流式细胞术dun.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,第六章 流式细胞术,第六章 流式细胞术,第一节 流式细胞术概述,第二节 流式细胞术发展简史,第三节 流式细胞仪主要技术指标,第四节 流式细胞仪主要构造和工作原理,第五节 流式细胞术常规检测时的样品制备,第六节 流式细胞计的调试和使用,第七节 流式细胞术的应用,第一节 流式细胞术概述,流式细胞术,(FlowCytometry,，,FCM),是上世纪七十年代发展起来的高科学技术，它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体，同时具有分析和分选细胞功能。,可测量细胞大小、内部颗粒的性状，还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内,DNA,、,RNA,含量等,;,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析，在短时间内检测分析大量细胞，并收集、储存和处理数据，进行多参数定量分析；能够分类收集,(,分选,),某一亚群细胞，分选纯度大于,95%,。,FCM,特点,测量速度快，最快可在,1,秒种内计测数万个细胞；,可进行多参数测量，可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量，并具有明显的统计学意义；,是一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术、计算机技术、流体力学、细胞化学、图像技术等从多领域的知识和成果；,既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。,FCM,发展的水平凝聚了半个世纪以来人们在这方面的心血和成果，在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等基础学科和医学、检验学等应用学科得到广泛应用。,目前使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生产：,BECKMAN-COULTER,公司和,Becton-Dickinson,公司,(,简称,B-D,公司,),。,流式细胞仪主要有两型：临床型（又称小型机、台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。综合型除具备检测分析功能外，还具有细胞分选功能，多用于科学研究。,第二节 流式细胞术发展简史,1934,年，,Moldavan,首次提出了使悬浮的单个血红细胞等流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置计测的设想，在此之前，人们还习惯于测量静止的细胞，因为要使单个细胞顺次流过狭窄管道容易造成较大的细胞和细胞团块的淤阻。,1953,年,Crosland-Taylor,根据雷诺对牛顿流体在圆形管中流动规律的研究认识到：,管中轴线流过的鞘液流速越快，载物通过的能力越强，并具有较强的流体动力聚集作用。,于是设计了一个流动室，使待分析的细胞悬浮液都集聚在圆管轴线附近流过，外层包围着鞘液；细胞悬浮液和鞘液都在作层液。这就奠定了现代流式细胞术中的液流技术基础。,1956,年，,Coulter,在多年研究的基础上利用,Coulter,效应生产了,Coulter,计数器。其基本原理是：使细胞通过一个小孔，只在细胞与悬浮的介质之间存在着导电性上的差异，便会影响小孔道的电阻特性，从而形成电脉冲信号，测量电脉冲的强度和个数则可获得有关细胞大小和数目方面的信息。,1967,年,Holm,等设计了通过汞弧光灯激发荧光染色的细胞，再由光电检测设备计数的装置。,1973,年,Steinkamp,设计了一种利用激光激发双色荧光色素标记的细胞，既能分析计数，又能进行细胞分选的装置。这样就基本完成了现代,FCM,计数技术的主要历程。,现代的,FCM,数据采集和分析技术是从,组织化学,发源的。,1965,年，,Kamentsky,在,组织化学,的基础上提出了两个新设想：,(1),细胞的组分是可以用光度学来定量测定的，即分光光度术可以定量地获得有关细胞组织化学的重要信息。,(2),细胞的不同组分可以同时进行多参数测量，从而可以对细胞进行分类。,Kamentsky,不仅思路敏捷，而且能身体力行。他是第一个把计算机接口接到仪器上并记录分析了多参数数据的人，也是第一个采用了二维直方图来显示和分析多参数的人。