生物化学核酸化学.pptx

<p>单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第12章 核酸通论,1869,年,Miescher,博士论文工作中测定淋巴细胞蛋白质组成时,发现了不溶于稀酸和盐溶液的沉淀物,并在所有细胞的核里都找到了此物质,故命名,核质,(,Nuclein)。,一、核酸研究简史,1879,年,Kossel,经过10年的努力,搞清楚核质中有四种不同的组成部分:,A,T,C,和,G,。,1889,年,Altman,建议将,核质,改名为“,核酸,”,并且已经认识到“核质”乃“核酸”与蛋白质的复合体。,1909,年,Levene,发现酵母的核酸含有核糖。,1930,年,Levene,发现动物细胞的核酸含有一种特殊的核糖即脱氧核糖,得出了一个错误概念:植物核酸含核糖,动物核酸含脱氧核糖。这个错误概念一直延续到1938年，这时方清楚,RNA,和,DNA,的区别。,Levene,还提出了核酸的,“,磷酸-核糖(碱基)-磷酸,”,的骨架结构,解决了,DNA,分子的线性问题,还在1935年提出,“,四核苷酸,”,学说,认为这四种核苷酸的聚合体是构成核酸的基本单位。,1944,年,Avery,重做,1928,年,Griffith,的细菌转化实验，证明,DNA,是遗传物质。,1952,年,Hershey,&amp;,Chase,的噬菌体感染实验进一步证明,DNA,是遗传物质。,1950,年,Chargaff,E,和,Hotchkiss,R.D.,采用纸层析法仔细分析了,DNA,的组成成分,得知,A=T,G=C,A+G=C+T,1953,年,Watson,Crick,根据,DNA,的,X,射线图谱的研究结果,提出了,DNA,的双螺旋模型(,Double helix)。,几星期后提出了半保留式复制模型。,1957,年,Meselson Stahl,用密度梯度超离心法,证实半保留复制假说。,1958,年,Kornberg,得到高纯度的,DNA polymerase,这种酶需要一个模板,DNA。,1960,年,Cairns,拍摄了复制中的细菌,DNA,的电镜照片。,1970,年发现第一个,DNA,限制性内切酶。,1972,年建立,DNA,重组技术。,1978,年建立,DNA,的双脱氧测序法。,1990,年开始实施人类基因组计划。,2003,年人类基因组计划宣告完成测序任务。,二、核酸的生物功能,(,一),DNA,是主要的遗传物质,1928,年,Griffith,的细菌转化实验,1944,年,Avery,重做,1928,年,Griffith,的细菌转化实验，证明,DNA,是遗传物质。但人们对此持怀疑态度，理由是：,（,1,）因认为蛋白相对分子质量大，结构复杂，二十种氨基酸的排列组合将是个天文数字，可作为一种遗传信息。而,DNA,相对分子质量小，只含,4,种不同的碱基，人们一度认为不同种的有机体的核酸只有微小的差异。,（,2,）认为转化实验中,DNA,并未能提得很纯，还附有其它物质。,（,3,）即使转化因子确实是,DNA,，但也可能,DNA,只是对荚膜形成起着直接的化学效应，而不是充当遗传信息的载体。,1952,年,Hershey and Chase,的实验进一步证明,DNA,是遗传物质,物种,基因组,基因数目,物种,基因组,基因数目,MS2,噬菌体,3.6 kb,4,裂殖非洲粟酒酵,20 Mbp,6,000,Q,噬菌体,4.2 kb,3,盘基网柄菌,47 Mbp,7,000,SV40,5.2 kbp,8,秀丽隐杆线虫,100 Mbp,19,100,X174,5.4 kbp,9,拟南芥,70 Mbp,25,500,TMV,6.4 kb,4,水稻,(,籼稻,),74.8 Mbp,46,02255,615,HIV,9.3 kb,10,黑腹果蝇,165 Mbp,13,000,腺病毒,2,35.9 kbp,11,河豚鱼,400 