中药的含量测定.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,1/7/2022,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,1/7/2022,#,中药的含量测定,中药的含量测定,第1页,2,第一节 含量测定目标与意义,中药含量测定与化药有很大区分,中药组成复杂，产生疗效不是某单一成份，,检测任何一个活性成份均不能反应中药整体疗效,。,不过借鉴化药质量控制模式，测定某一味药味有效成份、活性成份、指标性成份含量方法，对于,控制中药质量起着不可替换主要作用,。,经过测定中药中有效成份、毒性成份或一些指标性成份含量来,衡量其制剂工艺稳定性和中药材质量优劣,，以确保中药质量，到达临床用药安全、有效目标。,中药的含量测定,第2页,3,第二节 含量测定样品处理,样品处理主要作用有：,将被测成份有效地从样品中释放出来，并制成便于分析测定稳定试样。,除去杂质、纯化样品，以提升分析方法重现性和准确度。,富集浓缩或进行衍生化，以测定低含量被测成份。衍生化不但可提升检测器灵敏度，还能够提升方法选择性。,使试样形式及所用溶剂符合分析测定要求。,中药的含量测定,第3页,4,第二节 含量测定样品处理,一、样品粉碎,1.,目标,：,是确保含量测定所取样品均匀而有代表性，提升测定结果精密度和准确度；,是使样品中被测组分能更加快地完全提取出来。,2.,粉碎时,注意事项,：,不要粉碎得过细。样品粉碎得过细，在样品提取时，会造成过滤困难，所以可视实际情况进行粉碎过筛。,防止污染样品。在粉碎样品时，要尽可能防止因为设备磨损或不洁净等原因而玷污样品，,预防粉尘飞散或挥发性成份损失。,过筛时，通不过筛孔个别颗粒决不能丢弃，必须重复粉碎或碾磨，让其全部经过筛孔。,中药的含量测定,第4页,5,第二节 含量测定样品处理,二、样品提取,对于中药材和固体制剂样品，在粉碎后，取粉末适量精密称定，首先用溶剂进行提取，使被测组分和一些共存组分从中溶解出来（前者必须完全溶出），与滤渣分离后，再对被测组分进行含量测定。,常见提取方法,：,冷浸法,回流提取法,连续回流提取法,超声提取法,超临界流体提取法,中药的含量测定,第5页,6,第二节 含量测定样品处理,三、样品分离净化,（一）沉淀法,（二）蒸馏法,（三）液一液萃取法（,LLE,）,（四）色谱法,中药的含量测定,第6页,7,第二节 含量测定样品处理,（四）色谱法,吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱和凝胶色谱皆可作为中药制剂分析中净化分离方法，其操作方式有柱色谱，薄层色谱和纸色谱。,其中经典微柱色谱，也称固相萃取或液,固萃取（,LSE,）含有设备简单，使用方便，快速，净化效率较高而最常见，将在此做一介绍。,LSE,通常是指样品溶液加到装有适当固定相（净化剂）长,5,15cm,，内径,0.5,1cm,色谱柱中，将被测成份保留于柱上，洗去杂质后，再洗脱被测成份进行测定，或者是使杂质强烈保留于柱上，直接洗脱被测成份进行测定。用这种选择性好而柱效较低方法进行样品净化分离，尤其适合用于一类总成份含量测定，也可将色谱柱流出样品深入用,GC,、,HPLC,、,TCL,分离后测定。,LSE,常见净化剂（填料）有氧化铝、氧化镁、硅藻土、硅胶、活性炭、大孔树脂离子交换树脂、键合相硅胶,C8,、,C18,、聚酰胺等。视其性质可分为亲脂型、亲水型和离子交换型填料。,中药的含量测定,第7页,8,第二节 含量测定样品处理,硅胶、氧化铝等：,它们是传统吸附剂，多以,0.07,0.15mm,(200,100,目,),颗粒,1,5g,用于样品净化处理，其作用机制为溶质在吸附剂表面极性吸附作用。通常是当,溶于有机溶剂样品,加到柱上时非极性或,低极性杂质先被洗出,色谱柱，再用适当极性溶剂洗脱被测成份，而强极性杂质仍保留在柱上。,氧化铝能将黄酮类吸附在柱上，用于生物碱、苷类等测定。比如用法（吸收系数法）,硅胶适合于分离中性或酸性化合物，强烈保留碱性化合物。若把样品提取液加到柱上，依次用极性由小到大溶剂洗脱，则能够将杂质和被测成份分离。,中药的含量测定,第8页,9,键合相硅胶：,十八烷基键合相硅胶（简称,C18,或,ODS,）是常见固体萃取剂，其次有烷基、苯基、氰基键合相硅胶，可用来分开脂溶性和水溶性杂质或成份。也常见于萃取，纯化水基质体液中憎水性药品。