,流式细胞术在,细胞化学,中的应用的先驱者是,Van Dilla,和美国的,Los Alamos,小组。,1967,年该研究组研制出流液束、照明光轴、检测系统光轴三者相互正交的流式细胞计的基础上，首次用荧光,Feulgen,反应对,DNA,染色显示出,DNA,的活性与荧光之间存在着线性关系，并在,DNA,的直方图上清楚地显示出细胞周期的各个时相。,Gohde,和,Dittrich,接着把这项技术推向实用，他们用流式细胞术测定细胞周期借以研究细胞药代动力学问题。,FCM,用于免疫组织化学中的关键是对细胞进行免疫荧光染色，其它和在细胞化学的应用并没有多大差异。,第三节 流式细胞仪主要技术指标,3.1,流式细胞仪的分析速度,3.2,流式细胞仪的荧光检测灵敏度,3.3,前向角散射（,FSC,）光检测灵敏度,3.4,流式细胞仪的分辨率,3.5,流式细胞仪的分选速度,3.1,流式细胞仪的分析速度,一般流式细胞仪每秒检测,1000,5000,个细胞，大型机可达每秒上万个细胞。,3.2,流式细胞仪的荧光检测灵敏度,最多能测出单个细胞上达,600,个的荧光分子，两个细胞间的荧光差大于,5%,即可区分。,3.3,前向角散射（,FSC,）光检测灵敏度,前向角散射反映被测细胞的大小，一般流式细胞仪能够测量到,0.2m,0.5m,。,3.4,流式细胞仪的分辨率,用变异系数,CV,值来表示，一般流式细胞仪能够达到低于,2.0%,，这也是测量标本前用荧光微球调整仪器时要求必须达到的。,3.5,流式细胞仪的分选速度,一般流式细胞仪分选速度大于,1000,个,/,秒，分选细胞纯度可达,99%,以上。,第四节 流式细胞仪主要构造和工作原理,4.1,流动室及液流驱动系统,4.2,激光光源及光束形成系统,4.3,光学系统,4.4,信号系统（检测、存储、显示和分析）,4.5,细胞分选系统,流式细胞仪结构示意图,4.1,流动室及液流驱动系统,流动室,(FlowCell,或,FlowChamber),是流式细胞仪的核心部件,流动室由石英玻璃制成,单细胞悬液在细胞流动室里被鞘流液包绕通过流动室内的一定孔径的孔,检测区在该孔的中心，细胞在此与激光垂直相交，在鞘流液约束下细胞成单行排列依次通过激光检测区。,流动室孔径有,60m,、,100m,、,150m,、,250m,等多种，供检测者选择。小型仪器一般固定装置了一定孔径的流动室。,流动室里的鞘液流一般是稳定流动，控制鞘液流的装置是在流体力学理论的指导下由一系列压力系统、压力感受器组成。,调整好鞘液压力和标本管压力,鞘液流包绕样品流并使样品流保持在液流的轴线方向，能够保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而使激光激发的荧光信息准确无误。,4.2,激光光源及光束形成系统,流式细胞仪的主要测定信号荧光是由激发光激发的，荧光信号的强弱与激发光的强度和照射时间相关。,激光是一种相干光源，能提供单波长、高强度、高稳定性的光照。,流式细胞仪可配备一根或多根激光管，常用氩离子气体激光管（波长,488nm,），此外可配备氦氖离子气体激光管（波长,633nm,）和,/,或紫外激光管。,在激光光源和流动室之间有两个圆柱形透镜，将激光光源发出的横截面为圆形的激光光束聚焦成横截面较小的椭圆形激光光束,(22m66m),椭圆形激光光斑内激光能量成正态分布，使通过激光检测区的细胞受照强度一致。,4.3,光学系统,流式细胞仪的光学系统由若干组透镜、小孔、滤光片组成，可分为流动室前和流动室后两组。,流动室前的光学系统由透镜和小孔组成，透镜和小孔（一般为,2,片透镜、,1,个小孔）的主要作用是将激光光源发出的横截面为圆形的激光光束聚焦成横截面较小的椭圆形激光光束，使激光能量成正态分布，使通过激光检测区的细胞受照强度一致，最大限度的减少杂散光的干扰。,流动室后的光学系统主要由多组滤光片组成，滤光片的主要作用是将不同波长的荧光信号送到不同的光电倍增管。,滤光片主要有三类：,长通滤片,(LP),只允许特定波长以上的光线通过。,短通滤片,(SP),只允许特定波长以下的光线通过。；,带通滤片,(BP),只允许特定波长的光线通过。,不同组合的滤片可以将不同波长的荧光信号送到不同的光电倍增管,(PMT),，如接收绿色荧光,(FITC),的,PMT,前面配置的滤光片是,LP550,和,BP525,，接收色橙红色荧光,(PE),的,PMT,前面配置的滤光片是,LP600,和,BP575,，接收红色荧光,(CY5),的,PMT,前面配置的滤光片是,LP650,和,BP675,。