脂质体的制备方法.pdf

脂质体的制备方法第一页，共101页。本节要求 1.脂质体的基本概念 2.脂质体的组成与结构、与胶团的区别 3.脂质体的剂型特点和体内作用特点 4.脂质体的制备方法、质量标准第二页，共101页。Main Contents脂质体I II in脂质体的应用概况脂质体的组成和结构特点 脂质体的剂型特点第三页，共101页。Microparticles drug delievey systems第四页，共101页。Drug Macromolecularconjugates第五页，共101页。脂质体88部脂质体(liposomes)是将药物包封于类脂质双分子层内形成的微型泡囊。第六页，共101页。I脂质体的应用概况 1971年英国莱门等人开始将脂质体用于药物载体。我国自80年代开始进行脂质体的研究工作第七页，共101页。抗癌药物脂质体 2000年，世界脂质体产品销售额为12亿美元。预测至2005年将达33亿美元，增长率为175%。国外已上市的脂质体药物品种有两性霉素、多柔比星和柔红霉素，均为抗癌药物。抗癌药物脂质体是 脂质体最重要的应用。目前还有约30种脂质体抗癌药 物正在临床试验或等待批准上市。第八页，共101页。脂质体抗癌药物产品及研究进展情况脂质体在主动靶向制剂中 的应用对脂质体来说，将靶向因子一脂质连接物插入含 药脂质体的外层脂质分子层中，是一种操作性 强的有效的靶向因子连接手段。第十页，共101页。Diagram of synthesize reaction between WGA and PE第十一页，共101页。Transmission electron photomicrograms of insulin liposomesaconventional liposomes,bWGA modified liposomes第十二页，共101页。脂质体在基因治疗中的应用 1987年Feigner等率先用脂质体作为基因转移载体。阳离子脂质体是应用最多的非病毒基因载体。它们 一般由带正电荷的脂类与中性脂类按一定的摩尔比组 成。阳离子脂质体并不是将DNA包裹在其脂质双分 子层中，而是若干阳离子脂质囊泡将DNA链夹 在其中，形成片层状结构。第十三页，共101页。HikmiNi脂质体基因转移示意图第十四页，共101页。工 n脂质体的组成和结构特点二脂质体的组成脂质体是由磷脂、胆固醇等为膜材包合而成。这两种成分是形成脂质体双分子层的基础物质，具有良好的 生物相容性。1.磷脂类 磷脂类包括卵磷脂、脑磷脂、大豆磷脂及合 成磷脂等都可以作为脂质体的双分子层物质基础。2.胆固醇 胆固醇与磷脂共同构成脂质体基础物质。第十五页，共101页。磷脂结构通式OH式中：Rl R2是疏水链，R由C12C18,可为饱和燃链 或不饱和煌链；X为亲水头，X不同，则磷脂命名不同第十六页，共101页。第十七页，共101页。第十八页，共101页。r 天然磷脂:胆碱+磷脂酸一磷脂酰胆碱(PC)，即卵磷脂 乙醇胺磷脂酸一磷脂酰乙醇胺(PE),即脑磷脂 丝氨酸+磷脂酸一磷脂酰丝氨酸(PS)合成磷脂：二棕楣酰-DL-a磷脂酰胆碱(DPPC)二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)等。第十九页，共101页。1胆固醇结构第二十页，共101页。卯璘脂的固醇荥油基团-亲油塞团-亲水基团亲水基团一李依盐型网离子部分-碎酸的型阴离子部分磷脂和胆固醇分子排列示意图第二十一页，共101页。