流式细胞术FlowCytometryFCM.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,流式细胞术（,Flow Cytometry,FCM),作者：笛风,1,、流式细胞仪,(Flow Cytometer):,是集光电子物理，光电测量，计算机，细胞荧光化学，单抗技术为一体的高科技细胞分析仪。,2,、流式细胞术,(Flow Cytometry):,利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参数、快速（每秒可达,1000-10000,个）的定量分析和分选（纯度可达,99%,以上）的技术。,基本概念,流式细胞仪结构,激光光源及光束形成系统,流动室及液流驱动系统,光学系统：透镜、滤光片、小孔，聚焦光源，,收集不同波长的荧光信号。,信号检测与分析：光电倍增管（,PMT,）、补偿,电路。荧光信号转换为电信号，并将信号放大。,存储、显示、分析系统：计算机。,细胞分选系统,流式免疫分型技术要点,标本的获取和运输,标本的制备和染色,仪器的校准和质控,流式细胞仪数据获取与储存,FCM,的主要测定指标,FSC,SSC,FL1,FL2,FL3(FL4),其中：,FSC,：反映细胞的大小,SSC,：反映细胞内颗粒性,FCM,标记方法,单标：,一种单抗,/tube:FL1,FSC,SSC,（三参数）,双标：,（两种单抗,/tube,）：,FL1,FL1,FSC,SSC,（四参数）,三,/,四标：,（三种单抗,/tube,）（四种单抗,/tube,）：,FL1-FL3/4,FSC,SSC,荧光素种类,FITC(,异硫氰酸荧光素）：绿色,530nm,PE,（藻红蛋白）：橙黄色,575nm,PerCP(,多甲藻黄素叶绿素蛋白）：深红色,675nm,PI(,碘化丙啶）：橙红色,620nm,488nm,波长的氩离子激光激发,APC(,别藻兰蛋白）：红色,660nm,630nm,波长的氦氖激光或红色二极管激光激发,PE,最强，适用于弱表达抗原,FITC,最便宜，适用于强表达抗原，适用范围广,biotin-avidin,不适合 弱抗原的检测,抗体的选择,数据显示方式,单参数直方图,双参数二维点图,等高图,二维密度图,三维图,流式常见图形,(Histogram Plot),流式细胞的主要信息,:Fluorescence,FL1,FL2,FL3,FL4,最常用的标记方法是荧光素分子标记的抗体与细胞抗原结合,流式常见图形,(Histogram Plot),适用于：单参数分析,流式常见图形,(Dot Plot),适用于：多参数分析,第二节 流式细胞术的科研应用,分析群体细胞,所需时间短,多参数分析,定性或定量,流式应用常见范围,细胞大小,细胞的颗粒度,细胞表面分子：,CD,系列,细胞浆内分子：胞内细胞因子,细胞核内分子：,P53,细胞功能检测：细胞周期、凋亡,抗体标记的方法,抗体的选择,首选直接标记抗体,荧光分子,PE,最强，适用于弱表达抗原,FITC,最便宜，适用于强表达抗原,间接标记：,适用范围广,biotin-avidin,不适合弱抗原的检测,实验对照的设计,空白对照：,ALL,阴性对照：,常用同型抗体对照,单色分析：设同型抗体对照,多色分析：同型对照，单阳性对照,（用于仪器校正）,阳性对照：,检测阴性时,空白对照和阴性对照的比较：,实验标本的处理,单细胞悬液的制备：胰酶消化,抗体或标记分子的染色：抗原抗体反应,非特异结合的去除：洗涤和封闭,封闭：血清和同型抗体,流式检测应用实例,凋亡,细胞内分子检测,凋亡检测,-,每一步都有检测试剂盒,细胞周期,G1,M,G2,S,Quiescent cells,G0,细胞周期不能区分凋亡与死亡细胞,Sub-G,0,/G,1,peaks-PI staining,Caspases,Annexin V Assay,建议用于悬浮细胞,Annexin V Assay,能够区分死亡与凋亡,流式“,TUNEL”,Intracellular Cytokine-Protocol,SORTING,（细胞分选）,DIMER X antigen specific T cell assay method for monitoring cellular response,CBA(Cytometric Bead Array),Traditional Analysis-Percent positive,Determination of the CD4 PE ABC on