,4.4,信号系统（检测、存储、显示和分析）,当测定标本在鞘流液的约束下，细胞成单行排列依次通过激光检测区时，产生散射光和荧光信号。,散射光分为：,前向角散射或,0,散射,（,ForwardScatter,，,FS,）,侧向角散射或,90,散射,（,SideScatter,，,SS,）,。,散射光是细胞的物理参数，与细胞样本的制备,(,如染色,),无关。,前向角散射,(FS),反映被测细胞的大小，它由正对着流动室的光电二极管装置，接收并转变为电信号。,侧向角散射,(SS),反映被测细胞的细胞膜、细胞质、核膜的折射率和细胞内颗粒的性状，它由一个光电倍增管,(PMT),接收并转变为电信号，这些电信号存储在流式细胞仪的计算机硬盘或软盘内。,荧光信号也有两种：,一种是细胞自发荧光，它一般很微弱。,一种是细胞样本经标有特异荧光素的单克隆抗体染色后，经激光激发发出的荧光，它是我们要测定的荧光，荧光信号较强。,这两种荧光信号的同时存在是我们测定时需要设定阴性对照的理由，以便从测出的荧光信号中减去细胞自发荧光和抗体非特异结合产生的荧光。,流式细胞仪测定常用的荧光染料有多种，其分子结构不同，激发光谱和发射光谱也各异，选择荧光染料时必须依据流式细胞仪所配备的激光光源的发射光波长。,如氩离子气体激光管，它的发射光波,488nm,。,氦氖离子气体激光管发射光波长,633nm,。,488nm,激光光源常用的荧光染料有,FITC,（异硫氰酸荧光素）、,PE,（藻红蛋白）、,PI,（碘化丙啶）、,CY5,（化青素）、,preCP(,叶绿素蛋白,),、,ECD(,藻红蛋白,-,得克萨斯红,),等。,各种荧光信号由各自的光电倍增管,(PMT),接收并转变为电信号后，存储在流式细胞仪的计算机硬盘或软盘内。,信号存储时，数据一般是以,Listmode,（列表排队）方式存入的。,采用,Listmode,方式有两大优点：节约内存和磁盘空间；易于加工处理分析。,Listmode,方式数据缺乏直观性，数据的显示和分析一般采用一维直方图、二维点阵图、等高线图和密度图等。,(1),单参数数据显示和分析,细胞的每一个单参数测量数据用直方图来显示,横坐标表示散射光或荧光信号相对强度值，其单位是道数，可以是线性的，也可以是对数的,纵坐标表示细胞数。,(2),双参数数据显示和分析：,细胞的双参数测量数据和细胞数量的关系用一维直方图、二维点阵图、假三维地形图、等高线图和密度图显示和分析。,二维点阵图,前向散射光（,FS,）和侧向散射光（,SS,）组成的点阵图，横坐标和纵坐标均是线性的，图中的细胞可以很容易地圈“门”,(Bitmap,，无定型门,),，从而分析各亚群细胞的数据,假三维地形图,X,轴：,SSC,；,Y,轴：,FSC,；,Z,轴：细胞数。仪器的计算机很容易给出两种荧光的测定值：阴性细胞,%,、两种荧光各自的阳性细胞,%,、两种荧光的双阳性细胞,%,、各群细胞的平均荧光强度等。,等高线图,分别是测定细胞的两种荧光双参数数据，横坐标和纵坐标分别代表一种荧光参数，同理只要设定“十字门”就可得到两种荧光的各种测定值，密度图和等高线图较点阵图更直观。,(3),三参数数据显示和分析：,细胞的三参数测量数据和细胞数量的关系每两个数据组成一对（三参数测量数据和细胞数量每两个数据可组成,6,对数据）用一维直方图、二维点阵图、等高线图和密度图显示和分析。,三个荧光数据关系可以用分光图（,prism,）表示，分光图可直接给出,8,个数据（如,ABC,代表,3,种荧光，可有,A,+,B,+,C,+,、,A,+,B,+,C,-,、,A,-,B,+,C,+,、,A,+,B,-,C,+,、,A,+,B,-,C,-,、,A,-,B,+,C,-,、,A,-,B,-,C,+,、,A,-,B,-,C,-,）。,列表模式其实只是多参数数据文件的一种计算机存贮方式,三个以上的参数数据显示是用多个直方图、二维图和假三维图来完成的。,可用,List Mode,中的特殊技术，开窗或用游标调出相关部分再改变维数进行显示。例如，“一调二”就是在一维图上调出二维图来；“二调一”就是从二维图中调出一维图来。下图给出了从二维图等高图中调出相应窗口的直方图的示意图。,从二维图设窗调出直方图示意,4.5,细胞分选系统,如果在细胞流动室上装有超声压电晶体，通电后超声压电晶体发生高频震动，可带动细胞流动室高频震动，使细胞流动室里喷嘴流出的液流束被连续分断成一连串均匀的液滴，每秒钟形成液滴上万个。,每个液滴中包含着一个样品细胞，液滴中的细胞在形成液滴前已被测量，如符合预定要求则可被充电，在通过偏转板的高压静电场时向左或向右偏转被收集在指定容器中；不含细胞液滴或细胞不符合预定要求液滴不被充电，亦不发生偏转而进入中间废液收集器中，从而实现了分选。