该类,LSE,普通操作程序为：,1),柱活化。用,2ml,甲醇冲洗以润湿键合相和除去杂质，再用,0.5,毫升水洗去柱中甲醇。,2),上样。,3),清洗。用,2,5ml,水,清洗以,除去弱保留亲水成份,，如无机盐、氨基酸、亲水蛋白质、糖以及中等保留成份极性化合物、低肽等。,4),洗脱。用,2,5ml,甲醇或甲醇,-,水洗脱,大分子肽、甾体、较亲脂药品等强保留待测组分。,第二节 含量测定样品处理,中药的含量测定,第9页,10,大孔树脂：它可分为极性和非极性型,极性 丙烯酰胺聚合物,;,非极性 苯乙烯和二乙烯苯共聚物,.,其吸附性质与烷基键合相硅胶相同，经过疏水作用对非极性水溶性成份有吸附力。比如在测定复方归芪剂中黄芪甲苷时，用大孔树脂除去水溶性多糖杂质，再用,30%,乙醇洗脱黄芪甲苷。大孔树脂主要特点是表面主动大，传质速率较高和含有不一样极性及适于吸附较大分子。,树脂在使用前需要前处理：用甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂除去杂质，有时还需用酸、碱清洗。该填料用量常为,1,2g,，有时也用,100,150mg,来萃取血、尿中药品，操作程序类似,ODS,填料。,第二节 含量测定样品处理,中药的含量测定,第10页,11,第二节 含量测定样品处理,聚酰胺：,它是常见有机吸附剂，主要经过与溶质形成氢键而产生吸附作用。,常见于含酚、酸、醌类药品样品液净化分离，,如测定黄酮时，用样品乙醇提取液上柱，水洗去个别杂质，以,95%,乙醇洗脱总黄酮后测定。,中药的含量测定,第11页,12,第二节 含量测定样品处理,硅藻土、纤维素：,它们为常见亲水型填料，其原理为分配作用。填料作为支持剂，多以水基质液作为固定相，与水不混溶有机溶剂为流动相，较亲脂成份从固定相转移到流动相，而被洗脱，到达萃取目标。其萃取率较高（普通大于,80%,），无浓集作用，萃取液较纯净，但洗脱剂用量较大（普通大于,5ml,）,硅藻土柱则用干柱直接上样，柱可再生。常见牌号为,Extretut,。纤维素柱使用与硅藻土柱相同。,中药的含量测定,第12页,13,离子交换树脂：,憎水基质离子交换树脂兼有离子交换剂及大孔树脂一些性质，所以对于在水中溶解度不大药品、洗脱剂中需含一定量有机溶剂。,离子交换树脂柱可用于除去样品中离子，预防组分分解，更常见于萃取样品液中可离解化合物。,第二节 含量测定样品处理,中药的含量测定,第13页,14,第二节 含量测定样品处理,另外，多年来发展起来固相微萃取,(Solid-Phase microextraction,SPME),和液相微萃取,(Liquid-Phase microextraction,LPME),技术有良好应用前景。,SPME,是一个无溶剂萃取技术，取样方式有直接取样和顶空取样。,中药的含量测定,第14页,15,（,五）消化法,对样品进行有机破坏，常见于中药制剂中重金属检验。,常见破坏方法有湿法消化和干法消化法。,湿法消化：依据所用试剂不一样，下面介绍三种常见消化方法。,（,1,）硝酸,高氯酸法 该法破坏能力强，反应较激烈，故进行破坏时，必须严密注意切勿将容器中溶液蒸干，以免发生爆炸。本法适合用于血，尿、组织等生物样品和含动植物药制剂破坏，经破坏后所得无机金属离子均为高价态，本法对含氮杂环类有机物破坏不够完全。,（,2,）硝酸,硫酸法 该法适合用于大多数有机物质破坏，无机金属离子均氧化成高价态，与硫酸形成不溶性硫酸盐金属离子测定，不宜采有此法。,第二节 含量测定样品处理,中药的含量测定,第15页,16,第二节 含量测定样品处理,（,3,）硫酸,硫酸盐法,本法所用硫酸盐为硫酸钾或无水硫酸纳，加入硫酸盐目标是为了提升硫酸沸点，以使样品破坏加速完全。同时预防硫酸在加热过程中过早地分解为,SO3,而损失。经本法破坏所得金属离子，多为低价态。本法常见于含砷或锑有机样品破坏，破坏后得到三价砷或锑。,湿法消化所用仪器，普通为硅玻璃或硼玻璃制成凯氏瓶（直火加热）或聚四氟乙烯消化罐（烘箱中加热）。所用试剂应为优级纯，水应为去离子水或高纯水，同时必须按相同条件进行空白试验校正。操作时应在通风橱内进行。,中药的含量测定,第16页,17,第二节 含量测定样品处理,干法消化,本法是将有机物灼烧灰化以达分解目标，将适量样品置于瓷坩锅、镍坩锅或铂坩埚中，常加无水,Na2CO3,或轻质,MgO,等以助灰化，混匀后，先小火加热，使样品完全炭化，然后放入高温炉中灼烧，使其灰化完全即可。