磷脂和胆固醇分子排列 把类脂质的醇溶液倒入水面时，醇很快地溶解于水 而类脂分子则排列在空气一水的界面上 极性部分在水里，亲油的非极性部分则伸向空气中当极性类脂分子被水完全包围时极性基团面向两侧的水相，而非极性的燃链彼此面对面缔合成双分子层第二十二页，共101页。脂质体双分子层第二十三页，共101页。soluble monomerairmonolayer MUUU./a口即即即口即时而而即即bilayerliposomewater脂质体形成示意图第二十四页，共101页。图9磷脂在水相中的3种结构第二十五页，共101页。脂质体与其包封的药物第二十六页，共101页。脂质体半球剖面图第二十七页，共101页。f 结构特点脂质体结构与由表面活性剂构成的胶团不同，后者 是由单分子层组成，脂质体由双分子层组成。micelleliposomes bilayer第二十八页，共101页。MicellesLiposomes胶团与脂质体结构第二十九页，共101页。脂质体与胶团区别脂质体胶团组成磷脂和胆固醇表面活性剂结构双分子层单分子层中心区域水相，可容纳 亲水性药物疏水区，可容纳 疏水性药物第三十页，共101页。按结构1脂质体脂质体的类型r 单室脂质体(suvs)大单室脂质体(LUVs)多室脂质体(MLVs)I 大多孔脂质体(MVVs)第三H一页，共101页。单室脂质体(unilamellar vesicles,ULV)球径0.020.08pm为小单室脂质体(single unilamellar vesicles,SUV),O.Olpim为大单室脂质体(large unilamellar vesicles,LUV),水溶性药物的溶液只被一层类脂质双分子层所包封，脂溶 性药物则分散于双分子层中。凡经超声波分散的脂质体悬液，绝大部分为单室脂质体。第三十二页，共101页。多室脂质体(multilamellar vesicles,MLV)球径h5um,有几层脂质双分子层将包含的药物（水溶性药物）的水膜隔开，形成不均匀的聚合体,脂溶性药物则分散于几层分子层中。第三十三页，共101页。大多孔脂质体(AAultivesicular vesicles,AAVV)球径约Q13Q06um,单层状，比单室质体可多包封10倍的药物。第三十四页，共101页。MLVLUVo按结构MW第三十五页，共101页。Nonpolar phasecAqueous compartmentsLipid bilayersLIPSOME(UNILAMELLAR)LIPSOME(MULTILAMELLAR)单室和多室脂质体示意图第三十六页，共101页。脂质体电镜照片第三十七页，共101页。纳米脂质体呈蓝色乳光第三十八页，共101页。脂质体的类型脂质体Vr suvs一般脂质体WLUVs MLVsMVVs特殊性能脂质体热敏脂质体pH敏感脂质体Y 超声波敏感脂质体光敏脂质体1磁性脂质体第三十九页，共101页。脂质体的类型厂中性脂质体脂质体负电性脂质体正电性脂质体第四十页，共101页。三脂质体的理化性质（一）相变温度 脂质体膜的性质与介质温度关系密切。当温度升高时，磷脂 分子中酰基侧链从有序排列变成无序排列，从而引起膜性 质的变化:由胶晶态变成液晶态，膜的横切面增加，双分子层厚度减少，膜流动性增加,发生这种转变时的温度称为相变温度。每种磷脂有其特有的相变温度。第四十一页，共101页。三脂质体的理化性质膜的流动性是脂质体的重要性质，流动性与药物 释放密切相关。