生物碱盐而溶于水，再加碱碱化，又重新生成游离生物碱（酸,/,碱法）。这些化合物能够利用与水不相混溶有机溶剂进行萃取分离。,能够分为强酸性、弱酸性和酚性三种，它们分别溶于碳酸氢钠、碳酸钠和氢氧化钠，借此可进行分离。,23,天然药物化学成分的提取方法,第23页,4,、沉淀法,在中草药提取液中加入一些试剂使产生沉淀，以取得有效成份或除去杂质方法。,铅盐沉淀法,试剂沉淀法,24,天然药物化学成分的提取方法,第24页,铅盐沉淀法,铅盐沉淀法为分离一些中草药成份经典方法之一。,醋酸铅及碱式醋酸铅，能与各种化学成份生成难溶铅盐或络盐沉淀，故可利用这种性质使有效成份与杂质分离。,中性醋酸铅可与酸性物质或一些酚性物质结合成不溶性铅盐。所以，惯用以沉淀有机酸、氨基酸、蛋白质、粘液质、鞣质、树脂、酸性皂甙、部分黄酮等。,与碱式醋酸铅产生不溶性铅盐或络合物范围更广。,25,天然药物化学成分的提取方法,第25页,试剂沉淀法,在生物碱盐溶液中，加入一些生物碱沉淀试剂（见生物碱性质下），则生物碱生成不溶性复盐而析出。水溶性生物碱难以用萃取法提取分出，常加入雷氏铵盐使生成生物碱雷氏盐沉淀析出,用明胶、蛋白溶液沉淀鞣质；胆甾醇也惯用以沉淀洋地黄皂甙等。,26,天然药物化学成分的提取方法,第26页,5,、盐析法,盐析法是在中草药水提液中、加入无机盐至一定浓度，或到达饱和状态，可使一些成份在水中溶解度降低沉淀析出，而与水溶性大杂质分离。,盐析用无机盐有氯化钠、硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵等。,三七水提取液中加硫酸镁至饱和状态，三七皂甙乙即可沉淀析出，自黄藤中提取掌叶防己碱，自三颗针中提取小檗碱在生产上都是用氯化钠或硫酸铵盐析制备。有些成份如原白头翁素、麻黄碱、苦参碱等水溶性较大，在提取时，亦往往先在水提取液中加入一定量食盐，再用有机溶剂萃取。,27,天然药物化学成分的提取方法,第27页,依据物质在两相溶剂中分配比不一样进行分离,分配系数（,K,）,两种相互不能任意混溶溶剂（如氯仿与水）如置分液漏斗中充分振摇，放置后即可分成两相。此时假如其中含有溶质，则溶质在两相溶剂中分配比（,K,）在一定温度及压力下为一常数，能够下式表示：,K=C,U,/C,L,K,：分配系数；,C,U,：溶质在上相溶剂中浓度；,C,L,：溶质在下相溶剂中浓度。,28,天然药物化学成分的提取方法,第28页,依据物质在两相溶剂中分配比不一样进行分离,1,、液,-,液萃取法,2,、逆流连续萃取法,3,、逆流分配法（,CounterCurrent Distribution,，,CCD,）,4,、液滴逆流色谱法（,DCCC,）,5,、高速逆流色谱法（,HSCCC,）,6,、气液分配色谱（,GC,或,GLC,）,7,、液,-,液分配色谱（,LC,或,LLC,）,29,天然药物化学成分的提取方法,第29页,1,、液,-,液萃取法,利用混合物中各成份在两种互不相溶溶剂中分配系数不一样而到达分离方法。,萃取时假如各成份分配系数相差越大，分离效率越高。,水提取液中有效成份是亲脂性物质，普通多用亲脂性有机溶剂，如苯、氯仿或乙醚进行两相萃取；有效成份是偏于亲水性物质，需用弱亲脂性溶剂，比如乙酸乙酯、丁醇等。,提取黄酮类成份多用乙酸乙脂和水两相萃取。提取亲水性强皂甙则多项选择取正丁醇、异戊醇和水作两相萃取。