本法不适合用于含易挥发性金属（如汞、砷等，）有机样品破坏。,应用本法时要注意以下几个问题：,1,）加热灼烧时，控制温度在,420,以下，以免一些被测金属化合物挥发。,2,）灰化完全是否，直接影响测定结果准确度。如欲检验灰化是否完全，可将灰分放冷后，加入稍过量稀,HCl-,水（,1:3,）或硝酸,-,水（,1:3,）溶液，振摇。若呈色或有不溶有机物，可于水浴上将溶液蒸干，并用小火炭化后，再行灼烧。,3,）经本法破坏后，所得灰分往往不易溶解，但此时切勿弃去。,中药的含量测定,第17页,18,第三节,常见定量分析方法,分类重量分析和滴定分析。,化学分析法所用仪器简单，结果准确。,主要用于测定制剂中含量较高一些成份及含矿物药制剂中无机成份，如总生物碱类、总酸类、总皂苷及矿物药制剂等。,化学分析法有一定不足，其灵敏度低，操作繁琐、耗时长，专属性不高，对于微量成份准确性不理想。,中药的含量测定,第18页,19,第三节 常见定量分析方法,（一）重量分析法,重量法可分为挥发法、萃取法和沉淀法。,1,、挥发法可测定含有挥发性或能定量转化为挥发性物质组分含量。如：供试品干燥失重测定；水分测定均属挥发法；中药制剂分析中灰分及炽灼残渣测定等。,2,、萃取法是依据被测组分在互不相溶两相中溶解度不一样，到达分离目标。如冰硼散中冰片含量测定；地奥心血康胶囊中甾体总皂苷含量测定；昆明山海棠片中总生物碱含量测定；甘草浸膏中甘草酸含量测定即采取萃取法。,3,、沉淀法是将被测组分定量转化为难溶化合物，测定其含量方法，适合用于制剂中纯度较高成份。如西瓜霜润喉片中西瓜霜含量测定；苦参片中苦参总碱含量测定；复方元胡注射液总碱测定。,中药的含量测定,第19页,20,第三节 常见定量分析方法,（,二）滴定分析法,滴定分析法分为酸碱滴定法、沉淀滴定法、配位滴定法和氧化还原滴定法。,1,、酸碱滴定法,适合用于测定中药制剂中所含有生物碱、有机酸、内酯类等酸、碱组分含量。,直接滴定：对于,KC10,-8,酸、碱组分，可在水溶液中直接滴定。如：止喘灵注射液中总生物碱含量测定、颠茄酊中生物碱含量测定。,间接滴定或非水滴定法：如大山楂丸中总酸性物质含量测定、草乌注射液中生物碱含量测定等。,2,、沉淀滴定法,主要用于生物碱、生物碱氢卤酸盐及含卤素其它有机成份含量测定。,中药的含量测定,第20页,21,第三节 常见定量分析方法,3,、配位滴定法,包含,EDTA,法和硫氰酸铵法，在中药制剂分析中，用以测定鞣质、生物碱及含,Ca2+,、,Mg2+,、,Fe3+,、,Hg2+,等矿物类制剂含量。如万氏牛黄清心丸等含量测定就采取硫氰酸铵法；牛黄解毒片中石膏含量测定。,4,、氧化还原滴定法,适合用于测定含有氧化还原性物质，如含酚类、糖类及矿物药,Fe,、,As,等成份中药制剂。如磁朱丸中全铁含量测定采取铈量法；牛黄解毒片中雄黄含量测定；丹皮酚注射液中丹皮酚含量测。,中药的含量测定,第21页,22,第三节 常见定量分析方法,二、可见一紫外分光光度法,该法是中药及其制剂含量测定一个常见方法,含有灵敏度高，精度好和操作简便等优点。,该法要求被测成份本身或其显色产物对可见,紫外光含有选择性吸收。按测定波长数目不一样分为单波长光谱法和多波长光谱法。,中药的含量测定,第22页,23,第三节 常见定量分析方法,（一）单波长光谱法,分类,方法,特点,吸收系数法,测定所配供试品溶液在要求波长吸收度，依据被测成份吸收系数（E1%1cm）计算其含量,对仪器要求高，使用该法时，应注意仪器波长、空白吸收校正，吸收度准确度检定和杂散光检验,无需对照品，方法简便,对照品比较法,在一样条件下配制对照品溶液和供试溶液，且使前者中所含被测成份量应为后者中被测成份量100%10%，用要求波测定二者吸收度，则可计算出供试品中被测成份浓度或含量,对仪器要求较高,标准曲线法,配制一系列不一样浓度对照品溶液（常为5个），在相同条件下分别测定吸收度，绘制A-C曲线，或求出其回归直线方程（相关系数r0.999），即得标准曲线。在相同条件下，测定供试品溶液吸收度，就可求得供试品中被测成份浓度或含量。,本法对仪器精度要求不高，有时标准曲线不经过原点，只要重现性好也可使用,该法在比色法中最常见,中药的含量测定,第23页,24,第三节 常见定量分析方法,（二）多波长光谱法（计算分光光度法）,供试品溶液中若有各种（两种或两种以上）组分共存，其紫外光谱彼此发生不一样程度重合时，则可经过测定各种波优点吸收度，依据吸收度加和性，采取适当数学处理方式进行多组分同时测定，或者用其排除共存组分干扰，测定其中某个组分。