胆固醇被称为膜流动性调节剂，因为低于相变温度时，胆固醇的存在增加了膜的无序性，增加膜 的流动性;相变温度以上时，胆固醇减少膜酰基侧链的无序 性，减少膜的流动性。第四十二页，共101页。（二）脂质体的荷电性荷电磷脂制备的脂质体荷电。含磷脂酸（PA）和磷脂酰丝氨酸（PS）的脂质体荷负电,含碱基（胺基）磷脂的脂质体荷正电，不含离子的脂质体电中性。第四十三页，共101页。（二）脂质体的荷电性 阳离子脂质体作为药物的载体比传统脂质体有利，它与带负电的细胞表面有很强的亲合作用，有利于药物的被吸收。阳离子脂质体是应用素多的非病毒基因我体第四十四页，共101页。（二）脂质体的荷电性 某些阳离子脂质体能专一性靶向肺等器官的内皮细 胞。药物和阳离子脂质体相互作用时，不仅同样可包埋于 脂质体的囊泡内，此外也可由于阳离子脂质体表面的正电荷与带负电 荷的药物分子产生静电吸附作用，多肽类药物分子中的疏水结构可插入脂质体的脂双 层、形成稳定结构。第四十五页，共101页。m脂质体的剂型特点1脂质体具有生物相容性度水性加睇生物膜液态镶嵌模型第四十六页，共101页。m脂质体的剂型特点2.制备工艺简单，适宜工业大生产。m脂质体的剂型特点3同时装载水溶性和脂溶性药物第四十八页，共101页。III脂质体的剂型特点 4药物以非共价键结合的方式被包裹，有利于药物释放。5 脂质体的物理化学稳定性较差。第四十九页，共101页。IV脂质体的体内作用特点T.体内分布靶向性r 被动靶向主动靶向第五十页，共101页。脂质体主动靶向性脂质体易于连接靶向因子第五十一页，共101页。2.药物作用延效性许多药物在体内由于被迅速代谢或排泄而使其体 内作用时间短。将药物包封成脂质体，可减少肾排泄和代谢而延长药物在血液中的滞留时间，使药物在体内缓慢释放，从而延长药物的作用时间。第五十二页，共101页。3.生物相容性 因脂质体是类似生物膜结构的泡囊，具有很好的细胞亲和性与组织相容性。它可长时间吸附于靶细胞周围，使药物能充分向靶细 胞渗透。脂质体也可通过融合进入细胞内第五十三页，共101页。4.降低药物毒性药物被脂质体包封后，主要被单核一巨噬细胞 系统的巨噬细胞所吞噬而摄取，且在肝、脾 和骨髓等单核-巨噬细胞较丰富的器官中浓集,而使药物在心、肾中累积量比游离药物低得多O第五十四页，共101页。4.降低药物毒性如果将对心、肾有毒性的药物或对正常细胞有毒性的抗癌药物包封成脂质体，就可明显降低药物的毒性。两性霉素B对多数哺乳动物的毒性较大，制成两性霉素B脂质体，可使其毒性大大降低而不影响抗真菌活性。第五十五页，共101页。5.提高药物稳定性一些不稳定的药物被脂质体包封后可受到脂质体双层 膜的保护。如青霉素G或V的钾盐是对酸不稳定的抗生素，口服易被 胃酸破坏，制成脂质体则可减少胃酸对其的破坏，提高 口服的吸收效果。第五十六页，共101页。V脂质体的制备技术厂.注入法 薄膜分散法 超声波分散法 逆相蒸发法 A 冷冻干燥法第五十七页，共101页。1.注入法将磷脂与胆固醇等类脂质及脂溶性药物其溶于有机溶 剂中（一般多采用乙醛），然后将此药液经注射器缓缓注入加热至50C（并用磁力 搅拌）的磷酸盐缓冲液（或含有水溶性药物）中，加完后，不断搅拌至乙酸除尽为止,即制得大多孔脂质体，其粒径较大，不适宜静脉注射。再将脂质体混悬液通过高压乳匀机二次，则所得的成品。第五十八页，共101页。2.薄膜分散法将磷脂，胆固醇等类脂质及脂溶性药物溶于氯 仿（或其他有机溶剂中）然后将氯仿溶液在一 玻璃瓶中旋转蒸发，在瓶内壁上形成一薄膜；将水溶性药物溶于磷酸盐缓冲液中，加入烧瓶中 不断搅拌，即得脂质体。