,30,天然药物化学成分的提取方法,第30页,液,-,液萃取法操作注意事项,先用小试管猛烈振摇约,1,分钟，观察萃取后二液层分层现象。假如轻易产生乳化，大量提取时要防止猛烈振摇，可延长萃取时间。如碰到乳化现象，可将乳化层分出，再用新溶剂萃取；或将乳化层抽滤，或将乳化层稍稍加热；或较长时间放置并不时旋转，令其自然分层。乳化现象较严重时，能够采取二相溶剂逆流连续萃取装置。,水提取液浓度最好在比重,1.1,1.2,之间，过稀则溶剂用量太大，影响操作。,31,天然药物化学成分的提取方法,第31页,2,、高速逆流色谱,(High-speed Countercurrent Chromatography,，,HSCCC),大多数色谱法都需要有固相载体某种形式选择性吸附作用。在应用固相载体色谱分离中，往往会存在不一样程度不可逆吸附，造成被分离样品损失，尤其在分离微量样品时受到限制。,高速逆流色谱，是近十年快速发展起来新型液,液分配色谱技术。与其它液相色谱分离方法相比它不使用固相载体作固定相，被分离物质在互不相溶两相分配分离，克服了固相载体带来样品吸附、损失、污染、峰形拖尾等缺点。且花费溶剂少，分辨率高，可进行纯品制备。利用,HSCCC,，中草药粗提物分离纯化制备可同时完成，被分离物可定量回收。,32,天然药物化学成分的提取方法,第32页,HSCCC,工作原理,两种互不相溶溶剂在聚四氟乙烯管内作高速行星运转，其中一相溶剂作固定相，用恒流泵输送载有样品另一相溶剂穿过固定相，两相溶剂在螺旋管中实现高效接触、混合、分配和传递。因为样品中各组分在两相中分配能力不一样，造成在聚四氟乙烯管中移动速度也不一样，从而使样品中各组分得到分离。,33,天然药物化学成分的提取方法,第33页,HSCCC,特点,1、应用范围广，适应性好,因为溶剂系统组成与配比能够是无限多，因而,HSCCC,适合用于任何极性范围品分离，,尤其适合用于分离极性大组分以及一些生物大分子,。,2、操作简便，轻易掌握,对样品预处理要求低，普通粗提物即可进行,HSCCC,制备分离或分析。,34,天然药物化学成分的提取方法,第34页,HSCCC,特点,3,、回收率高,固定相为液体，无需固体作载体，克服气、液相色谱使用固相载体带来样品吸附、损失、污染、峰形拖尾等缺点。,4、重现性好,分离过程稳定、峰保留相对标准偏差小于2，,35,天然药物化学成分的提取方法,第35页,HSCCC,特点,5、分离效率高，分离量较大,与普通色谱分离方式不一样，能实现梯度操作和反相操作、亦能进行重复进样，尤其适合用于制备性分离，产品纯度高，制备量大，溶剂消耗少。,较大制备型,HSCCC,，柱容积可达,530ml,，一次最多进样可达,20g,粗品；较小分析型,HSCCC,柱容积为,8mL,，进样量为几十微克，最大转速可达,4000r,min.,所以，被广泛地应用于植物化学成份分离制备研究。,36,天然药物化学成分的提取方法,第36页,HSCCC,特点,依据以上特点，,HSCCC,适合于中药成份分离和分析。当前高速逆流色谱仪已成功地开发出,分析型,和,制备型,两大系列。制备或半制备,HSCCC,特点是高流速、高浓度，不但,适合用于非极性化合物分离，也适合用于极性化合物分离,。在制备分离方面，,可用于中药粗提物中各组分分离,，也可深入精制，甚至直接从从粗提物,步纯化到纯品，来,制备中药化学成份标准品,。