Mbp,70,000,噬菌体,48.5kbp,50,担尼鱼,1.9 Gbp,70,000,T4,噬菌体,169 kbp,300,非洲爪蟾,2.9 Gbp,70,000,大肠杆菌,4.64 Mbp,4,288,小鼠,3.3 Gbp,70,000,酿酒酵母,13.5 Mbp,5,885,人,3.3 Gbp,31,000,(,二,)DNA,和基因组,1.DNA,和基因组,DNA,分子中最小的功能单位称作,基因,，为,RNA,或蛋白质编码的基因称,结构基因,，只有调节功能，不转录生成,RNA,的称,调节基因,，某生物体所含的全部基因称该生物体的,基因组,。,2.,原核生物基因组的特点,通常只有一个,DNA,分子；无重复序列；功能相关的基因常构成一个转录单位；有重叠基因,。,3.,真核生物基因组的特点,（,1,）有重复序列，中度重复序列可重复几十次到几千次，如,rRNA,基因、,tRNA,基因和某些蛋白质的基因；高度重复序列可重复数百万次，如卫星,DNA,和微卫星,DNA,。,（,2,）有断裂基因，不少基因含有称作内含子的非编码区，编码区称作外显子，有些基因可含有几十个内含子。,鸡卵清蛋白的基因,人类基因组序列的类型,长分散元件（,6-8kb,，约,85,万个）,短分散元件（,0.1-0.3kb,，约,150,万个，其中,Alu,元件超过,100,万个）,简单序列重复,大片段重复,(,二),RNA,功能的多样性,1.某些病毒的遗传物质;,2.控制蛋白质的合成;,3.遗传信息的加工;,4.基因表达和细胞功能的调控;,5.催化功能;,6.在细胞分化和个体发育中发挥重要作用;,7.在生命起源中可能有重要作用。,基本要求,1.,熟悉核酸的发现和研究简史。,2.,掌握核酸的种类、分布和生物功能。,（重点）,第13章 核酸的结构,一、核苷酸,核酸可以水解成核苷酸，核苷酸可以水解成磷酸和核苷，核苷可以水解成戊糖和碱基，碱基可以分成多种类型。,(一)碱基,与氨基酸一样，碱基在细胞中也受到各种各样的修饰，其产物常常扮演信号传导信使分子、营养因子、辅酶等角色，并对核酸结构的稳定性起着重要作用,.,内酰胺,内酰亚胺,(二)核苷,(三)核苷酸,二、核酸的共价结构,(一)核酸中核苷酸的连接方式,核酸的一级结构：,碱基的排列顺序,DNA,5-ATGCATGC3,3,-,TACGTACG3,RNA,5-AUGCAUGC3,核酸的二级结构：,形成双螺旋和单链环,核酸的三级结构：,空间构象,核酸的结构层次,(,二),DNA,的一级结构,(,三),RNA,的一级结构,ACTG,三、,DNA,的高级结构,(,一),DNA,碱基组成的,Chargaff,规则，见表13-5,(,二),DNA,的二级结构,依据：,Chargaff,规则；,X,衍射图；碱基不可滴定。,要点,（,1,）两条链反向平行，绕同一轴相互缠绕成右手螺旋；（,2,）磷酸和戊糖交替处于螺旋外围，碱基处于内部，形成碱基对；,(3),双螺旋的直径为,2nm,，碱基堆积距离为,0.34nm,；（,4,）一条链的核苷酸序列可以决定另一条互补链的核苷酸序列。,*,Watson-Crick,的,DNA,双螺旋,双螺旋分子中糖分子与纵轴平行，与碱基平面垂直。,稳定双螺旋结构的作用力为氢键、碱基堆积力（即疏水作用）和环境中正离子的作用。,碱基的配对使得双螺旋,DNA,分子在复制时以半保留的形式进行。,5.DNA,双螺旋分子结构的不同类型：,主要有三种，分别命名为,A、B,和,C,型。其中,B,型与,Watson-Crick,提出的模型一致，,A,和,C,型在低相对湿度的条件下形成，它们的螺距都比,B,型要短，,A,型D,NA,的结构与,DNA,和,RNA,的杂合链相似。,Z,型,DNA,首先在富含,GC,的,DNA,短片段中发现，后用抗体证明天然,DNA,中也有，它是一种左手螺旋，在细胞中可能与基因表达的调控有关。