第五十九页，共101页。2.薄膜分散法 1多用于脂溶性药物脂质体的制备 2制备方法简单，脂溶性药物包封率较高 3多室脂质体，粒径较大，若需减小粒径，需经超声或高压乳匀处理第六十页，共101页。3.超声波分散法将水溶性药物溶于磷酸盐缓冲液磷脂，胆固醇与脂溶性药物共溶于有机溶剂的溶液,混合，搅拌，蒸发除去有机溶剂 残液以超声波处理，然后分离出脂质体再混悬于磷 酸盐缓冲液中，制成脂质体的混悬型注射剂。经超声波处理大多为单室脂质体第六H一页，共101页。4.逆相蒸发法 将水溶性药物溶于磷酸盐缓冲液磷脂，胆固醇与脂溶性药物共溶于有机溶剂的溶液,混合，超声处理直至形成稳定的W/O乳剂 减压蒸发除去有机溶剂 达到胶态后，加入磷酸盐缓冲液，旋转使器壁上凝胶脱 落，继续减压蒸发除去有机溶剂 脂质体水性混悬液第六十二页，共101页。4.逆相蒸发法混合第六十三页，共101页。4.逆相蒸发法第六十四页，共101页。有机溶剂4.逆相蒸发法蒸发第六十五页，共101页。有机溶剂4.逆相蒸发法磷酸”蒸发 缓：，第六十六页，共101页。4.逆相蒸发法第六十七页，共101页。4.逆相蒸发法 本法特点是包封的药物量大，体积包封率可大于超声波分散法30倍，适合于包封水溶性药物及大分子生物活性物质如各种抗 生素、胰岛素、免疫球蛋白、碱性磷脂酶、核酸等。第六十八页，共101页。5.冷冻干燥法脂质体亦可用冷冻干燥法制备，对遇热不稳定的 药物尤为适宜。先按上述方法制成脂质体悬液后 分装于小瓶中，冷冻干燥制成冻干燥制剂，惟全 部操作应在无条件菌条件下进行。第六十九页，共101页。5.冷冻干燥法 Payne用冷冻干燥法制备前体脂质体，它为一干燥且具有 良好流动性的颗粒，一旦加水水合，即可分散成等胀的多 层脂质体混悬液，适用于静脉给药或用于其它给药途径。另一方法为将脂质吸附于极细的水溶性载体，如粉末氯化钠、山梨醇或其它的聚合糖类，即可形成高度分散的前体脂质体。与水接触时，脂质溶胀而载体迅速溶解，脂质在 水相中形成脂质体。第七十页，共101页。V脂质体的质量评价 1大小与形态观察脂质体的粒径对其性质影响很大，因而测定粒径非 常重要。常用方法包括：电镜法:热力学光散射法：Zetasizer 3000SH激光测粒仪(Malvern Instruments Ltd)第七H一页，共101页。2主药含量测定和释放度测定透析管法和离心法等可用来测定释放度。3包封率测定 脂质体包封率的测定方法很多，有离心法、透析法、凝 胶柱层析法、导数光谱法等。其中凝胶柱层析法，具有 分子筛作用，能使混合物依据分子大小不同而分离，广 泛用于脂质体的分离及包封率的测定。第七十二页，共101页。凝胶柱层析法用于分离脂质体时，脂质体粒子将首先流出，随后游离药 物也会被洗脱下来，因此，游离药物在凝胶柱上保留时间越长，流出越慢,越有利于与脂质体粒子的分离。第七十三页，共101页。603n 405 20窗八0G-50(100-300 U)G-50(50-100 U)ALH-201 2 3 4 5 6 7 8 9 1 流份三种凝胶流出曲线图（n=3）第七十四页，共101页。游离药物在Sephadex G-50（100300口）柱上的保时间较长，从第六流份开始大量流出，而在Sephadex G-50（50100口）和Sephadex LH-20上均从第三流份开始大量流出。