,37,天然药物化学成分的提取方法,第37页,HSCCC,应用,HSCCC,分离效率与气相色谱和高效液相色谱等技术相比较，前者不宜用它完成组成复杂混合物全谱分离分析。而其对于样品预处理条件较放松及回收率高，制备量大，尤其适合用于特定部位和特定组分分离纯化与制备。,38,天然药物化学成分的提取方法,第38页,HSCCC,应用,制备,中药化学对照品,中草药化学对照品应含有高度均匀性，量值准确性和良好稳定性，其纯度要求很高。制备型,HPLC,曾是国外惯用主要伎俩。不过其设备和载体填料价格很高对样品前期处理要求严格，存在不可逆吸附，溶剂用量大缺点。所以致力于,HSCCC,分离、统化、制备中草药有效成份对照品研究和产业化，含有现实意义。,从银杏叶中制备异鼠李素、山奈酚、槲皮索、白果内酯和橙皮甙；从大黄制备大黄羟基蒽醌甙元；从洋地黄叶中制备洋地黄毒甙；从虎杖中分离提纯白藜芦醇和白藜芦醇甙等。,39,天然药物化学成分的提取方法,第39页,3,、高效液相色谱,(,HPLC),HPLC,是在经典液相色谱基础上引入气相色谱塔板理论，并采取了高压输液泵、高效固定相和高灵敏度检测器，含有分析速度快、分离效率高和操作自动化特点一个色谱技术。,HPLC,尤其适合高沸点、大分子和热稳定性差化合物分离分析。,中药成份非常复杂，以往惯用薄层色谱等方法因其精密度、准确度、灵敏度、重现性差而不能满足中药当代化发展需要。高效液相色谱正是以其稳定、可靠、高效特点成为中药研究最主要分析方法。,惯用于中药质量控制、天然药品化学成份分离及分析测定等。,40,天然药物化学成分的提取方法,第40页,3,、高效液相色谱,(,HPLC),检测器是液相色谱三大关键部件（高压输液泵、高效色谱柱和检测器）之一。其发展在某种意义上决定着,HPLC,技术进步。理想检测器应含有以下特点：,灵敏度高；,对温度改变和流量波动不敏感；,死体积小，不使峰额外地扩展；,对溶剂无响应，能用于梯度洗脱操作,线性范围宽；,对全部样品都有响应；,对样品无破坏性。,41,天然药物化学成分的提取方法,第41页,3,、高效液相色谱,(,HPLC),检测器种类繁多，至今还没有一个检测器能够同时满足以上几点要求。有紫外,可见分光检测器、荧光检测器、示差折光检测器、电化学检测器、二极管阵列检测器、测定大分子绝对分子量多角度激光光散射仪。另外还有蒸发光检测器、化学发光检测器、手性检测器,(,旋光检测器、圆二色检测器,),、分子量检测器、放射性检测器、热学性质检测器、光电导检测器、磁旋光检测器等。,42,天然药物化学成分的提取方法,第42页,惯用,HPLC,检测器,紫外,-,可见分光检测器,示差折光检测器,二极管阵列检测器,蒸发光检测器,43,天然药物化学成分的提取方法,第43页,紫外检测器（,UVD）,优点,UVD,结构简单，使用方便，售价廉价、高灵敏度和稳定性。,不足,UVD,检测物质必须含有吸收紫外光生色团，而对应流动相在检测波长下则应该是无紫外吸收。这一特征大大限制了其能检测物质范围和一些良好溶剂使用。,许多成份没有紫外吸收或为紫外末端吸收，有时可用低波长紫外检测器，但梯度洗脱时出现基线漂移，溶剂峰干扰，溶剂选择受其截止波长限制。,44,天然药物化学成分的提取方法,第44页,示差折光检测器(,RID),RID,是一个通用检测器，它基于色谱柱流出物光折射率改变来连续测定样品浓度。