这就属于多波长光谱法范围。,下面简明介绍用多波长法测定存在光谱干扰多组分样品中某个组分一些技术：,双波长法（包含等吸收点法和系数倍率法）、三波长法、导数光谱法和差示光谱法等。,中药的含量测定,第24页,25,第三节 常见定量分析方法,优点是可省去或简化样品预处理步骤，测定组成已知复杂样品，不过使用该法应慎重。,首先因为中药及其制剂供试品溶液往往组成复杂，甚至干扰组分或阴性空白样品变动性大，所以，使得其方法适应性差，而只适应于同批样品或内控应用，当前极少在药典和新药报批中使用多波长法作为中药制剂含量测定方法。,再者，当测定吸收度处于吸收曲线陡峭部位时，波长微小变动可能对测定结果造成显著偶然误差。,还有在实际工作中，因为测试条件改变，仪器精度与性能限制，多波长法不用吸收系数法，而采取标准品对比方法（常见标准曲线法）来进行样品测定。,中药的含量测定,第25页,26,第三节 常见定量分析方法,三、薄层扫描法,薄层扫描法是以薄层色谱法为基础发展起来薄层色谱组分原位分析方法及薄层色谱统计方法，又称薄层色谱扫描法（,TLCS,），对应仪器称为薄层扫描仪（,Thin Layer Chromatogram Scanner,）。,薄层扫描法是用一定波长光照射在薄层板上，对薄层色谱中吸收紫外光或可见光斑点，或经激发后能发射出荧光斑点进行扫描，将扫描得到图谱及积分数据用于药品判别、杂质检验或含量测定。,中药的含量测定,第26页,27,第三节 常见定量分析方法,（一）基础原理,薄层扫描法是指薄层色谱斑点色谱扫描，薄层色谱扫描是指固定波长，斑点移动，测定,A-l,或,F-l,曲线。依据薄层扫描测定方式分为,薄层吸收扫描法,和,薄层荧光扫描法,二种方法。,中药的含量测定,第27页,28,第三节 常见定量分析方法,1,、薄层吸收扫描法,基础原理：,Kubelka-Munk,理论及曲线。因为薄层板存在显著散射现象，斑点中物质浓度与吸光度关系需用,Kubelka-Munk,理论及曲线来描述。,Kubelka-Munk,理论以斑点相对,反射率,和相对透光率计算薄层色谱斑点吸光度，说明了固定相散射参数,SX,对斑点中物质浓度与吸光度间关系影响，取得不一样散射参数,SX,时斑点,A-KX,理论曲线，即,Kubelka-Munk,曲线。,光源：钨灯和氘灯；,灵敏度：在,200-800nm,波长范围内选择适当波长进行测定，其灵敏度可达,ng,级；,适用范围：适合用于在可见、紫外区有吸收物质，及经过色谱前或色谱后衍生成上述化合物样品组分。,中药的含量测定,第28页,29,2,、薄层荧光扫描法,基础原理：,F=2.3KI,。,ECL,或,F=KC,光源：氙灯或汞灯。,灵敏度：最低可测到,10-50pg,。,适用范围：适合于本身含有荧光或经过适当处理后可产生荧光物质测定。,Kubelka-Munk,理论不适合用于薄层荧光扫描，无需进行曲线校直。用薄层荧光扫描进行定量分析时，用斑点荧光强度积分值（色谱峰峰面积）与斑点中组分含量代替上式中,F,与,C,进行运算。,第三节 常见定量分析方法,中药的含量测定,第29页,30,（二）薄层色谱规范化操作,1,、仪器与材料,薄层板；涂布器；点样器材；展开箱（层析缸）显色与检测仪器,2,、操作方法,薄层板制备；点样；展开；检测；,第三节 常见定量分析方法,中药的含量测定,第30页,31,第三节 常见定量分析方法,（三）定量分析方法,1,、方法学考查,新建薄层扫描定量方法必须进行方法考查，以说明新建方法可靠性，考查内容有工作曲线、定量结果精密度及准确度、统计检验等内容。,中药的含量测定,第31页,32,（,1,）工作曲线,检验所选择散射参数,SX,值是否适宜。,SX,值适宜则工作曲线被校直为直线，不然，调整,SX,值再校正，直至在一定点样量范围内工作曲线成直线为止。,考查工作曲线是否过原点，方便确定采取一点法或二点法定量。,确定点样量线性范围。既使采取曲线校直，也只是在一定点样量范围内工作曲线为直线，所以需确定点样量上、下限。,为降低定量误差，最好调整点样量，使供试品与对照品峰面积相靠近。,为了克服薄层板间差异，外标法及内标法均应采取随行标准法，即标准溶液与供试品溶液交叉点在同一块薄层板上。,第三节 常见定量分析方法,中药的含量测定,第32页,33,第三节 常见定量分析方法,（,2,）精密度考查,取同一供试品溶液，在同一块薄层板上以相同点样量平行点,5,点以上，展开后测定其峰面积，求算相对标准差（,RSD,），作为衡量定量分析结果精密度指标。