,螺距 残基数 碱基倾斜,A,型(75%,Na)2.8 11 20,B,型(92%,Na)3.4 10 0,C,型(66%,Li)3.1 9.3 6,D/R hybrid 2.8 11 20,Z,型 4.6 12 9,Z-DNA,的结构特点：,（,1,）糖磷骨架呈,“,之,”,字形（,Zigzag,）走向。,（,2,）左旋。,（,3,）,G,的糖苷键呈顺式,(Syn),，使,G,残基位于分子表面。,（,4,）大沟消失，小沟窄而深。,（,5,）每个螺旋有,12bp,。,Z,DNA,存在的条件：,（1）高盐：,NaCl2Mol/L,MgCl,2,0.7 Mol/L,（,2,）,Pu,Py,相间排列。,（,3,）在活细胞中如果有,m,5,C,则无需嘌呤,-,嘧啶相间排列，在生理盐水的浓度下可产生,Z,型将结构。,（,4,）在体内多胺化合物，如精胺和亚胺及亚精胺等阳离子，可和磷酸基因结合，使,B-DNA,转变成,Z-DNA,。,（,5,）某些蛋白质如,Z-DNA,结合蛋白带有正电荷，可使,DNA,周围形成局部的高盐浓度微环境。,（,6,）负超螺旋的存在。,Z-DNA,的生物学意义,(1),可能提供某些调节蛋白的识别位点。啮齿类动物病毒的复制起始部位有,d,（,GC,）有交替顺序的存在；在,SV40,的增强子中有三段,8bp,的,Z-DNA,存在。,(2),原生动物纤毛虫，有大、小两个核，,大核,有转录活性，,小核,与繁殖有关。,Z-DNA,抗体以萤光标记后，显示仅和大核,DNA,结合，而不和小核的,DNA,结合，说明大核,DNA,有,Z-DNA,的存在，可能和转录调控有关。,*,*,*,*,6.DNA,分子的,三螺旋结构和单链结构：,在,DNA,分子中，,镜像重复序列可以回折，形成三螺旋结构。,在某些病毒中，,DNA,分子以,单链形式存在。,正螺旋和负螺旋,负超螺旋,右旋,正超螺旋,左旋,DNA,双螺旋为右手螺旋。细胞中的环状,DNA,一般呈负超螺旋，即右手螺旋不足导致部分碱基不能形成配对，分子通过整体拓扑学上的右旋来补足右手螺旋的不足，在数学上呈1：1，即分子整体右旋一圈来补双螺旋上的一圈不足。,正超螺旋为双螺旋旋转过度，通过分子整体的左旋来解开过度的螺旋。,(,三),DNA,的三级结构,White,方程：,L=T+W,L,（,Linking nnmber,）,：连环数或称拓扑环绕数，指,cccDNA,中一条链绕另一条链的总次数。其特点是：,(1)L,是整数；,(2),在,cccDNA,中任何拓扑学状态中其值保持不变；（,3,）右手螺旋的,L,取正值。,W,（,Writhing number,）,：扭曲数，即超螺旋数。其特点是：,(1),可以是非整数；,(2),是变量；,(3),右手超螺旋的,W,取负值。,T,（,Twisting number,）：缠绕数，即双螺旋的圈数。其特点是：,(1),可以是非整数；,(2),是变量；,(3),右手螺旋时,T,为正值。,超螺旋的量度可以用超螺旋密度,来表示：,=,（,L-T,）,/T,在天然,DNA,中，,约为,-0.05,，大约,20,个双螺旋有,1,个超螺旋。,促旋酶（拓扑异构酶,）,的作用方式,(,四),DNA,与蛋白质复合物的结构,平均每200,bp,的,DNA,绕核小体左旋1.75转，因此真核生物的,DNA,分子为正超螺旋,核小体的电镜照片,组蛋白八聚体：（,a),前面观；,(b),顶面观；（,c,）沿着染色体纤维长轴的透视图；,(d)DNA,与组蛋白空间结构的模式图。,（,a),核小体的结构图，左图为沿核小体轴观察的图示；右图为沿核小体轴垂直方向观察的图示；,(b),一半核小体的结构图。,四、,RNA,的高级结构,(一),tRNA,的高级结构,(,二),rRNA,的高级结构,16S rRNA,(三)其他,RNA,的高级结构,基本要求,1.,掌握核苷酸的结构特点和重要核苷酸的生物学功用。,（重点）,2.,掌握核酸的共价结构。,（重点）,3.,掌握,DNA,的二级结构，熟悉,DNA,的三级结构。