Real-time-PCR原理和应用PPT文档.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实时荧光定量,PCR,技术的原理及应用,（,Real-time PCR,）,神经感染组 金戈,1,提纲,实时荧光定量,PCR,原理,实时荧光定量,PCR,的定量方法,平台定量,PCR,仪器介绍,2,实时荧光定量,PCR,的,定义,定义：,在,PCR,反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个,PCR,进程，对起始模板进行定量分析的方法,3,与普通,PCR,的区别,普通,PCR,技术：,在,PCR,结束后对,终点产物,进行定量分析,实时定量,PCR,技术：,实时检测,PCR,扩增，在扩增的指数期对,起始模板,进行定量,4,起点定量和终点定量,起始,DNA,量是“天然”的量，更有意义；终点,DNA,量是经过,PCR“,加工”后的量，存在部分失真,起点定量重现性好，终点定量误差较大,5,扩增曲线：四个阶段,对数图谱,6,扩增曲线：四个阶段,线性图谱,7,一些主要概念,什么是,基线,？,基线就是扩增曲线中的水平部分,线性图谱 对数图谱,8,荧光阈值：,是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般荧光域值的设置是基线荧光信号的标准偏差的,10,倍,CT,值：,是每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数,拷贝数：,DNA,（包括质粒）拷贝数通常指生长在标准的培养基下每个细菌或者细胞中所含有的,DNA,分子的数目,一些主要概念,9,基线和域值,10,CT,值,11,标准曲线,由此可见，,Ct,值与模板,DNA,的起始拷贝数成反比,12,荧光定量,PCR,化学原理,SYBRGreenI,荧光染料,TaqMan,探针,13,SYBRGreenI,是一种只与双链,DNA,小沟结合的染料,SYBRGreenI,只有和双链DNA结合后才发,出,荧光,，,变性时DNA双链分开，无荧光,在延伸结束阶段采集荧光信号,SYBRGreenI,荧光染料,14,SYBRGreenI,工作原理,变性 退火 延伸,每形成一个DNA双链，就有一定数量的染料结合上去,，,染料一结合，就产生荧光信号,信号强度与DNA分子总数目成正比,15,SYBR Green I,荧光染料法的优缺点,优点：,1,、,对DNA模板没有选择性,，,适用于任何DNA,2,、,不必设计复杂探针,3,、价格便宜,缺点：,1,、,容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性,2,、,对引物特异性要求较高,16,TaqMan,探针法,5,端标记有荧光报告基团（,Reporter,，,R,），如,FAM,、,VIC,等,3,端标记有荧光淬灭基团（,Quencher,，,Q,）,探针完整，,R,所发射的荧光能量被,Q,基团吸收，无荧,光，,R,与,Q,分开，则发出荧光,Taq,酶有,53,外切核酸酶活性，可水解探针,17,TaqMan,探针法工作原理,18,每产生一条,DNA,链，就切断一条探针,每切断一条探针，就产生一个单位信号,信号强度与结合探针的,DNA,分子数成正比,TaqMan,探针法工作原理,19,优点：,1,、对目标序列的高特异性,2,、引物设计相对简单,3,、重复性比较好,缺点：,1,、只适合一个特定的目标,2,、价格昂贵,TaqMan,探针法的优缺点,20,如何对未知拷贝数的模板进行定量,21,平台,PCR,仪介绍,Rotor-Gene 6000,特征：,36,孔（,0.2mlPCR,管）或者,72,孔（特殊,0.1mlPCR,管），离心式检测,22,平台,PCR,仪介绍,Applied Biosystems 7500,特征：可以使用,96,孔板，样品量大，也可以使用,8,连管,23,PCR,扩增原理,24,Real-time PCR,探针工作原理,25,谢 谢！,26,