,RSD,应小于,4%,。,式中：为,n,次测量平均值，,S,为标准差。,中药的含量测定,第33页,34,第三节 常见定量分析方法,（,3,）准确度考查,回收率是衡量定量方法准确度指标，常见加样回收率（,R,）来衡量，其值应在,95-105%,之间，测量数据普通为,5-6,个。,将加入纯品试样溶液、供试品溶液及标准溶液点于同一块薄层板上，展开后进行薄层扫描，测定各斑点峰面积，计算各溶液中组分量，计算回收率（,R,）。,中药的含量测定,第34页,35,（,4,）统计检验,统计检验是检验两种方法、两台仪器或两个人测量两组试验数据精密度或准确度（偶然误差或系统误差）间是否存在显著性差异，说明新建定量方法可否代替旧方法或优于旧方法。,统计检验包含,F,检验与,t,检验。,F,检验,即精密度差异检验，用以检验两组数据精密度或偶然误差是否存在显著性差异，普通为单侧检验。,t,检验,即准确度差异检验，用以检验两组测量数据平均值或系统误差是否存在显著性差异。若,t,检验证实两种方法测得均值不存在显著性差异时，则新方法能够代替旧方法，,t,检验普通为双侧检验。,t,检验与,F,检验详细方法参见分析化学相关论著，此从略。,第三节 常见定量分析方法,中药的含量测定,第35页,36,第三节 常见定量分析方法,2,、定量方法,常见定量方法有,外标法,、,内标法,、,追加法,（叠加法）及,回归曲线,定量法。,（,1,）外标法,外标法是薄层色谱扫描最常见定量方法，方法简便，但点样必须准确。,外标一点法,工作曲线经过原点（截距为零）时可用外标一点法定量。只需点一个浓度标准品溶液，与供试液同板展开，对比，测定组分含量，其计算公式为：,C=F,1,A,式中：,C,为组分重量或浓度，,A,为测得该组分峰面积，,F1,为直线斜率或百分比常数。,中药的含量测定,第36页,37,外标二点法,工作曲线不经过原点时，只能用外标二点法定量，最少需点二种不一样浓度标准溶液（或一个浓度两种点样量），才能决定一直线,其计算公式为：,C=F,1,A+F,2,式中：,C,、,A,同前，,F,1,为直线斜率或百分比常数，,F,2,为纵坐标截距，,F,1,和,F,2,值由仪器自动算出。,外标一点法、二点法只是指用一个或二种浓度标准溶液对比定量，为减小误差，同一薄板上,供试品点样不得少于,4,个,，,对照品每一浓度不得少于,2,个,；并调整标淮溶液浓度或供试品与标准溶液点样量，使其峰面积相靠近；且点样量必须准确，宜用定量毛细管点样,。,第三节 常见定量分析方法,中药的含量测定,第37页,38,第三节 常见定量分析方法,（,2,）内标法,内标法是选一个纯物质作为内标物，并准确称取一定量内标物加至供试液及标准液中，计算供试品溶液中某组分含量定量方法。,内标物选择要求是：,纯度合乎要求，展开后不得有杂质斑点，不然内标斑点峰面积将不能代表内标物量。,内标物须为样品中所不含有成份。,内标物不与其它斑点相重合，分离度合乎要求。,为简化计算，内标物在标准溶液及供试品溶液中浓度应相等。,中药的含量测定,第38页,39,特点：,1,）在一定点样量范围内，内标法定量准确度与点样量无关。,2,）不易找到适宜,Rf,值纯品内标物，且溶液配制等操作较麻烦。,方法：,1,）内标一点法：当工作曲线经过原点时采取内标一点法。,内标一点法公式：,2,）工作曲线不经过原点时必须采取内标二点法,内标二点法公式：,式中：,C,、,Cis,分别为组分及内标物浓度或重量，,A,、,Ais,分别为测得组分及内标物峰面积，,F1,为直线斜率或百分比常数，,F2,为截距，,F1,和,F2,由仪器自动计算并内存，可直接给出样品浓度或重量。,第三节 常见定量分析方法,中药的含量测定,第39页,40,（,3,）回归曲线定量法,将不一样浓度（或不一样量）标准溶液与供试液点在同一块薄层板上，展开、扫描,;,由计算机对所测得峰面积及对应点样量进行线性或非线性回归,;,直接由回归方程或回归曲线计算供试液含量方法,;,CAMAG,系列薄层扫描仪即采取此方法。