,特点,稳定、易于操作，样品不被破坏和含有很好灵敏度。,缺点,对工作环境要求很苛刻，要求恒温、恒流速，且无法采取梯度洗脱其检测灵敏度也不够高。,45,天然药物化学成分的提取方法,第45页,光电二极管阵列检测器(,DAD),原理,光源经光学反射镜经过流动池，再经分光系统、狭缝照射到一组光电二极管上，由数据搜集系统实时统计下组分光谱吸收，得到三维立体谱图。,用一组光电二极管同时检测透过样品全部波长紫外光，而不是某一个或几个波长，和普通紫外,可见分光检测器不一样是进入流动池光不再是单色光。它含有以下优点：,可得任意波长色谱图，极为方便；,可得任意时间光谱图，相当于与紫外联用；,提供组分定性信息。,46,天然药物化学成分的提取方法,第46页,蒸发光检测器（,ELSD）,ESLD,是质量型、高灵敏度通用液相色谱检测器。它检测三个主要过程：,雾化,色谱柱流出物经过针头式细导管进入雾化器，与气体混合喷成均匀一致雾滴；,蒸发,雾滴经过加热漂移管，流动相被蒸发，溶质形成极细颗粒；,检测,溶质颗粒气体在检测池发生散射作用，经光电倍增管成电信号输出。,47,天然药物化学成分的提取方法,第47页,ESLD,优点,适用范围广,标准上对全部化合物都能测定，不论化合物是否存在生色团或电活性基团。,适合用于梯度洗脱,流动相在样品检测前挥去；,高灵敏度,与示差检测器,(,RI),及低波长紫外检测相比。,因为它这些优点，它有可能像气相色谱中氢火焰检测器,(FID),那样成为液相色谱高灵敏度通用检测器。,48,天然药物化学成分的提取方法,第48页,ESLD,应用,没有紫外吸收或为紫外末端弱吸收样品,ELSD,响应与被测物质量成正比，而不依赖于被测物光学特征及官能团。理论上可用于挥发性低于流动相任何组分检测。,在天然药品化学成份中常见有糖类、皂甙类（皂甙无紫外吸收或仅为末端吸收，使得皂甙测定在应用,HPLC-UV,法及选择流动相优化分离时均存在一定困难。,ELSD,检测则很好地处理了这个问题。从当前国内文件报道来看，,ELSD,应用亦以分析这类成份及甾类等最多。,流动相有紫外吸收干扰或梯度洗脱时基线漂移影响测定情况,用,ELSD,检测，流动相在漂移管便气化蒸发，不影响样品检测。,49,天然药物化学成分的提取方法,第49页,高效液相色谱应用,中药化学成份分析,成份分离制备,(1),尤其适合用于极性较大成份,(,如皂苷类,),分离；,(2),先以分析色谱探索分离条件；,(3),样品一定要用流动相溶解，再以滤膜过滤。,50,天然药物化学成分的提取方法,第50页,依据物质吸附性差异进行分离,在天然有机化合物分离及精制工作中，吸附现象利用得十分广泛。其中又以固,-,液吸附用得最多，其分：,物理吸附,(,表面吸附，,physical adsorption),：以,硅胶、氧化铝及活性炭为吸附剂,化学吸附（,chemical adsorption,）,半化学吸附（,semichemical adsorption,）：聚酰胺层析,51,天然药物化学成分的提取方法,第51页,1,、物理吸附,液,-,固物理吸附色谱是利用较多一个方法，尤其适合用于很多中等分子量样品（分子量小于,1,，,000,低挥发性样品）分离，尤其是脂溶性成份。普通不适合用于高分子量样品如蛋白质、多糖或离子型亲水性化合物等分离。