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2022人工卵巢技术的研究进展(全文)
人工卵巢是以组织工程学为基础，可以用来改善和恢复早发性卵巢功能不 全(premature ovarian insufficiencyPOI)女性和恶性肿瘤女性卵巢功能 的新型治疗手段，从恶性肿瘤女性的卵巢中分离原始卵泡并转移至支架建 立人工卵巢，将消除恶性细胞传播的风险。人工卵巢技术需要从冷冻卵巢 组织中分离出来的卵泡和其他提供生长因子的卵巢细胞，还需要具有生物 相容性、低炎症反应、利于血管新生、易于降解且不会干扰卵泡生长和迁 移的输送支架。对人工卵巢移植后功能的跟踪和评估也至关重要，从治疗 的角度来看，这种方法比单纯的卵泡移植或卵巢组织移植更有效，可以减 少或避免缺血导致的坏死。对于POI女性，人工卵巢的支架结构可以作为 卵巢体外激活(in vitro activation IVA)过程中切割后的卵巢碎片的转运 载体，用以改良IVA。
一、卵巢组织的冻存与卵泡的分离和培养
大多数的卵泡位于卵巢皮质，可以低温冻存小体积的卵巢皮质，然而，为 了获得足够大的卵泡池，在癌症治疗前切除整个卵巢更加合理。卵巢组织 的冷冻方法包括慢速冷冻法和玻璃化冷冻法。慢速冷冻法在组织冻融过程 中，形成的冰晶会对细胞造成损伤，对细胞数量多、间隙大的卵巢组织影 响更大，冷却速度也受到器官尺寸和形状的限制，而且很难在有限的时间 内将冷冻保护剂均匀地输送到所有细胞中。在近十年中，玻璃化冷冻法已 经逐渐取代慢速冷冻法作为主要的冷冻保存方法。玻璃化冷冻不需要昂贵 的设备，只需几秒钟就能将卵母细胞或胚胎暴露于冷冻保护剂中，使用高 浓度的冷冻保护剂和超速冷却方法可以防止卵母细胞或胚胎内外形成冰 晶，与慢速冷冻法相比，玻璃化冷冻法有助于提高细胞活力并减少解冻复 苏后的损害。目前，对以玻璃化冷冻为基础的卵巢组织的冷冻保存技术的 研究越来越多，仍需更多的证据去证实玻璃化冷冻技术中的高浓度冷冻保 护剂的安全性与有效性。
机械分离合并胶原酶治疗被广泛应用于从卵巢组织中分离卵泡，胶原酶的 处理有助于分离出更多的卵泡，但会破坏卵泡基底膜，影响卵泡的存活和 生长。Fattahi等对猪卵泡的研究发现，使用释放酶dispase high分离卵 泡可能是一种更好的方法，其可以分离出更多形态和质量更好的窦前卵泡， 还可以观察到覆盖部分卵泡表面的卵泡膜细胞。为了降低癌症女性恶性细 胞再植的风险，分离过程中需要对卵泡进行多次清洗。卵泡分离后，需要 确定放置在支架中卵泡的类型和数量，但存活且形态及颗粒细胞层完整的 卵泡检出率不理想，这需要进行更多的研究。在人工卵巢技术中，相较于 初级卵泡，移植次级卵泡的成活率更高。在3D环境中培养的卵泡保留了 卵泡结构，促进了卵泡和细胞间的相互作用。水凝胶，如聚乙二醇等材料 通过分离、封装和培养，提供了类似于软组织的3D环境，允许营养物质 的扩散，并且可以很容易地呈递生物信号，细胞通过旁分泌和旁分泌相互 作用进一步促进卵泡在体外的存活和生长。
二、人工卵巢支架的材料
制备输送卵泡或卵巢组织的支架是人工卵巢技术的关键。支架的材料需要 具备以下条件：支持卵泡植入、良好的生物相容性、温度适宜性、支持卵 泡的增殖和迁移、可降解性、提供氧气和生成营养血管的能力。
1. 一般材料：
脱细胞卵巢支架能支持人卵泡的存活和小鼠卵泡的生长，十二烷基硫酸钠 可以有效去除小鼠卵巢组织中的DNA和细胞内成分，有利于避免移植后 的免疫反应，但这也显著降低了剩余卵巢细胞外基质的完整性。而去氧胆 酸钠是一种温和的"洗涤剂"，能更好地保护卵巢的细胞外基质，并可能改 善再细胞化。这两种新型的小鼠卵巢支架可作为未来卵巢生物工程试验的 候选支架。
纤维蛋白是一种具有应用前景的人工卵巢基质材料，可以支持分离后的人 卵泡。当纤维蛋白中添加血管内皮生长因子时，可促进血管形成。新鲜卵 巢髓质是提供旁分泌环境的最佳细胞来源之一，卵巢组织中的内皮细胞在 卵泡发育过程中有助于新生血管的形成。因此，非恶性肿瘤女性移植卵泡 时应考虑联合应用新鲜卵巢髓质中的基质细胞和内皮细胞，以改善人工卵 巢的功能。