,第五节 常规检测时的样品制备,5.1,直接免疫荧光标记法,5.2,间接免疫荧光标记法,5.3,最小化非特异性结合的方法,5.1,直接免疫荧光标记法,取一定量细胞,(,约,1,10,6,细胞,mL),，在每一管中分别加入,50l,的平衡盐缓冲液，并充分混匀，于室温中静置,1,分钟以上，再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应（如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入），孵育,20-60,分钟后，用,PBS(pH7.2-7.4),洗,12,次，加入缓冲液重新悬浮，上机检测。,优点：操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群的多参数的同时测定。虽然直标抗体成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，更适用于临床标本的检测。,5.2,间接免疫荧光标记法,取一定量的细胞悬液,(,约,1,10,6,细胞,mL),，先加入特异的第一抗体，待反应完全后，洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原,-,抗体,-,抗抗体复合物，以,FCM,检测激发荧光。,优点：费用较低，二抗应用广泛，多用于科研。,缺点：二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。,5.3,最小化非特异性结合的方法,(1),荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增高。,(2),在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白,（如小牛血清蛋白,(BSA),、或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体）,一起培育，这个步骤通过阻断,（封阻）,第一抗体和细胞表面或胞内结构的非特异性交互作用来降低背景。,(3),在使用第一抗体之后，将样品与,5%,至,10%,的来自于同一寄主的正常血清和作为标记的第二抗体一起培育，这个步骤会减少不必要的第二抗体与第一抗体、细胞表面或胞内结构之间的交互作用。,用来自于同样的样品的血清稀释标记过的抗体可以略过此步骤。,此步骤也可能引入不良影响。,(4),使用,F(ab),2,片段会使背景决定于第一或第二抗体与,FC,受体的全分子结合。,大多数的第二抗体的,F(ab),2,片段容易利用。而第一抗体的,F(ab),2,片段一般是不能利用或很难制作。,在,NaN,3,存在的条件下，将新鲜组织或细胞与正常血清一起培育应选择优先加入第一抗体。在此情况下，即使在随后的步骤中用完所有的抗体分子，,FC,受体决定的背景影响已不再重要。,(5),其它,已标记的抗体和其他一些内在的免疫球蛋白或加入实验系统中的其它物质的交叉反应也可能会有背景影响。,为了降低背景，在多重标记过程中，所有的已标记的抗体应被吸附，避免其他种类蛋白的交叉反应。,第六节 流式细胞计的调试和使用,6.1,调试和校准,6.2,仪器的操作和使用,6.1,调试和校准,流式细胞计在使用前，甚至在使用过程中都要精心进行调试，以保证工作的可靠性和最佳性。,调试的项目主要是激光强度、液流速度和测量区的光路等。,激光强度：除调整反射镜的角度以调整到所需波长的激光出光外，还要结合显示屏上的光谱曲线使激光的强度输出为最大。,液流速度：可通过操作台数字显示监督，调节 气体压力大小以获得稳定的液流速度。,测量区光路调节：这是调试工作的关键。需要保证在测量区的液流、激光束、,90,散射测量光电系统垂直正交，而且交点较小。一般可在用标准荧光微球等校准中完成。,6.2,仪器的操作和使用,打开电源，对系统进行预热；,打开气体阈，调节压力，获得适宜的液流速度；开启光源冷却系统；,样品管中加入去离子水，冲洗液流的喷嘴系统；,利用校准标准样品，在激光功率、光电倍增管电压、放大器电路增益调定的基础上，,0,和,90,散射的荧光强度最强，并要求变异系数为最小；,选定流速、测量细胞数、测量参数等，同时选择计算机屏上数据的显示方式；,样品测量完毕后，用去离子水冲洗液流系统；,关闭气体、测量装置，用计算机进行数据处理；,将所需结果打印出来。