,吸附层析分离效果，决定于吸附剂、溶剂和被分离化合物性质这三个原因。,52,天然药物化学成分的提取方法,第52页,吸附剂,硅胶,氧化铝,活性炭,53,天然药物化学成分的提取方法,第53页,硅胶,层析用硅胶为一多孔性物质，分子中含有硅氧烷交链结构，同时在颗粒表面又有很多硅醇基。硅胶吸附作用强弱与硅醇基含量多少相关。硅醇基能够经过氢键形成而吸附水分，所以硅胶吸附力随吸着水分增加而降低。,硅胶是一个酸性吸附剂，适合用于中性或酸性成份层析。同时硅胶又是一个弱酸性阳离子交换剂，其表面上硅醇基能释放弱酸性氢离子，当碰到较强碱性化合物，则可因离子交换反应而吸附碱性化合物。,54,天然药物化学成分的提取方法,第54页,氧化铝,氧化铝带有碱性，对于分离一些碱性中草药成份，如生物碱类分离颇为理想。不过氧化铝不宜用于醛、酮、酸、内酯等类型化合物分离。因为碱性氧化铝可与上述成份发生次级反应，如异构化、氧化、消除反应等。,用稀硝酸或稀盐酸处理氧化铝，不但可中和氧化铝中含有碱性杂质，并可使氧化铝颗粒表面带有,NO,3,-,或,Cl,-,阴离子，从而含有离于交换剂性质，适合于酸性成份层析，这种氧化铝称为酸性氧化铝。,55,天然药物化学成分的提取方法,第55页,活性炭是一个非极性吸附剂。,活性炭主要用于分离水溶性成份，如氨基酸、糖类及一些甙。活性炭为吸附作用，在水溶液中最强，在有机溶剂中则较低弱。故水洗脱能力最弱，而有机溶剂则较强。比如以醇,-,水进行洗脱时，则随乙醇浓度递增而洗脱力增加。,活性炭对芳香族化合物吸附力大于脂肪族化合物，对大分子化合物吸附,力大于小分子化合物。利用这些吸附性差异，可将水溶性芳香族物质与脂肪族物质分开，单糖与多糖分开，氨基酸与多肽分开。,56,天然药物化学成分的提取方法,第56页,吸附剂特点,硅胶和氧化铝为极性吸附剂，有以下特点：,对极性物质含有较强亲和能力。故同为溶质，极性强者将被优先吸附。,溶剂极性越弱，则吸附剂对溶质将表现出越强吸附能力。溶剂极性增强，则吸附剂对溶质吸附能力即随之减弱。,溶质即使被硅胶、氧化铝吸附，但一旦加入极性较强溶剂时，又可被后者置换洗脱下来。,57,天然药物化学成分的提取方法,第57页,吸附剂特点,活性炭因为是非极性吸附剂，故与硅胶、氧化铝相反，对非极性物质含有较强亲和能力，在水中对该类物质表现出强吸附能力。,溶剂极性降低，则活性炭对该类物质吸附能力也随之降低。故从活性炭上洗脱被吸附物质时，洗脱溶剂洗脱能力将随溶剂极性减弱而增强,。,58,天然药物化学成分的提取方法,第58页,溶剂,洗脱剂选择，须依据被分离物质与所选取吸附剂性质这二者结合起来加以考虑。在用极性吸附剂进行层析时，当被分离物质为弱极性物质，普通选取弱极性溶剂为洗脱剂；被分离物质为强极性成份，则须选取极性溶剂为洗脱剂。假如对某一极性物质用吸附性较弱吸附剂（如以硅藻土或滑石粉代替硅胶），则洗脱剂极性亦须对应降低。,59,天然药物化学成分的提取方法,第59页,被分离物质性质,被分离物质与吸附剂，洗脱剂共同组成吸附层析中三个要素，彼此紧密相连。在指定吸附剂与洗脱剂条件下，各个成份分离情况，直接与被分离物质结构与性质相关。对极性吸附剂而言，成份极性大，吸附性强。,60,天然药物化学成分的提取方法,第60页,化合物极性及其强弱判断,官能团极性强弱,化合物极性则由分子中所含官能团种类、数目及排列方式等综合原因所决定。