lymphocytes,1,10,100,1000,10000,Linear Fluorescence in FL2,10,2,10,3,10,4,cell and bead neg,lymph FL2;,(49,000 ABC),Molecules PE per Bead,10,5,第三节 流式细胞术的临床应用,白血病免疫分型,HLA-B27:,强直性脊柱炎,淋巴细胞亚群,造血干细胞计数：造血干细胞移植,网织红细胞,PNH,诊断（,CD55,、,CD59,）,血小板活化试验,流式细胞白血病免疫分型,流式细胞的免疫分型,是白血病分型的重要指标,FAB,标准，形态学和免疫表型结合,适合于白血病的分型诊断，但不适合用于确诊是不是白血病。,Minimal residual diseases(MRD),FCM,应用,1,、细胞增殖周期测定和,DNA,倍体分析,2,、凋亡检测,3,、免疫功能的检测,4,、血液学应用,5,、,HLA-B27,的检测：用于诊断强直性脊柱炎。,6,、其他：溶液中细胞因子的测量。,7,、细胞分选,细胞增殖周期测定和,DNA,倍体分析,1,）细胞增殖周期：分为,G0,、,G1,、,S,、,G2,、,M,期。,S,期是,DNA,合成期，在,S,期,内，,DNA,进行复制，使细胞的,DNA,含量由,2,倍体（,2C 46,条染色体）变为,4,倍,体（,4C,）。,G1,和,G2,期为,DNA,合成前、后间期，此期无,DNA,的合成，但,RNA,和,蛋白质进行合成。,M,期为有丝分裂期，在此期一个细胞分裂为,2,个细胞。,细胞内的,92,条染色体分裂成,2,组,46,条染色体，使每个细胞内具有,46,条染色,体。在,M,期分裂成两个子细胞之前，,G2,和,M,期细胞的,DNA,含量均为恒定的,4C,。,M,期以后部分细胞进入,G1,期，继续进行增殖，部分细胞进入,G0,期，即静,止期，不再继续增殖。因此，,FCM,分析一个群体细胞峰,DNA,倍体与细胞周,期时，将,DNA,含量直方图分为三部分，即,G0/G1,S,G2/M,期三个细胞峰。,G0/G1,和,G2/M,细胞峰,DNA,的含量成正态分布，,S,期细胞峰则是一个加宽的正,态分布。,2,）利用,DNA,的荧光染料，如,PI,（,Propidium iodide,碘化丙啶），与细胞内的,DNA,结合，可反映细胞内,DNA,含量。采用,DNA,直方图显示。具有,2C DNA,含量细胞为,G0/G1,期细胞，,4C DNA,含量细胞为,G2/M,期细胞，,DNA,含量介于两者之间的细胞为,S,期细胞。,3,）,DNA,倍体：主要比较,G0/G1,期细胞,DNA,含量的变化。用,DNA,指数（,DI,）表示。,DNA,指数,=,测量样本,G0/G1,期,DNA,含量,/,正常人淋巴细胞,G0/G1,期,DNA,含量,以正常人淋巴细胞作为对照。,正常细胞,DNA,指数为,1.00,，,DNA,指数,1,，为超,2,倍体，,1,为亚,2,倍体，两者可统称为非整倍体。非整倍体细胞中肿瘤的特异性标志，实体肿瘤中出现频率较高。,第四节 凋亡检测,1,）,FCM-DNA,检测（,DNA,亚,G1,峰的检测）：利用,PI,染色，检测具有亚,G1,期,DNA,含量的细胞比例，代表凋亡细胞数。其原理为在凋亡过程中，细胞内核酸酶的释放，将,DNA,降解，分解成小的片段，在标本制备中的固定处理时，细胞膜的完整性被破坏，使细胞内降解的,DNA,片段从细胞内流出，造成总体,DNA,含量减少，成为亚,2,倍体。注：检测的凋亡细胞数代表晚期的凋亡细胞比例，且易受标本中的死细胞和碎片的干扰，影响结果的准确性。,可参看文章：,免疫功能的检测,（,1,）利用多参数流式细胞术，对,PB,中淋巴细胞比例，及淋巴细胞中,T,、,B,、,NK,细胞的比例，及,T,细胞亚群进行检测。如,CD3+,（总,T,细胞）；,CD19+,（总,B,细胞），,CD3-/,（,CD16+5,（,NK,细胞）。,3+/CD4+,（,Th/Ti,）：辅助,/,诱导；,CD3+/CD4+/CD5RA+,：,na,ve,辅助,/,诱导,T,细胞；,CD3+/CD4+/CD45R0+,：记忆性辅助,/,诱导,T,细胞；,D3+/CD8+,（,Ts/Tc,）：抑制,/,杀伤；,CD3+/CD8/45RA+,：,na,ve,抑制,/,杀伤,T,细胞；,CD3+/CD8+/CD45R0+,：记忆性抑制,/,杀伤,T,细胞。胞内细胞因子的检测：,CD4+/IL-4+,，,Th1,细胞，,CD4+/IFN-+,。