,（重点）,4.,掌握,RNA,的二级结构，熟悉,RNA,的三级结构。,（重点）,作业题,第,500,页第,3,题；,第,500,页第,4,题；,第,500,页第,5,题；,第,500,页第,6,题；,第,500,页第,7,题；,第,500,页第,10,题；,第,500,页第,12,题；,第,500,页第,13,题；,第,500,页第,14,题。,第14章,核酸的物理化学性质,一、核酸的水解,(一)酸水解,糖苷键比磷酸酯键更易水解，特别是嘌呤与脱氧核糖之间的糖苷键很容易水解。,(二)碱水解,通常用于,RNA,水解，,DNA,的碱水解比较困难。,(三)酶水解,双链,DNA,分子可以被上千种从微生物中分离得到的限制性内切酶（,restriction enzyme）,切断,又可以再连接起来。切断的过程不需要能量，而连接的起来的过程却需要2个分子的,ATP。,这就是分子克隆和,DNA,重组技术的基础。,DNA,与限制性内切酶,大部分限制性内切酶识别的碱基序列为,4,6,个碱基的,palindrome,顺序。它们在微生物细胞内发挥iu的是防御外来,DNA,入侵的国防军的作用。,碱基,adenine 4.15,9.8,cytosine 4.5,12.2,guanine 3.2,9.6,thymine 9.9,13,核苷,adenosine 3.5,12.5,deoxyadenosine 3.8,cytidine 4.15,12.5,deoxycytidine 4.3,13,guanosine 1.6,9.2,deoxyguanosine 2.5,uridine 9.2,12.5,deoxythymidine 9.8,13,核苷酸,AMP 3.7,6.1 :dAMP 4.4,ADP 3.9,6.3 :-,CMP 4.5,6.3 :dCMP 4.6,GMP 2.4,6.1,9.4 :dGMP 2.9,9.7,UMP 6.4,9.5 :dTMP 10.0,二、核酸的酸碱性质,碱基配对时碱基一般以酮式存在，而不是醇烯式。,碱基中的,H,原子一般不移动，因此很少有亚氨基团。,在中性,pH,条件下，参与氢键的-,NH,2,基均不带电荷，这是杂环电子共轭以及氢键共同作用的结果，否则双螺旋结构不会稳定。,碱基、核苷、核苷酸的,pK,值,三、核酸的紫外吸收,1,OD,260,DS DNA 50,g,SS DNA 37,g,RNA 40,g,DNA,分子的变性,四、核酸的变性，复性及杂交,变性和复性的含义,DNA,的变性在紫外吸收上的变化,Tm,的定义,影响,Tm,的因素,1.,DNA,的均一性越高,Tm,的温度范围越小。,2.,G-C,含量越高,Tm,的值越大，当,GC,的含量上升,1%,，则,Tm,上升,0.4,。马默多蒂（,Marmur-Doty,）关系式：,Tm=69.3+0.41(G+C)%,，,或,GC%=,（,Tm-69.3,）,2.44,3.介质的离子强度较高时,Tm,的值较大。,4.酸性条件下,核酸容易脱嘌呤,碱性条件下,核酸容易变性,通常加,NaOH,降低,Tm,的值。,5.尿素,甲酰胺等化学试剂可以降低,Tm,的值,称作变性剂。,SSC,溶液，常用于,DNA,的溶解。,(二)复性,T,1/2,C const,DNA,浓度与复性时间的关系,影响复性速度的因素,1.,DNA,的片段越大,复性的速度越慢;,2.,DNA,的浓度越高,复性的速度越快;,3.,DNA,的重复序列越多,复性的速度越快;,4.溶液的,pH,过高或过低,复性的速度均会降低;,5.适当增高溶液的离子强度,复性的速度会增高。,DNA,复性与,Cot,分析,当,C/C,0,=1/2,时，,k=1/C,0,t,1/2,哺乳动物的,DNA,一般均呈右图的曲线，这是因为它们的基因组,DNA,中插入了大量的重复序列，如人的,DNA,中就插入了长度为350,bp,的,Alu,序列达50万份拷贝之多。