,61,天然药物化学成分的提取方法,第61页,官能团极性强弱,官能团,极性,R-COOH,大,Ar-OH,R-OH,R-NH,2,R-NH-R,R-N-R,2,R-CO-NR,2,R-CHO,R-CO-R,R-CO-OR,R-O-R,小,62,天然药物化学成分的提取方法,第62页,化合物极性,化合物极性则由分子中所含官能团种类、数目及排列方式等综合原因所决定。,极性基团数目愈多，化合物极性越大，被吸附性能就会更大些，在同系物中碳原子数目少些，被吸附也会强些。总之，只要两个成份在结构上存在差异，就有可能分离，关键在于条件选择。,63,天然药物化学成分的提取方法,第63页,化合物极性,被分离物质极性很小为不含氧萜烯，或虽含氧但非极性基团，则需选取吸附性较强吸附剂，并用弱极性溶剂如石油醚或苯进行洗脱。但多数中药成份极性较大，则需要选择吸附性能较弱吸附剂（普通,级）。,采取洗脱剂极性应由小到大梯度递增，或可应用薄层层析以判断被分离物在某种溶剂系统中分离情况。另外，能否取得满意分离，还与选择溶剂梯度有很大关系。,多组分混合物，象植物油脂系由烷烃、烯烃、甾醇酯类、甘油三酸醋和脂肪酸等组份。当以硅胶为吸附剂时，使油脂被吸附后选取一系列混合溶剂进行洗脱，油脂中各单一成份即可按其极性大小不一样依次被洗脱。,64,天然药物化学成分的提取方法,第64页,2,、吸附簿层色谱,薄层层析是一个简便、快速、微量层析方法。普通将吸附剂撒布到平面如玻璃片上，形成一薄层进行层析时，即称薄层层析。,针对一些性质特殊化合物分离与检出，有时需采取一些特殊薄层。,65,天然药物化学成分的提取方法,第65页,特殊薄层,荧光薄层,络合薄层,酸碱薄层和,PH,缓冲薄层,66,天然药物化学成分的提取方法,第66页,荧光薄层,有些化合物本身无色，在紫外灯下也不显荧光，又无适当显色剂时，则可在吸附剂中加入荧光物质制成荧光薄层进行层析。展层后置于紫外光下照射，薄层板本身显荧光，而样品斑点处不显荧光，即可检出样品层析位置。,惯用荧光物质多为无机物。其一是在,254nm,紫外光激发下显出荧光，如锰激化硅酸锌。另一个为在,365nm,紫外光激发下发出荧光，如银激化硫化锌、硫化镐。,67,天然药物化学成分的提取方法,第67页,络合薄层,惯用有硝酸银薄层，用来分离碳原子数相等而其中,C,一,C,双键数目不等一系列化合物，如不饱和醇、酸等。其主要机理是因为,C-C,键能与硝酸银形成络合物，而饱和,C-C,键则不与硝酸银络合。所以在硝酸银薄层上，化合物可因为饱和程度不一样而取得分离。层析时饱和化合物因为吸附最弱而,Rf,最高，含一个双键较含两个双键,Rf,值高，含一个三键较含一个双键,Rf,值高。,在一个双键化合物中，顺式与硝酸银络合较反式易于进行。所以，还可用来分离顺反异构体。,68,天然药物化学成分的提取方法,第68页,酸碱薄层和,pH,缓冲薄层,为了改变吸附剂原来酸碱性，可在铺制薄层时采取稀酸或稀碱以代替水调制薄层。比如硅胶带微酸性，有时对碱性物质如生物碱分离不好，如不能展层或拖尾，则可在铺薄层时，用稀碱溶液,0.1,0,5NNa0H,溶液制成碱性硅胶薄层。比如猪屎豆碱在以硅胶为吸附剂时，以氯仿,-,丙酮,-,甲醇（,821,）为展开剂,Rf,0.1,，采取碱性硅胶薄层用上述相同展开剂，,Rf,值增至,0.4,左右。说明猪屎豆碱为,-,碱性生物碱。