,（,2,）临床应用：原发性或继发性免疫缺陷病、自身免疫性疾病、淋巴细胞增殖病、肿瘤疗效观察与预后判断、移植免疫检测等。,第六节,FCM,在,血液学中的应用,1,）白血病和淋巴瘤的免疫分型，目前对白血病和淋巴瘤的诊断，国际上提出,MIC,分型，即通过形态（,M,）、免疫分型（,I,）、细胞遗传学（,C,）检测，对白血病和淋巴瘤进行综合诊断，免疫分型是重要的检测项目之一。现在多应用多参数的流式细胞术，不同抗体分别被几种荧光素标记：第一荧光（,FL1,）：,FITC,（异硫氰酸荧光素，,Fluorescein isothiocyanate,），,FL2,：,PE,（藻红蛋白，,Phycoerythrin,）,FL3,：,PerCP,（多甲藻黄素叶绿素蛋白，,peridinin chlorophyll protein,），,FL4,：,APC,（别藻兰蛋白,allophycocyanin,）,2,）,CD34+,造血干,/,祖细胞的检测。主要用于干细胞移植及基因治疗方面的检测。,3,）活化血小板及网织血小板的检测，在栓塞性疾病，如脑血管和心肌梗塞的患者，可出现活化的血小板增多。而血小板减少的患者，如果出现网织血小板增多，则说明血小板减少的原因为血小板破坏过多所致。,4,）阵发性睡眠性血红蛋白尿症（,PNH,）的发病机制为,X,染色体上的,PIG-A,基因发生突变，引起糖化肌醇脂（,GPI,）锚合成障碍，使,GPI,锚连蛋白缺乏，已证实的,GPI,锚连蛋白有,10,余种，用于,PNH,诊断的主要为,CD55,和,CD59,两种，如果在红细胞或,WBC,上出现,CD55,或,/,和,CD59,的减少，可诊断为,PNH,。,5,）网织红细胞计数,6,）白细胞分类计数,第七节 其他应用,溶液中细胞因子的测量,:,利用吸附有特异性抗体的微球，与溶液中的细胞因子结合，而检测溶液中是否存在该种因子,HLA-B27,的检测：用于诊断强直性脊柱炎。,第八节 细胞分选,FCM,可将样本中所需要的细胞亚群从群体细胞中分离出来，即所谓分选,(Sorting),。被测细胞的任何参数均可作为分选的依据。分选的方式一般有静电分选和捕获管分选，分选方式不同则决定分选的速度，分选纯度一般可达,99%,以上。除细胞分选外还可进行染色体分选。,分选的细胞可用于克隆化培养、原位杂交、分子生物学研究等。从孕妇外周血中分离富集胎儿有核红细胞用于产前诊断，染色体分选可用于基因诊断。,淋巴,20-25%:,T:70%,B:20%,NK:10%;,单核,2-6%,+,粒细胞,:40-60%,有核红,:20-25%,正常,BM,各系细胞比率,是白细胞（包括血小板、血管内皮细胞等）在正常分化成熟的不同阶段以及活化过程中在这些不同谱系（,lineage,）细胞胞浆或细胞膜表面出现或消失的标记，参与机体重要的生理和病理过程。八十年代在,WHO,和国际免疫学联合会,(IUIS),组织下，将识别同一分化抗原的来自不同实验室的单克隆抗体归为一个分化群,CD:cluster of differentiation/cluster designation,白细胞分化抗原,1.,系列交叉,(cross-lineage):,AML,表达,CD2,CD19,2.,表达不同步,(asynchronous):,早期与晚期抗原同时表达,3.,表达量异常,(over-or under-expression):,4.,与细胞大小不匹配,(abnormal light scatter profile):,如大,CD2+,细胞或小,CD13+,细胞,AL,免疫表型特点,:,紊乱表型,鉴别淋髓系列,区分亚型,双表型、杂合型,Mo,、,M7,、,AUL,提示细胞遗传学异常,部分与预后相关,MDR,监测,AL,免疫表型检测意义,Gating,FCM,设门法,FSC/SSC:,不能将淋巴、单核及幼稚细胞区分开,CD45/SSC:CD45,是,WBC,抗原,RBC.PLT,为阴性。,CD45,在成熟细胞表达强，幼稚细胞表达弱。在淋巴，单核及粒细胞表达强度不同。优点：能将淋巴单核及幼稚细胞区分开，特异分析白血病细胞免疫表型。