2. 干细胞材料：
人工卵巢中加入干细胞成分可能会增强卵巢的功能。有研究表明，干细胞
治疗可以恢复卵巢早衰动物模型中卵巢的结构和功能，为POI提供了一种 有效的治疗方法。脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC)可以增加卵泡数量，减少颗粒细胞凋亡， 改善POI模型鼠的卵巢功能。BMSC具有更有利的增殖能力，并可以向卵 巢特异性细胞分化。人脐带间充质干细胞在存在胶原的情况下，可减少卵 巢细胞凋亡，增加卵巢上皮细胞的生成，改善卵巢功能。Yang等将人脐 带间充质干细胞嵌入胶原蛋白基质后移植到POI模型鼠体内2周后，观察 到激素水平和卵泡数量的明显上升，并在移植物中检测到颗粒细胞的增殖 和卵巢血管的生成。经血源间充质干细胞(menstrual blood mesenchymal stem cells，MenSCs) 参与 了细胞外基质依赖的 FAK/AKT 信号通路中卵巢转录表达的激活，可以在一定程度上恢复卵巢功能。有研 究结果表明，MenSCs可促进体外培养的大鼠卵巢中早期卵泡的增殖，抑 制卵泡凋亡，在体内，MenSCs有效促进POI大鼠卵泡发育，恢复动情周 期和血清性激素水平，提高活产率。有研究认为，人工卵巢与干细胞结合 模拟自然卵巢可以作为乳腺癌患者保存生育力的首选策略。干细胞联合人 工卵巢给有生育需求的癌症女性带来了巨大的希望。
3. 人工卵巢的"添加剂"：
生长因子，如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子，可以促进人工卵巢在体内的血管生成 和减少细胞凋亡。Shikanov等将卵巢组织与VEGF 一并加入纤维蛋白凝 胶后移植回双侧卵巢切除的小鼠体内，2周后含有VEGF凝胶的存活卵泡 和血管的数量是对照组的2倍。
细胞凋亡抑制因子1-磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate，S1P)可以 促进细胞生长和抑制细胞凋亡。Soleimani等将人类卵巢连同S1P共同移 植到严重联合免疫缺陷小鼠体内，观察10 d后发现移植物中卵巢的血管 密度、血管生成数和卵巢基质细胞增殖显著增加，卵泡的凋亡下降。此外， 通过带有细胞外基质材料的支架，肝素结合肽、肝素和VEGF修饰的S1P 与纤维蛋白共同作用，使人工卵巢技术在生育力保护方面取得了重要进展。
三、人工卵巢的3D生物打印
3D生物打印是一种新兴的添加剂制造技术，其可一层一层折叠以生成组 织模拟结构。由于在微尺度、高通量和细胞沉积方面的优势，生物打印已 经成为创建复杂的微观和宏观生物医学系统的强大制造工具，用于制造人 体组织的3D细胞载体。制作3D单元加载结构生物印刷最常用的生物打 印系统基于三种主要策略：喷墨、激光和挤压。印刷的生物材料称为"生物 墨水"，将提供足够的打印保真度和机械性能所需的属性，以确保沉积后的 打印性和长期功能。3D打印技术在心血管、肌肉、神经等系统有广泛的 应用，并能产生有效的生物学功能。
四、人工卵巢的移植 移植手术后的主要问题是免疫排斥和缺血性损伤，由于人工卵巢中移植的 卵巢细胞是自体来源，不会产生严重的免疫排斥反应，但个体对于生物材 料的免疫反应仍然是面临的难题。Laronda等从冷冻保存的人类卵巢组织 中分离出卵泡，打印支架形成人工卵巢，并将其移植至去卵巢的成年小鼠 的肾包膜下，7只进行移植的小鼠中有6只在移植4周内恢复了激素循环。 另有研究将携带原始卵泡和初级卵泡的人工卵巢移植在小鼠阔韧带内并 进行缝合，使小鼠实现了自然妊娠。
如果将人工卵巢移植在腹膜内侧，需用手术刀刮伤腹膜表面，以诱导血管 生成。有研究证实人卵巢移植手术至少7 d前在移植部位边缘进行电凝可 诱导血管生成。为减少移植过程中的缺血一再灌注损伤，通过动物模型做 出了各种尝试，目前研究仍处于动物试验阶段，采用褪黑素处理宿主，用 富含透明质酸的生物胶加入血管内皮生长因子A和维生素E孵育后，细胞 的凋亡明显减少，用维生素E和促性腺激素对宿主进行治疗，移植效果更 好。
五、人工卵巢的应用前景