,在操作和使用中一定要注意如下事项：,光电倍增管要求稳定的工作条件，暴露的较强的光线下以后，需要较长时间的“暗适应”以消除或降低部分暗电流本底才能工作；另外还要注意磁屏蔽；,光源不得在短时间内,(,一般要,1h,左右,),关上又打开；使用光源必须预热并注意冷却系统工作是否正常；,液流系统必需随时保持液流畅通，避免气泡栓塞，所使用的鞘流液使用前要经过过滤、消毒；,注意根据测量对象的变换选用合适的滤片系统、放大器的类型等；,特别强度每次测量都需要对照组。,第七节 流式细胞术的应用,7.1,细胞内细胞因子的检测,7.2,流式细胞术分析血小板,7.3,细胞凋亡研究,7.1,细胞内细胞因子的检测,1,、概述,检测单个细胞特定细胞因子的表达手段包括：,ELISPOT,、原位杂交、免疫细胞化学、限制性稀释分析（,limiting dilution analysis,，,LDA,）和单细胞,PCR,等。,原位杂交和免疫组化观察细胞因子蛋白表达及,mRNA,表达，可以识别,Th1,和,Th2,细胞，能够可获得较强的细胞内信号，但工作量大、主观性强，难以大样本检测，且人肉眼识别能力有很大的局限性。,ELISPOT,及单细胞,PCR,技术，技术性强、劳动强度大，难以进行广泛推广。,自然状态下，,T,淋巴细胞产生少量的细胞因子，通常要对,T,淋巴细胞体外活化进行研究。在体外刺激过程中，,T,淋巴细胞产生的细胞因子已释放出来，胞内细胞因子信号较弱，难以进行检测。,Jung,与,Picker,采用,Monensin,、,PMA,等药物预孵，用,Brefeldin(BFA),、,Monensin,阻断胞内高尔基体介导的转运，使得细胞因子聚集、蓄积，增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。,胞内流式分析法,用抗细胞因子抗体与细胞表面或胞内特定亚群标志组合，即可检测不同细胞亚群细胞因子的分泌。,同时采用特殊的化学与抗体选择，确保静止与无细胞因子分泌细胞的最小荧光背景。,2,、常用的标本类型和处理方法,全血,使用肝素钠抗凝的真空采血管采血，不宜采用肝素锂、,EDTA,和,ACD,抗凝剂。,血样在,8,小时内分析，超过,8,小时会导致活性的损失，一般细胞因子阳性细胞会减少,5%,。,如不能在,8,小时之内检测，应将真空采血管水平放置于室温。,4,、所需试剂,(1),细胞表面染色的荧光标记的单抗试剂,依据实验需要选择特殊表面标志：,CD45,圈定所有淋巴细胞；,CD3,圈定,T,淋巴细胞；,CD4,圈定,T,辅助淋巴细胞亚群；,CD8,圈定,T,抑制淋巴细胞亚群；,CD19/,或,CD20,圈定,B,淋巴细胞；,CD56,圈定,NK,淋巴细胞；,CD14,圈定单核细胞。,(2),荧光标记的细胞因子抗体：,FITC,、,PE,和,APC,标记的细胞因子抗体。,(3),溶血素：用外周全血检测时需使用溶血素溶解红细胞。,(4),激活剂,Phorbol 12-Myristate 13 Acetate(PMA),，配置储液分装，,-20,储存，勿反复冻融，每次实验稀释储存液。,Ionomycin,于,-20,储存，实验时稀释储存液。,Staphylococcal enterotoxin B(SEB),，,4,储存。,CD3,：包被在培养板中，在蛋白转运抑制剂存在下活化未稀释的血液细胞。,CD28,：加速不同刺激剂（包括,SEB,、,CD3,等）的活化效应。,(5),阻断剂,阻断高尔基体介导的转运作用，使得刺激细胞表达的细胞因子聚集在胞浆内。,Brefeldin-A(BFA),分装，,-20,储存，勿反复冻融，实验使稀释储存液。,Monensin,(6),不含谷氨酰胺的,RPMI-1640,。,(7),固定剂：含,4%,的多聚甲醛,PBS,溶液。细胞在体外刺激后需要对细胞进行固定。固定的目的在于通过蛋白的交联和变性一方面使细胞因子固定在细胞内，另一方面避免细胞表面抗原丢失。,(8),破膜剂：含,1%,皂甙、,0.05%,叠氮化钠的,Hanks,溶液,(HBBS),。将细胞膜穿孔，已利于荧光标记的细胞因子抗体进入细胞内，于相应的细胞因子结合,.,(9),其它试剂：无菌无叠氮钠,PBS,、乙醇、含,1%,多聚甲醛的,PBS,，,4,储存。,5,、细胞培养和刺激的基本方法,细胞活化的最终结果是产生细胞因子，根据检测指标和标本的不同，选择不同的刺激剂和刺激时间，以获得最佳的实验结果。