,69,天然药物化学成分的提取方法,第69页,薄层层析法应用,化学成份预试,化学成份判定,探索柱层分离条件,70,天然药物化学成分的提取方法,第70页,化学成份预试,用薄层层析法进行中草药化学成份预试，可依据各类成份性质及熟知条件，有针对性地进行。因为在薄层上展层后，可将一些杂质分离，选择性高，可使预试结果更为可靠。,71,天然药物化学成分的提取方法,第71页,化学成份判定,以薄层层析法进中草药化学成份判定，最好要有标准样品进行共薄层层析。如用数种溶剂展层后，标准品和判定品,Rf,值、斑点形状颜色都完全相同，则可作初步结论是同一化合物。但普通需进行化学反应或红外光谱等一个仪器分析方法加以查对。,72,天然药物化学成分的提取方法,第72页,探索柱层分离条件,在进行柱层分离时，首先考虑选取何种吸附剂与洗脱剂。在洗脱过程中各个成份将按何种次序被洗脱，每一洗脱液中是否为单一成份或混合体，均可由薄层分离得到判断与检验。经过薄层预分离，还能够了解多组分样品组成与相对含量。如在薄层上探索到比较满意分离条件，即可将此条件用于干柱层析。,73,天然药物化学成分的提取方法,第73页,3,、制备薄层色谱（,PTLC,）,一个是流动相靠毛细管作用力流经固定相（传统制备型薄层薄层色谱），另一些方法是流动相靠外力强制流动，如离心薄层色谱和加压薄层色谱。,74,天然药物化学成分的提取方法,第74页,3,、制备薄层色谱（,PTLC,）,吸附剂,硅胶是最惯用吸附剂。上样量与吸附剂厚度相关。,上样,上样是进行,PTLC,分离一个最关键步骤。上样前先用样品溶于少许溶剂，低挥发性溶剂可引发点样带变宽，所以最好选取挥发性溶剂（如己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯等）。样品浓度应在,5%-10%,左右。点样带应尽可能狭窄，以取得更加好分离效果。点样可用手工进行或自动点样仪。,展开剂选择及展开,在进行,PTLC,之前应用分析型,TLC,预试验来确定展开剂。,被分离物质回收,75,天然药物化学成分的提取方法,第75页,3,、吸附柱色谱（柱层析）,吸附剂用量,普通为样品量,30,60,倍。样品极性较小、难以分离者，吸附剂用量可适当提升到样品量,100,200,倍。据此可选择适当规格色谱管，试验室中惯用色谱管规格以下所表示，其高度与直径比（,h/d,）约为（,151,）（,20,：,1,）。,柱色谱用硅胶及氧化铝通常以,100,200,目或,200,300,目为宜，或甚至直接采取薄层色谱用规格，其分离效果能够大大提升。,76,天然药物化学成分的提取方法,第76页,4,、吸附柱色谱,洗脱剂选择，以,TLC,探索洗脱条件,装柱，湿法装柱（以起始洗脱剂拌匀装柱）或干法装柱,77,天然药物化学成分的提取方法,第77页,4,、吸附柱色谱,（,3,）样品预处理,能直接溶于洗脱剂样品用适量洗脱剂溶解样品，尽可能少，以利样品在吸附剂柱上形成狭窄原始谱带。,不能溶解于洗脱剂样品，则将用能使之溶解溶剂溶解后，再用少许吸附剂拌匀，并减压抽干溶剂或在,60,下加热挥尽溶剂，置真空干燥器中减压干燥或直接减压抽干、研粉后再小心铺在吸附剂柱上。,78,天然药物化学成分的提取方法,第78页,4,、吸附柱色谱,（,4,）洗脱用溶剂极性宜逐步增加，跳跃不能太大。