,正常血细胞分化发育过程中免疫标志变化特点以及白血病细胞免疫标志特点,常用各系血细胞,CD,抗原,1,、,T,系：,CD1-CD8,（,CD6,不用）,2,、,B,系：,CD10,CD19-CD24,FMC7,3,、髓系：,CD11b,CD13-CD16,CD33,CD64,4,、干祖：,CD34,CD117,CD38,HLA-DR,正常,B,细胞标志,CD19,CD22,TdT,Cd34,CD10,CD20,FMC7,CD23,DR,I,期,+,+,+,+,+,+,II,期,+,+,-,-,+,-/+,+,III,期,+,+,-,-,-,+,+,IV,期,+,+,-,-,-,+,+,+,+,泛,B,标志：,CD19,HLA-DR,cCD79a/CD22,幼稚,B,标志：,CD34,TdT,CD10,成熟,B,标志：,CD23,FMC7,B-ALL,的分型,亚型,CD19,CD34,TdT,CD10,Cylg,SmIg,急性早期,B,前体细胞白血病,Early B-precursor ALL,+,+,+,+,-,-,急性前,B,细胞白血病,Pre B-ALL,+,-/+,+,+,+,-,急性,B,细胞白血病,B-ALL,+,-,-,-,-/+,+,正常,T,细胞标志：根据在胸腺内发育阶段分类,CD7,CD2,CD5,CD34,CD1a,CD3c/m,CD4,CD8,I,期,+,+,+,+,+/-,II,期,+,+,+,-,+,+/-,III,期,+,+,+,-,+,+/+,+,+,IV,期,+,+,+,-,-,+/+,+/-,+/-,泛,T:CD2,CD5,CD7,cCD3,幼稚,T:CD34,TdT,CD1a,CD4/8,成熟,T:CD3,CD4,CD8,T-ALL,的分类,分型,CD7,CD2,TdT,CD3c/m,急性早期,T,前体细胞白血病,Early T precursor ALL,+,-,+,+/-,急性,T,细胞白血病,T-ALL,+,+,-,+/+,T-ALL,特点：,1,，幼稚,T,细胞数量增多：,CD34+,TdT+,2,，泛,T,标志丢失,3,，,CD4/8,双阳或,CD4/8,单阳,正常单核细胞标志,全单核细胞标志：,CD33,CD13,HLA-DR,幼稚单核细胞标志：,CD34,CD117,成熟单核细胞标志：,CD14,CD64,HLA-DR,CD33,CD13,CD34,CD117,CD14,CD64,幼稚单,+,+,+,+,+,-,-,成熟单,+,+,+,-,-,+,+,正常粒细胞标志,cMPO,CD13,CD34,CD117,HLA-DR,CD33,CD11b,CD15,CD64,CD10,幼稚粒,+,+,+,+,+,+,-,-,-,-,成熟粒,+,+,-,-,-,+,+,+,+,+,全粒细胞标志：,CD13,CD33,Cmpo,幼稚粒细胞标志：,CD34,CD117,HLA-DR,成熟粒细胞标志：,CD15,CD11b,CD10,CD64,成熟粒、单核细胞主要区别,成熟粒细胞：,CD33+HLA-DR-CD14-CD64+dim,成熟单核细胞：,CD33+HLA-DR+CD14+CD64+,干祖细胞标志,T,祖细胞,B,祖细胞,髓祖细胞,CD34,+,+,+,TdT,+,+,-,CD117,-/+,-,+,HLA-DR,+/-,+,+,CD38,+,+/-,+,诊断白血病主要标志：,B-ALL:CD34,HLA-DR,CD19,CD10+/-,cCD79a,T-ALL:CD34,CD38,CD7,CD2+/-,CD5+/-,cCD3,AML:CD34,CD117,CD33,CD13,cMPO,M3:CD34-,HLA-DR-,M2:CD19+:t(8,21),M4/M5:CD14+,M6:GlyA+,CD71+,M7:IIb/IIIa(CD41,CD61)+,双表型急性白血病诊断的积分系统,(EGIL,1998),分值,B,系,T,系 髓系,2 CD79a CD3 MPO*,cCD22 anti-TCR,/,cIgM anti-TCR,/,1 CD19 CD2 CD117,CD20 CD5 CD13,CD10 CD8 CD33,CD10 CD65,0.5 TdT TdT CD14,CD24 CD7 CD15,CD1a CD64,Diagnosis,CD5,CD,10,CD,19,CD,20,CD23,CD79b,FCM-7,CD25,CD11c,CD,103,SLL/CLL,+,-,+,+,+,-,-,-/+,+/-,-,Mantal cell lymphoma,+,-,+,+,-,+,+,-,-,-,Follicle center lym,-,+,+,+,-/+,+/-,+/-,-,-,-,Marginal zone lym,-,-,+,+,-,+/-,+/-,-/+,+,-,HCL,-,-,+,+,-,+/-,+/-,+/-,+,+,Common phenotyes of B-cell lymphoproliferative disorders,