,为防止细胞内细胞因子分泌到胞外，在培养的最后,4-6,个小时，需要使用蛋白转运抑制剂,(,如,3uM monensin,，,10mg/ml,的,BFA),检测细胞因子,阳性对照刺激方法,人,IFN-,方法,2(4-24,小时,),人,TIMP-1,方法,5,人,TNF-,方法,7(6,小时,),人,IL-1,方法,3(6,小时,),人,IL-1,方法,3(24,小时,),人,IL-2,方法,2(4-24,小时,),人,IL-4,方法,4,人,IL-5,方法,1,人,IL-6,单核细胞：方法,3(6-12,小时,),；,T,细胞：方法,6,人,IL-10,方法,1,检测细胞因子,阳性对照刺激方法,人,IL-12,方法,8,人,IL-15,方法,3,人,Fractalkine/CX3CL1,方法,1,人,IL-8/CXCL8,方法,3(24,小时,),人,MCP-1/CCL2,方法,3(24,小时,),人,MIP-1,/CCL3,方法,3(24,小时,),人,MIP-1,/CCL4,方法,3(24,小时,),人,RANTES/CCL5,方法,1,小鼠,IL-2,方法,9,小鼠,IL-4,方法,10,小鼠,IL-5,方法,10,小鼠,IL-6,方法,11,小鼠,IFN,方法,9 or,方法,12,小鼠,TNF-,方法,9,细胞内细胞因子流式检测推荐的阳性对照活化方法,方法,1,：只使用转染细胞检测；,方法,2,：人的,PBMCs,使用,PMA(10 ng/ml),和,Ionomycin(1 uM),刺激,4-24,小时；,方法,3,：人的,PBMC,使用,LPS(0.5-1 ug/ml),刺激,24,小时；,方法,4,：人的,PBMCs,或者纯化的,CD4+,细胞在包被人,CD3,抗体的培养板中，使用含有重组人的,IL-2,（,10 ng/ml,）和,IL-4,（,10 ng/ml,）的培养基培养两天；细胞洗涤后在含有重组人,IL-2,和,IL-4,的培养基中继续培养,2,天；最后收获细胞，使用,PMA(10 ng/ml),和,Ionomycin(1 uM),刺激,6,小时；,方法,5,：,CD4+T,细胞使用,PHA(10 ng/ml),刺激,4,天；,方法,6,：,T,细胞使用抗,CD3,的单抗、抗,CD28,的单抗和重组人的,IL-1,(Clin Immuno Immunopath 70:1),；,方法,7,：使用,PMA(50 ng/ml),和,Ionomycin(500 ng/ml),刺激；,方法,8,：将,PBMCs,细胞使用重组人,IFN(10 ng/ml),刺激,2,小时，后使用,IFN(10 ng/ml)+LPS(1 ug/ml),刺激,22,小时或者使用相同的方法刺激,THP-1,细胞；,方法,9,：,EL4,在包被抗小鼠,CD3,抗体,(25 ug/ml),的培养板中，使用抗,CD28,抗体,(2 ug/ml)+PMA(5 ng/ml)+Ionomycin(500 ng/ml),刺激,6,小时；,方法,10,：,CD4+T,细胞在包被小鼠,CD3(25 ug/ml),抗体的培养板中，使用含有抗小鼠的,CD28(2 ug/ml),的抗体，重组小鼠的,IL-2,（,10 ng/ml,）和,IL-4,（,50 ng/ml,）的培养基培养两天；然后在含有重组小鼠,IL-2,和,IL-4,的培养基中继续培养,3,天；最后收获细胞，使用,PMA(5 ng/ml),、,Ionomycin(500 ng/ml),和,monensin,刺激,6,小时；,方法,11,：小鼠,ip,巨噬细胞使用,Mouse ip 1 ug/ml LPS,刺激,24,小时；,方法,12,：小鼠脾细胞使用,PMA(5 ng/ml),和,Ionomycin(500 ng/ml),刺激,6,小时。,6,、流式检测细胞染色基本过程,(1),收获细胞,(2),阻断,Fc,受体,(3),细胞表面染色,(4),固定和破膜,(5),细胞内染色,(6),上机或加入,PFA,固定后再上机,7.2,流式细胞术分析血小板,血栓性疾病、出血性疾病、心血管疾病以及自身免疫性血小板减少症等疾病的病理生理过程与血小板相关。,血小板功能检测包括黏附、聚集和活化功能试验。,流式细胞仪检测全血中血小板表面相关标志物，拓宽了血小板相关疾病的诊断与功能研究方法，丰富了血小板功能评估指标。,1,、流式细胞仪血小板分析应用范围,(1),通过分析信号传递、细胞骨架结构、颗粒释放、糖蛋白构形、膜磷脂、与抗凝因子的结合和微粒形成，分析血小板活化，血小板对刺激物的反应性。,(2),通过分析受激后表面结合蛋白触发凝血链式反应和表面糖蛋白缺陷检测，分析血小板止血功能的获得性和遗传性缺陷。,(3),结合血小板大小，检测血小板,RNA,含量，分析血小板成熟度，计数网织血小板。