,第三节 常见定量分析方法,中药的含量测定,第40页,41,第三节 常见定量分析方法,（四）影响薄层色谱分析主要原因,1,、样品预处理及供试液制备,2,、薄层色谱点样技术,3,、吸附剂活性与相对湿度影响,4,、溶剂蒸气在薄层色谱中作用,5,、温度影响,中药的含量测定,第41页,42,相对湿度（,%,）,所需硫酸浓度（,V/V,）,硫酸（,ml,）,水（,ml,）,32,68,100,42,57,100,58,39.5,100,65,34,100,72,27.5,100,88,10.8,89,控制相对湿度用硫酸溶液,第三节 常见定量分析方法,中药的含量测定,第42页,43,第三节 常见定量分析方法,四、气相色谱法,气相色谱法是以气体为流动相柱色谱分离分析方法。,特点：分离效能高、选择性好、灵敏度高，样品用量少及分析速度快等特点，兼具分离、分析功效，适合用于热稳定性好易挥发性或可转化为易挥发性组分分析。,适用范围：适合用于热稳定性好易挥发性或可转化为易挥发性组分分析。,中药的含量测定,第43页,44,第三节 常见定量分析方法,（一）基础原理,气相色谱是依据汽化后试样被载气带入色谱柱，因为各组分在两相间作用不一样，在色谱柱中移动有快慢，经一定柱长后得到分离，依次被载气带入检测器，将各组分浓度或质量改变转换成电信号改变统计成色谱图，利用色谱峰保留值进行定性分析，利用峰面积或峰高进行定量分析方法。,中药的含量测定,第44页,45,第三节 常见定量分析方法,（二）试验条件选择,在气相色谱分析中，为到达满意分离效果，需依据,Van Deemeter,方程式和分离度方程式选择适当分离条件，主要有固定相、柱温、载气流速等条件选择。,1,、固定相选择,1,）气,液色谱,固定液：按极性相同、化学官能团相同,相同性标准,和主要差异选择。,载体：普通为适宜粒度，经酸洗并硅烷化处理硅藻土。,2,）气,固色谱：固定相大多采取高分子多孔微球（,GDX,），用于分离水及含羟基（醇）化合物。,中药的含量测定,第45页,46,第三节 常见定量分析方法,2,、柱温选择,选择基础标准：在使最难分离组分有符合要求分离度前提下，尽可能采取较低柱温，但以保留时间适宜及不拖尾为度。,在实际工作中普通,依据样品沸点来选择柱温,，详细有以下几点：,高沸点样品（沸点,300-400,），采取,1-5%,低固定液配比，柱温,200-250,。,沸点为,200-300,样品，采取,5-10%,固定液配比，柱温,150-180,。,沸点为,100-200,样品，采取,10-15%,固定液配比，柱温选各组分平均沸点,2/3,左右。,气体等低沸点样品，采取,15-25%,高固定液配比，柱温选沸点左右，在室温或,50,下进行分析。,对于宽沸程样品，需采取程序升温方法进行分析。,但需注意是柱温要低于固定液最高使用温度。,中药的含量测定,第46页,47,3,、载气选择,主要从对峰展宽（柱效）、柱压降和检测器灵敏度影响三方面考虑。,N,2,是最常见载气；,载气流速较低时，宜用,N,2,；流速高时，宜用,H,2,、,He,；,较长色谱柱，宜用,H,2,作载气；,热导检测器应选取,H,2,、,He,；氢焰检测器、电子捕捉检测器，普通用,N,2,；,普通控制载气流速高于其最正确流速。常见载气流速为,20-80ml/min,。,第三节 常见定量分析方法,中药的含量测定,第47页,48,第三节 常见定量分析方法,4,、其它条件选择,气化室（进样口）温度：气化温度取决于样品挥发性、沸点范围、稳定性及进样量等原因。,检测室温度 检测器温度普通需高于柱温，以免色谱柱流出物在检测器中冷凝而污染检测器。通常可高于柱温,30,左右或等于气化室温度。,进样量 在检测器灵敏度足够前提下，尽可能降低进样量，通常以塔板数下降,10%,作为最大允许进样量。对于,填充柱,，气体样品为,0.1-1l,，液体样品为,0.1-1l,，最大不超出,4l,为宜。毛细管柱需用分流器分流进样，,分流后进样量为填充柱,1/10-1/100,。另外，,进样速度要快,，进样时间要短，注意留针时间和室温影响，以准确控制进样量，以利于分离。,中药的含量测定,第48页,49,第三节 常见定量分析方法,5,、检测器,热导检测器（,TCD,）：通用型检测器，应用广泛，但灵敏度较低；,氢焰离子化检测器（,FID,）：应用最广泛，适合用于含碳有机物测定，载气多为,N2,。,氮,-,磷检测器（,NPD,）：专属性检测器，可用于中药及其制剂中农药残留量检测。,电子捕捉检测器（,ECD,）：专属性检测器，适合用于痕量电负性有机物,如含卤素、硫、氧、硝基、羰基、氰基等化合物分析。,中药的含量测定,第49页,50,第三节 常见定量分析方法,（三）定量分析方法,气相色谱常见定量方法有内标法、外标法、归一化法等。