保护POI女性和育龄期恶性肿瘤女性生育力，以及改善其生活质量在世界 范围内受到了广泛关注，人工卵巢技术可能发挥巨大的作用°poi是指女 性在40岁前出现卵巢功能衰退，主要的临床表现包括低雌激素和不孕，
POI在小于30岁的女性中发病率约为0.1%，在30~40岁的女性发病率 约为1.0%。在卵巢功能衰退初期，妊娠率仅有5%~10% ，严重影响了 POI 患者的受孕能力。POI的传统治疗方法包括激素治疗、中药、辅助生殖技 术等，近年来对IVA治疗POI的研究越来越多，Fabregues等将POI女 性卵巢部分皮质切除并碎片化后移植到对侧卵巢和卵巢附近的腹腔中，利 用辅助生殖技术使POI女性成功妊娠。尽管已有健康胎儿通过IVA出生， 但仍需优化技术、提升效率并降低其可能带来的潜在风险以确保IVA程序 的安全性。希望人工卵巢技术可以通过组织工程学技术设计出低免疫原性、 易于降解、并能发挥重要生物学功能的运输支架，移植后改善POI患者的 卵巢功能并实现自然妊娠。
现今癌症仍然是全球最严重的健康问题之一，抗癌治疗后出现的卵巢内分 泌功能紊乱、卵巢储备功能下降等导致了育龄期女性生育力的丧失，随着 肿瘤患者的生存率逐渐提高，年轻女性抗癌治疗后的卵巢功能及生活质量 不容忽视，在癌症女性保存生育力的方法中，卵巢组织玻璃化冷冻的方法 较好。卵巢组织冻存与移植是对于治疗时间紧迫或不能接受促排卵治疗的 恶性肿瘤女性最佳的生育力保存方法之一，也是青春期前癌症女性和对激 素敏感的恶性肿瘤女性的不二选择，但卵巢组织冻存与移植存在恶性细胞 再回输的可能，有报道称，急性白血病的女性，在移植卵巢组织的同时发 生恶性细胞再植的风险较高。当人工卵巢技术成熟后，将使有生育要求的 癌症女性在肿瘤治疗后获得生育的希望。
六、展望
1. 干细胞3D打印:
干细胞3D打印是以"生物打印"为手段，以干细胞和生物材料重建人体组 织或器官的跨学科领域的新型再生医学工程技术，利用可负载干细胞并提 供良好生长环境的生物材料通过3D打印的技术能快速、精准地制备出具 有生理功能的组织结构。干细胞生物3D打印技术不仅可以为患者提供个 性化、精准化治疗，还可快速化、批量化生产，展望人类安全的生物工程 卵巢的未来，用自体来源的诱导多能干细胞培养的脱细胞卵巢支架可能是 癌症和POI女性进行个体化卵巢移植的关键。有研究报道，将自体间充质 干细胞移植到卵巢可恢复POI女性的卵巢功能并实现妊娠。但在未来仍然 需要大量试验进行干细胞生物3D打印的研究。
2. 有氧支架：
有研究将大量的过氧化钙纳米颗粒嵌入能够产生氧气的由多聚癸二酸甘 油酯和聚己内酯组成的混合聚合物基质中形成有氧支架，复合支架显示出 光滑的纤维结构，同时提供持续数天到1周的氧气，改善了缺氧环境和细 胞代谢活性。复合支架也表现出良好的抗菌性能，与降解行为等其他功能 相结合，可能成为组织工程和伤愈合应用中有前景的生物材料。
3. 其他生物材料：
有研究将来源于动物卵巢中天然存在的胶原蛋白作为生物材料，通过3D 打印在载玻片上打印各种重叠的凝胶纤维图案来构建卵巢支架，随后将小 鼠的早期卵泡植入这些支架，实现了卵泡的体外存活。30° 和60°支架提供 多个侧面包围卵泡，更有利于卵泡与支架的相互作用，提高支架血管化程 度，随着支架交互作用的增加，卵泡的非正常发育被抑制，存活率上升。 2019年该研究团队通过绘制与人类卵泡发育最为相似的猪卵巢结构蛋白 的位置图，鉴定了出了 42种在深度上有显著差异的基质蛋白，为开发3D 打印人造卵巢提供了可靠的"墨水"来源。随着3D打印卵巢的出现，人工 卵巢在未来可以帮助更多的POI和癌症女性实现生育愿望。
七、小结
生育力的保护对POI或患恶性肿瘤的育龄期女性有着非常重要的意义。人 工卵巢尚需在人体中进行测试，需要仔细规划以避免DNA突变的发生， 如果不能证明基因和生理的安全性，将引发对人工卵巢的科学和道德关注。 干细胞3D打印技术有着良好的发展前景和巨大的社会价值，需要更多的 研究进行探索。另一方面，昂贵的医疗费用也是人工卵巢实施的阻碍，建 立标准化生产人工卵巢将成为降低其成本的战略问题，使更多有临床需求 的患者受益。