,(4),发现血小板抗体，做定性和定量分析。,2,、血小板分析的临床意义,(1),血栓性疾病,活化血小板的检测能预测冠状血管成形术后发生急性缺血事件的危险性；,非风湿性心房纤颤患者栓塞和栓塞前期均有血小板活化；,胰岛素依赖性糖尿病，子痫前期，外周血管疾病等均可测出血小板活力增加和,(,或,),循环中存在活化血小板；,早产儿的血小板对凝血酶、二磷酸腺苷,(ADP),、,TXA2,的体外激活能力降低。,(2),血小板缺陷性疾病,全血法流式细胞术提供了一个简单、迅速的方法来诊断血小板膜糖蛋白缺陷性疾病，,如,1,：巨大血小板综合征，是由于,GPIb-IX,复合物先天缺陷，导致血小板形态巨大，功能异常的出血性疾病。,如,2,：血小板无力症，是由于,GPb/a,复合物先天缺陷，导致血小板聚集功能障碍。,(3),贮存池疾病,原发性贮存池疾病（,-SPD,）常规用血小板聚集法检测，但特异性和灵敏度均不理想。,检测血小板致密颗粒的阿的平荧光显微镜法，主观性大，操作繁琐，一次检测的血小板数目有限。,全血法流式细胞术为,-SPD,的诊断简单、迅速，一次能定量检测,5 000,个以上阿的平染色的血小板。与正常人相比，,-SPD,患者阿的平染色显著下降,(,从,49%,降至,15%),。,常在骨髓增殖异常综合征和晚期肾衰中出现的获得性致密颗粒贮存池疾病，也能用全血法流式细胞术进行检测和诊断。,(4),血小板减少性疾病,破坏过多或生成减少均能导致血小板减少。,血小板相关抗体（,PAIg,）是反映血小板的破坏的指标（临床意义仍有争议）。,PAIg,的检测有多种方法，但流式细胞术法有其优越性。,流式细胞仪能测定单个血小板上的,PAIg,，只要测定,10,4,甚至,10,3,个血小板，在统计学上就能精确地得出,PAIg,的平均水平，因而用血量少，只要,1 ml,血液制备的血小板就足够。,流式细胞术还能同时测定其他一些反映血小板破坏的指标，如,PAIgG,、,PAIgM,、,C3,等。,血小板的生成与巨核细胞有关，全血法流式细胞术能像检测网织红细胞那样，检测分泌到循环中的“网织”血小板，来判断血小板的生成。,(5),血小板储存与输注,用,P-,选择素,(CD62),、,CD63,、,GPb/a,作分子标志物，发现血库中储存血小板有时间依赖性的活化现象。,储存,5,天以上，,40%,60%,血小板表达活化标志,CD62,。虽然其形态改变、乳酸脱氢酶泄漏以及,-TG,的释放也能反映其活化，但用,CD62,作为储存血小板的质量控制指标最理想。,活化的血小板在循环中的存活时间很短。若血小板在储存时活化了，即使输注也不能很好地提高患者止血能力。,(6),抗血栓药物的监测,活化血小板的检测可以判断患者是否需要抗血栓药物治疗。,也可以监测这些抗血栓药物的作用，避免毒副反应的发生。,(7),此外，全血法流式细胞术还可用于检测血小板聚集，研究其免疫表型,HPA-a,，测定严重血小板减少患者的血小板数目。,3,、流式细胞仪分析全血中血小板的优点,(1),全血中血小板更接近生理状态。,(2),操作简便，减少操作造成的血小板状态改变。,(3),同时检测血小板的多个标志物，结合,FSC,和,SSC,，评估多个参数，进行定量分析。,(4),多采用血小板特异抗体，找出血小板，避免杂质碎片的干扰。,(5),检测血小板亚群灵敏度高。,(6),用血量少。,(7),无放射性污染。,4,、全血样本的制备,(1),抽取抗凝全血：检测血小板功能时，应使用标准化的抽血规程。做血小板活化试验时，应尽量减少人为造成的血小板活化。,(2)Falcon,管中加取全血和适量直标荧光抗体，充分混匀，室温避光处反应，通常放置,15,分钟。,(3)1%,多聚甲醛固定样本。,(4),上机检测。,5,、质量控制标本,(1),阴性对照,(Isotype Control),：非特异荧光的强弱取决于抗体浓度、单克隆荧光抗体特异性和纯度，应与试验管抗体相对应。在多色分析时，同型对照应与其它抗体同时使用，以避免补偿造成的误差。,(2),血小板体外活化试验：使用正常人活化标本作为阳性质控。使用正常人未活化标本作为阴性质控。,(3),血小板自身抗体检测：使用含有已知血小板抗体的血清与血小板孵育，作为阳性质控。使用不含血小板抗体的血清与血小板孵育，作为阴性质控。,(4),血小板表面抗原缺失：如巨血小板症，血小板表面,CD42a/CD42b,缺失，血小板无力症血小板表面,gpIIb/IIIa,，即,CD41/CD61,缺失或异常。使用正常人标本做阳性对照，抗体的同型对照做阴性对照。