,实践中多用混合溶剂，并经过巧妙调整百分比以改变极性，到达梯度洗脱分离物质目标。普通混合溶剂中强极性溶剂影响比较突出，故不可随意将极性差异很大两种溶剂组合在一起使用。试验室中最常应用混合溶剂组合以下：,79,天然药物化学成分的提取方法,第79页,吸附柱色谱惯用混合洗脱溶剂,己烷,-,苯,极,苯,-,乙醚,苯,-,乙酸乙酯,性,氯仿,-,乙醚,氯仿,-,乙酸乙酯,递,氯仿,-,甲醇,丙酮,-,水,增,甲醇,-,水,80,天然药物化学成分的提取方法,第80页,4吸附柱色谱,（,5,）为防止发生化学吸附，酸性物质宜用硅胶、碱性物质则宜用氧化铝进行分离。,硅胶、氧化铝用适当方法处理成中性时，情况会有所缓解。通常在分离酸性（或碱性）物质时，洗脱溶剂中分别加入适量醋酸（或氨、吡啶、二乙胺），常可收到预防拖尾、促进分离效果。,81,天然药物化学成分的提取方法,第81页,5,、聚酰胺吸附色谱法,聚酰胺（,poliamide,）吸从属于氢键吸附，是一个用途十分广泛分离方法，极性物质与非极性物质均可适用，但尤其适合分离酚类、醌类、黄酮类化合物。,82,天然药物化学成分的提取方法,第82页,（,1,）聚酰胺吸附原理,系经过分子中酰胺羰基与酚类、黄酮类化合物酚羟基，或酰胺键上游离胺基与醌类、脂肪羧酸上羰基形成氢键缔合而产生吸附。至于吸附强弱则取决于各种化合物与之形成氢键能力。,83,天然药物化学成分的提取方法,第83页,聚酰胺吸附原理,在含水溶剂中大致有以下规律：,形成氢键基团数目越多，则吸附能力越强。,成键位置对吸附力也有影响。易形成份子内氢键者，其在聚酰胺上吸附即对应减弱。,分子中芳香化程度高者，则吸附性增强；反之，则减弱。,84,天然药物化学成分的提取方法,第84页,聚酰胺吸附原理,吸附因为是在溶液中进行，故溶剂也会参加吸附剂表面争夺，或经过改变聚酰胺对溶质氢键结合能力而影响吸附过程。,聚酰胺与酚类或醌类等化合物形成氢键缔合能力在水中最强，在含水醇中则随醇浓度增高而对应减弱，在高浓度醇或其它有机溶剂中则几乎不缔合。故在聚酰胺柱色谱分离时，通惯用水装柱，样品也尽可能作成水溶液上柱以利聚酰胺对溶质充分吸附，随即用不一样浓度含水醇洗脱，并不停提升醇浓度，逐步增强从柱上洗脱物质能力。,85,天然药物化学成分的提取方法,第85页,聚酰胺吸附原理,甲酰胺、二甲基甲酰胺及尿素水溶液因分子中都有酰胺基，作为第三者能够同时与聚酰胺及酚类等化合物形成氢键缔合，故有很强洗脱能力。另外，水溶液中加入碱或酸均可破坏聚酰胺与溶质之间氢键缔合，也有较强洗脱能力，可用于聚酰胺精制及再生处理。惯用聚酰胺再生剂有,10%,醋酸、,3%,氨水及,5%,氢氧化钠水溶液等。,86,天然药物化学成分的提取方法,第86页,聚酰胺吸附原理,各种溶剂在聚酰胺柱上洗脱能力由弱至强，可大致排列成以下次序：,水,甲醇,丙酮,氢氧化钠水溶液,甲酰胺,二甲基甲酰胺,尿素水溶液,87,天然药物化学成分的提取方法,第87页,聚酰胺色谱应用,聚酰胺对普通酚类、黄酮类化合物吸附是可逆（鞣质除外），分离效果好，加以吸附容量又大，故聚酰胺色谱尤其适合于该类化合物制备分离。,对生物碱、萜类、甾体、糖类、氨基酸等其它极性与非极性化合物分离也有广泛用途。,因为对鞣质吸附特强，近乎不可逆，故用于植物粗提取物脱鞣质处理尤其适宜。,聚酰胺色谱也有薄层色谱和柱色谱两种方式。,88,天然药物化学成分的提取方法,