,1,、内标法,特点：,为最常见定量方法,优点：可抵消仪器稳定性差、进样量不够准确等原因所带来定量分析误差；,缺点：样品配制较麻烦，有些内标物不易寻找。,关键：选择适当内标物。,适用范围：适合用于样品全部组分不能全部流出众,谱柱；,检测器不能对每个组分都产生信号；,只需测定样品中某几个组分含量时情,况。,中药的含量测定,第50页,51,第三节 常见定量分析方法,原理：选择一内标物，将一定量内标物加入到样品中，依据试样重量,W,和内标物重量,Ws,及待测组分和内标物峰而积,Ai,、,As,，求出待测组分含量。,待测组分百分含量为：,Ci%=,式中,fi,、,fs,分别为被测组分和内标重量校正因子。,在中药制剂分析时，校正因子经常不知，可采取药典方法测定校正因子再用内标法，或采取,内标对比法,测定。,中药的含量测定,第51页,52,第三节 常见定量分析方法,（,3,）内标工作曲线法,内标工作曲线法与外标法相同，只是在各种浓度标准溶液中加入相同量内标物，进样，以标准物与内标物峰面积比,A,i,/A,S,对,C,i,作工作曲线（或求回归方程）样品测定时也加入等量内标物，依据样品与内标物峰面积比,A,X,/A,S,由工作曲线求得待测组分含量。,中药的含量测定,第52页,53,第三节 常见定量分析方法,2,、外标法,关键：进样量准确；,试验条件恒定。,分类：,1,）工作曲线法：用一系列浓度对照品,溶液确定工作曲线，在完全相同条件,下，准确进样等体积样品溶液，计,算其含量；,2,）外标一点法：当工作曲线截距为零,时，可采取外标一点法定量，,中药的含量测定,第53页,54,3,、归一化法,关键：要求全部组分均要产生色谱峰。,适用范围：通常只能用于粗略考查供试品杂质含量，,普通宜用于微量杂质含量检验,.,校正面积归一化法测定各组分含量。,面积归一化法计算：,中药的含量测定,第54页,55,第三节 常见定量分析方法,高效液相色谱法（,HPLC,）是以经典液相色谱法为基础，引入气相色谱理论和试验方法。高压输送流动相，采取高效固定相及在线检测等伎俩发展而来分离分析方法，含有分离效能高、分析速度快及应用范围广等特点。,适用范围：适合用于极性、非极性化合物，离子型化合物和高分子化合物分离分析。,中药的含量测定,第55页,56,第三节 常见定量分析方法,（一）,HPLC,基础原理,（二）,HPLC,试验条件选择,1,、色谱柱选择,依据被分离物质化学结构、极性和溶解度等原因进行选择。,大多数药品可用,C18,反相（,ODS,）柱加以分离测定；,也可选取正相分配色谱柱（氨基柱、氰基柱）或硅胶吸附色谱柱等；,解离药品可用离子对色谱、离子抑制色谱或离子交换色谱分离测定；,脂溶性药品异构体分离测定可采取硅胶吸附色谱柱。,中药的含量测定,第56页,57,2,、流动相选择,1,）反相键合相色谱,流动相,常见溶剂,适用范围,个别含水溶剂,甲醇,-,水、乙腈,-,水系统,用于分离中等极性、弱极性药品,非水溶剂,乙腈,-,二氯甲烷、甲醇,-,四氢呋喃等,用于分离疏水性物质,缓冲溶液,三乙胺磷酸盐、磷酸盐、醋酸盐溶液,用于可溶于水并具可解离特征化合物,反相键合相色谱常见流动相,中药的含量测定,第57页,58,第三节 常见定量分析方法,2,）正相键合相色谱,常采取饱和烷烃（如正已烷）中加入一个极性较大溶剂作为极性调整剂（如异丙醚），经过调整极性调整剂浓度改变溶剂强度；,常采取二元以上混合溶剂系统。,中药的含量测定,第58页,59,第三节 常见定量分析方法,3,、洗脱方式,等度洗脱是在同一分析周期内流动相组成保持恒定，使全部组分,k,值都处于这个范围内，适合用于组分数较少、性质差异不大样品。,梯度洗脱是在一个分析周期内程序控制流动相组成（如溶剂极性、离子强度和,pH,值等），适合用于分析组分数多、性质相差较大复杂混合物样品，从而使全部组分都在适宜条件下取得分离。,中药的含量测定,第59页,60,4,、检测器,检测器,特点,检测限,适用范围,紫外检测器（,UV,或,UVD,）分为,:,可变波长型二极管阵列检测器,用于检测有外吸收物质;灵敏度较高,噪音低,线性范围宽,对流速和温度波动不灵敏,可用于梯度洗脱.,10,-7,-10,-12,g,用于芳烃、稠环芳烃、芳香氨基酸、核酸、甾体激素、羰基和羧基化合物等,荧光检测器,(FD),用于能产生荧光或其衍生物能发荧光物质;灵敏度高于紫外检测器,110,-10,g/ml,主要用于氨基酸、多环芳烃、维生素、甾体化合化物及酶等,蒸发光散射检测器,(ELSD),属通用型检测器,理论上可用于挥发性低于流动相任何样品组分;检测灵敏度较低,适适用于流动相能挥发色谱洗脱,不能用含缓冲盐流动相,用于检测糖、高分子子化合物、高级脂肪酸、磷脂、维生素、氨基酸、甘油三酯及甾体等几十类化合物,中药的含量测定,第60页,61,4,、检测器,电化学检测器,(ECD),用于能氧化、还原有机物质检测,110,-12,g/ml,适用生物胺、酚、羰基化合物、巯基化合物等,示差折光检测器,(RID),属通用型检测器,利用组分与流动相折射率之差进行检测.