,6,、数据分析,设门：,(1)FSC-SSC,点图中找出血小板，缺点是血小板较小，不易通过大小将碎片或杂质完全分开,(2),从,CD41,或,CD61-SSC,点图中画出血小板门，由于特异性高，可以有效地去除碎片和杂质的干扰。,7.3,细胞凋亡研究,细胞凋亡是细胞在基因控制下的有序死亡，在疾病发生、发展中有重要作用，因而研究细胞凋亡有重要意义。,细胞凋亡检测方法很多，应用流式细胞仪技术可根据细胞在凋亡过程中发生一系列形态、生化变化从多个角度对细胞凋亡进行定性和定量的测定。,1,、细胞形态变化,通过流式细胞仪测定细胞光散射的变化来观察细胞凋亡。,在细胞凋亡早期，细胞前向角光散射的能力显著降低，,90,角光散射的能力增加；,在细胞凋亡晚期，前向角和,90,角光散射的信号均降低。此方法特异性不强，目前使用较少。,2,、细胞膜功能改变,(1),磷脂酰丝氨酸（,phosphatidylserinePS,）异位,正常情况下，,PS,位于细胞膜内层，细胞发生凋亡时,PS,从细胞膜内翻转并暴露在细胞膜外层，是细胞发生凋亡的早期事件。,PS,与,Annexin,（一种具有强力抗凝作用的血管蛋白）具有高度亲和力。,应用流式细胞仪采用,FITC-Annexin/PI,双染法进行细胞凋亡检测，操作过程简单，指标敏感可同时描述三群不同状态细胞：,FITC-Annexin,-,/PI,-,细胞，即正常活力细胞；,FITC-Annexin,+,/PI,-,细胞，即凋亡细胞；,FITC-Annexin,+,/PI,+,细胞，即已死亡细胞。,(2)PI/Hoechst33342,双染法,Hoechst33342,（,HO,）是一种,DNA,的特异性荧光染料，可通过完整细胞膜。,应用,PI/Hoechst33342,可将细胞分为三群：,正常活细胞（,HO,强,/PI,-,）；,凋亡细胞（,HO,弱,/PI,-,），（由于凋亡细胞发生,DNA,降解和丢失，导致,HO,荧光减弱）；,死亡细胞（,HO,弱,/PI,+,）。,此种方法再结合凋亡细胞前向角光散射能力降低的特点，能更好地鉴定凋亡细胞，但,HO,须紫外光激发，由于很多流式细胞仪不配有紫外激光，故此法应用受限。,(3),吖啶橙,(AO)/,溴化乙啶,(EB),双染法,AO,是一种异染性荧光染料，可通过完整的质膜，它与核酸的结合主要是嵌入,DNA,双链的碱基之间，其发射峰为,530nm,，呈绿色荧光。,EB,的理化特性与,PI,相似，不能通过完整质膜。,应用,AO/EB,双染法也可以将细胞分成三群：,正常活细胞（,AO,强,/EB-,），,凋亡细胞（,AO,弱,/EB-,），,死亡细胞（,AO,弱,/EB+,），,AO/EB,双染法所的激发光是被广泛使用的氩激光（,488nm,），不须紫外光，其缺点是染色过程较复杂，且,AO,易污染设备管道，因此使用此法者较少。,(4),放线菌素,D(7-AAD),染色法,7-AAD,是一种核酸染料，不能通过正常质膜，随着细胞凋亡、细胞死亡过程，质膜对,7-AAD,的通透性逐渐增加，结合细胞凋亡中,DNA,的有控降解。,通过,7-AAD,标记,DNA,的强弱，将细胞分为三群：,7-AAD,强为死亡细胞，弱是凋亡细胞，阴性为正常活力细胞。,优点,1,：染色快速、简便、价格便宜；,优点,2,：不破坏细胞膜，可联合使用,FITC,、,PE,标记的膜蛋白,对特殊细胞群及亚群进行多色荧光分析，是应用核酸染料测定细胞凋亡的流式细胞仪法中十分实用的方法。,AO/EB,双染法时，,AO,及,EB,的发射光波谱分别与,FITC,和,PE,的发射光波谱相似，不能与,FITC,和,/,或,PE,联合使用。,3,、细胞器改变：,线粒体膜,APO2.7,蛋白表达,早期凋亡细胞的线粒体膜出现,APO2.7,蛋白表达，利用荧光标记的单克隆抗体，运用流式细胞术可以检测早期凋亡细胞。,4,、,DNA,含量变化,主要是,PI,染色法，由于凋亡细胞,DNA,发生有序降解，被降解的低分子量,DNA,片段从变性细胞膜（经乙醇及透膜剂处理）漏出细胞外，使得凋亡细胞内的,DNA,含量减低，在流式细胞仪测定细胞,DNA,含量直方图中,G,1,峰前可出现亚二倍体峰，即所谓凋亡峰。,通过测定凋亡峰百分含量，便可知凋亡细胞比例。,优点：简便、快速；是常用的、经典的凋亡测量方法。,缺点是特异性较低：少量的正常的低,DNA,含量细胞、由于机械损伤产生,DNA,含量减低的坏死细胞、染色体丢失的分裂相细胞以及细胞碎片和微核等都可能出现在亚二倍体峰内。,5,、,DNA,断裂点标记,细胞凋亡时发生,DNA,断裂，利用末端转移酶,(TdT),可以将,dUTP,标记到断裂点上，称作原位缺口末端标记（,TUNEL,）技术。,直接标记的标记