经三种凝胶的洗脱曲线测定，可初步选定用 Sephadex G-50（100-300p）测定包封率，洗脱 体积可初步定为10mL第七十五页，共101页。包封率计算:1）重量包封率Qw是指包入脂质体内的药物量与投料量的 重量百分比。式中W均、W包和W游分别表示投料量、包封于脂质体的药 量及未苞入脂质体的药量。W W-W空二/X一。%或。总总第七十六页，共101页。2）体积包封率Qv是指制剂中某类粒子体积V类与总体粒子V总体积百分比，式中V总和V类分别为脂质体制剂中总体粒子的体积和某类粒子的 体积。Qv测定方法有凝胶过滤法和显微镜法等。W=100%V V 总第七十七页，共101页。3）药脂包封比（Ew）七卬是指一定重量的类脂（包括PC、CH等）所包封药物重量的 百分比，式中W类脂处方类脂总量W包包封药物重量。W-WE%=*也*100%或E%=类脂W脂 厂 类脂第七十八页，共101页。罢 4渗漏率测定渗漏率表示脂质体贮存期间包封率的变化情况，定义为贮存 期包封量的减少与刚制备脂质体的包封量之比式中Q渗渗漏率；W总游定期测得游离药物量；w始游一一制备当时测得游离药物量；W包制备当时包封量；W贮定期测得包封量。W-W W-WQ%=w皿 x00%或Q%=q-100%渗/W第七十九页，共101页。4渗漏率测定渗漏率测定方法是一定条件下贮存（灭菌）脂质体，定期（时）取样 用测定包封率的方法（主要用凝胶柱层析）测定脂质体 包封量或游离药物量 与开始包封或游离药物量比较，再由式计算渗漏率。第八十页，共101页。5.药物体内分布通常可以小鼠为受试对象,将脂质体静注给药，测定不同时间血药浓度,并定时处死剖取脏器组织，捣碎分离取样,以同剂量药物作对照，比较各种组织的滞留量，进行动力学处理，以评价脂质体在动物体内的分布。第八H一页，共101页。5.药物体内分布脂质体以静脉给药时，能选择地集中于单核-巨噬细胞系 统，70%-89%集中于肝、脾。如卡氮芥脂质体注射液在小鼠尾静脉注射后卡氮芥主要被肝、脾摄取，40min在肝中达峰值，8h仍保持较高的滞m量，较同一时间的卡氮芥水溶液摄取量提高10倍。第八十二页，共101页。VI脂质体的作用机制和给药途径（一）脂质体与细胞的相互作用脂质体属胶体系统，具有靶向和缓释作用，从而可提高 药物药效，降低不良反应。脂质体与细胞膜的组成相似，能显著增强细胞摄取,延缓和克服耐药性。脂质体在体内细胞水平上的作用机制有吸附、脂交换、内 吞、融合等第八十三页，共101页。（一）脂质体与细胞的相互作用 1.吸附 吸附是脂质体作用的开始，是普通物理吸附,受粒子大小、密度和表面电荷等因素的影响。如脂粒与细胞表面电荷相反，吸附作用大。第八十四页，共101页。（一）脂质体与细胞的相互作用 2.脂交换 脂质体的脂类与细胞膜上脂类发生交换。其交换过程包括：脂质体先被细胞吸附，然后在细胞 表面蛋白的介导下，特异性交换脂类的极性基团或非 特异性地交换酰基链。交换仅发生在脂质体双分子层中外部单分子层和细胞 质膜外部的单分子层之间，而脂质体内药物并未进入 细胞。脂质体可与血浆中各种组织细胞相互作用进行 脂交换。第八十五页，共101页。绡(一)脂质体与细胞的相互作用*占3.内吞,内吞作用(endocytosis)是脂质体的主要作用机制。脂质体被单核一巨噬细胞系统细胞，特别是巨噬细胞作 为外来异物吞噬，称内吞作用。通过内吞，脂质体能特异地将药物浓集于作用的细胞房室内，也可使不能通过浆膜的药物达到溶酶体内。被动靶向第八十六页，共101页。(一)脂质体与细胞的相互作用 4.