稳定性好,操作方便.灵敏度低,受环境温度、流动相组成等波动影响大,不适合梯度洗脱,10,-8,g/ml,尤其适合于糖类检测,化学发光检测器,(CLD),高选择性、高灵敏度新型检测器.设备简单,本身发光,无需光源,价格廉价,Pg,级,(10,-12,),用于分析微量脂质、核酸、生物胺等,中药的含量测定,第61页,62,5,、,HPLC,前处理,（,1,）流动相处理,溶剂纯化,选择专供色谱分析用“色谱纯”溶剂，分析纯或优级纯溶剂在很多情况下也可满足色谱分析要求。因为不一样色谱柱和检测方法对溶剂要求不一样，有时需进行除去紫外杂质、脱水、重蒸等纯化操作。水普通采取石英系统二次蒸馏水。,第三节 常见定量分析方法,中药的含量测定,第62页,63,流动相脱气,HPLC,所用流动相必须预先除去其中空气，习称脱气，普通在临用前对流动相进行脱气，常见脱气法有超声波振荡脱气、惰性气体（,He,）鼓泡吹扫脱气、抽真空、加热法。,过滤,过滤是为了预防不溶物堵塞流路和色谱柱入口处微孔垫片，所以应预先除去流动相中任何固体微粒。流动相最好在玻璃容器内蒸馏，而常见方法是过滤，采取,0.45m,以下微孔滤膜过滤。,滤膜分有机溶剂专用和水溶液专用两种。,第三节 常见定量分析方法,中药的含量测定,第63页,64,第三节 常见定量分析方法,（,2,）样品处理,HPLC,分析前需对样品进行预处理，方便将待测物质有效地从样品基质中释放出来，使样品形式及所用溶剂符合,HPLC,要求。,待测组分提取,溶剂挥发,(,浓缩）,滤过 样品溶液进样前，需用滤膜抽滤或针头滤器过滤，以有效除去样品溶液中悬浮物或个别大分子杂质。,中药的含量测定,第64页,65,第三节 常见定量分析方法,正相色谱,:,流动相极性小于固定相极性分配色谱法，主要用于极性物质分离测定；,反相色谱,:,流动相极性大于固定相极性分配色谱法，主要用于非极性、中等极性物质分离测定,中药的含量测定,第65页,66,第三节 常见定量分析方法,化学键合相是将固定液官能团键合在载体上所形成固定相。,含有化学性能稳定，热稳定性好，普通在,pH2-8,范围溶液中不变质，使用过程不流失，载样量大，适于梯度洗脱等特点，已广泛用于正相与反相色谱，离子抑制色谱，离子对色谱。,药典中,HPLC,法所采取固定相均为化学键合相。以化学键合相为固定相色谱法称为化学键合相色谱法,.,现就中药分析中最常见键合相色谱法作一介绍。,中药的含量测定,第66页,67,第三节 常见定量分析方法,（,1,）反相键合相色谱法,反相键合相色谱法是当代液相色谱中,应用最为广泛,方法，占整个,HPLC,应用,80%,左右。,反相色谱法普通采取非极性键合相，十八烷基键合相（简称,ODS,或,C,18,）是最常见非极性固定相，对于各种类型化合物都有较强适应能力；,流动相通常以水为基础溶剂，再加入一定量能与水互溶极性调整剂，常见有甲醇,-,水、乙腈,-,水系统。,极性调整剂性质及其与水混合百分比对溶质保留值和分离选择性有显著影响，,流动相极性增大，洗脱能力降低，溶质,k,增大，,t,R,增大；反之，,k,与,t,R,减小。调整流动相极性，可控制,k,值在所要求范围内（,k=1-10,），对于结构类似组分，极性大组分先出柱。,中药的含量测定,第67页,68,第三节 常见定量分析方法,（,2,）正相键合相色谱法,正相键合相色谱法应用不如反相色谱法普及，主要用于分离分析溶于有机溶剂极性及中等极性分子型物质。氰基（,-CN,）、氨基（,-NH2,）和二醇基（,DIOL,）键合相是正相色谱常见极性键合相，流动相通常见烷烃（常见正已烷）加适量极性调整剂组成。,中药的含量测定,第68页,69,第三节 常见定量分析方法,（,3,）离子对色谱法,直接将离子对试剂加入到流动相中，用以分离离子型或可离子化化合物方法作为离子对色谱法（,PIC,或,IPC,），该法可分为正相离子对色谱法和反相离子对色谱法，但多年来广泛应用几乎都是反相离子对色谱法，故本书只介绍反相离子