融合 融合(fusion)指脂质体的膜材与细胞膜的构成物相似 而融合进入细胞内，然后经溶酶体消化释放药物。体外证明脂质体可以将生物活性大分子如酶、DNA、环 磷酸腺昔(cAMP)、mRNA或毒素以细胞融合方式传递到培养 细胞内。第八十七页，共101页。（一）脂质体与细胞的相互作用 4.融合对产生耐药的菌株或癌细胞群，用脂质体载药可显著提高抗菌或抗癌效果;大分子药物被包封于脂质体往往可以提高口服药效;溶酶体膜的通透性有限，可阻止大分子药物释放至细胞内其它部位，而脂质体载大分子药物由于融合 作用则往往不受限制。第八十八页，共101页。细胞膜对脂质体的吸附和融合a吸附 b融合第八十九页，共101页。Birulint Io cell KurfiwI ptakrIn 卜 33me w脂质体的吸附和内吞第九十页，共101页。（二）给药途径脂质体在体内可完全生物降解,般无毒。脂质体在体内的作用受给药途径的影响。用不同的方法，可制备成各种大小和具有不同表面性质 的脂质体，因而脂质体可适用于多种给药途径。第九H一页，共101页。（二）给药途径 1.静脉注射 这是脂质体常见的给药途径。脂质体静脉注射后迅速从血液循环中消除，其消除率与 脂质体大小及表面所带电荷有关。大的脂质体比小的消除快。第九十二页，共101页。（二）给药途径2.肌内和皮下注射 脂质体经肌内或皮下注射后，一般缓慢从注射部位消除,随后吸收进入淋巴管，最后进入血液循环并广泛分布于肝、脾的单核一巨噬细 胞系统细胞中。第九十三页，共101页。（二）给药途径2.肌内和皮下注射皮下注射多室脂质体不易被淋巴结摄取，且从注射部位 消除很慢，包封于脂质体的药物以恒定速率进入循环系 统。而电中性及带正电荷的小单室脂质体被局部淋巴结摄取,通过淋巴管从注射部位进入全身循环。第九十四页，共101页。（二）给药途径3.经皮给药脂质体能够使亲脂性、难透过皮肤的大分子药物以治疗 量透人皮肤并可维持恒定的释放。也可使药物滞留在表皮与真皮之间起局部效应，提高生物利用度，而且无全身的副作用。第九十五页，共101页。（二）给药途径4.鼻腔给药脂质体鼻腔滴人给药后很快转移到支气管处，如粒径太大则沉积在无纤毛的鼻腔前部，影响吸收。第九十六页，共101页。（二）给药途径5.肺部给药般脂质体静脉注射后，只有少量分布到肺，因而不能在肺中达到治疗的有效浓度，通常采用雾化经肺吸入的脂质体气雾剂。如控制脂质体的粒径和对其进行表面修饰或被包裹的 药物本身具有特殊的理化性质，则也可以达到肺靶向 分布的目的。第九十七页，共101页。（二）给药途径 6.眼部给药脂质体与外眼组织、结膜和巩膜具有较强的亲和力。滴眼后迅速分散，增强药物对角膜的穿透性。激素类药物在眼部应用时由于脂质体的包封可减少其对循 环系统的副作用。第九十八页，共101页。（二）给药途径7.口服给药有些药物以游离形式通过胃肠道时，不能被吸收或易遭到破坏。但包封于脂质体后即可通过胃肠道吸收。根据脂质体缓释和保护药物的作用，可应用脂质体延长 水溶性药物的作用或用以包封胃肠道不吸收或不稳定的 药物。第九十九页，共101页。（二）给药途径7.口服给药水难溶性药物往往脂溶性很高，难于分散于胃肠液中，从 而吸收很差。包封于脂质体后，脂质体可形成水性分散液，增加药物在胃肠液中的分散，即可通过胃肠道吸收。第一百页，共101页。复习题1.脂质体的基本概念、组成与结构、与胶团的区别2.脂质体的剂型特点和体内作用特点3.脂质体的制备方法、质量标准第一百零一页，共101页。