,人,DNA,的,Cot,曲线,(,三),DNA,的分子杂交技术,分子杂交,是将不同来源的核酸分子分别变性，再混合后复性，使不同来源的单链的互补区形成双链的技术。,通常将其中的一方用,放射性同位素,或特定的基团(如,生物素,地高辛,)标记，称作,探针，,现时的探针多为人工合成的短片段。,若将杂交的另一方直接点到膜上进行杂交，称作,点杂交。,对组织切片或菌落进行处理后再杂交称作,原位杂交。,分子杂交的广泛应用是将样品,DNA,用,限制性内切酶切割,成一定大小的片段，进行,变性凝胶电泳，,将凝胶电泳形成的,DNA,区带,转移到膜上,再进行杂交，这种技术称作,Southern,杂交。,将,RNA,凝胶电泳形成的区带转移到膜上再进行杂交称作,Northern,杂交。,将,蛋白质,凝胶电泳形成的区带转移到膜上再与酶标抗体进行特异反应称作,Western,印迹技术。,将,蛋白质等点聚焦,形成的区带转移到膜上再与酶标抗体进行特异反应称作,Eastern,印迹技术。,分子杂交技术在现代生命科学中的应用十分广泛。,将人工合成的,探针,用点样机点到玻璃或塑料基片上形成高密度的,阵列，,将,样品,DNA,用限制性内切酶切割成一定大小的片段，变性后用,荧光基团标记，,再进行,分子杂交操作，,这就是,DNA,芯片技术,的基本原理。用类似的技术可以制成,蛋白质芯片。,按指令在基片上合成探针，可以制成密度特别高的芯片。,生物芯片技术有非常广阔的应用前景。,基本要求,1.,熟悉核酸的水解方法及水解产物。,2.,掌握核酸的酸碱性质。,（重点）,3.,掌握核酸的紫外吸收。,（重点）,4.,掌握核酸变性、复性及杂交的有关知识及应用。,（重点、难点）,第15章,核酸的研究,方法,一、核酸的分离、提纯和定量测定,(,一),DNA,的分离,用1,mol/L,的,NaCl,制备组织匀浆,离心除去组织残渣,多次用苯酚处理使蛋白质变性,每次处理后离心取上层水相,最后加2倍体积的乙醇沉淀出,DNA,。,(二),RNA,的分离,由于,RNA,酶存在广泛,且十分稳定,破碎细胞时要加入胍盐破坏,RNA,酶,试剂要用0.1%的,DEPC,（焦碳酸二乙酯）配制,器皿要高压灭菌或用0.1%的,DEPC,处理,多次用苯酚或氯仿处理使蛋白质变性,每次处理后离心取上层水相,mRNA,可用寡聚,dT-,纤维素亲和层析从总,RNA,中分离。,(三)核酸含量的测定法,常用的方法是测定260,nm,的消光度,用公式计算核酸的含量。,核酸的含量也可以用定磷法测定。,DNA,的含量可以用二苯胺显色法测定。,RNA,的含量可以用地衣酚显色法测定。,（四）核酸的超速离心(图15-2),超速离心可以分离超螺旋,DNA,（密度大）,线性,DNA,（密度小）和闭环,DNA,（密度居中）。也可以分离,RNA,。,（五）核酸的凝胶电泳(图15-3),松弛型，,OC,Open circular DNA,超螺旋,CCC,covalently-closed circular DNA,从细菌抽提得到的质粒,DNA,样品中不含线状,DNA,二、核酸的核苷酸序列测定和化学合成,(,一),DNA,的酶法（末端终止法）测序,(,二),DNA,的化学法测序,DNA,酶法测序自动化,使用4种荧光素标记的双脱氧核苷酸，毛细管电泳和激光扫描技术使测序自动化，一个泳道一次可测大约1000个核苷酸，测序已成为可以快速完成的常规技术。人类基因组测序已经完成，多态性的研究和功能基因组学已经成为研究的热点。,由于测序仪在一个泳道只能准确测出几百个核苷酸，对于长,DNA,只能将其切成小段再测序，为了组装，需要确定足够多的标记位点。,常用遗传图、转录图、物理图、序列标签位点,(STS),、表达序列标签,(EST),等方法确定标记位点。,限制性酶切位点分析是绘制物理图的常用方法,(,三),RNA,的测序,1.,RNA,的测序可以用4种特异性的酶切割（从胰脏提取的,RNase A,水解嘧啶核苷酸的磷酸二酯键，米曲霉中提取的,RNase T,1,水解鸟苷酸的磷酸二酯键，黑粉曲霉中提取的,RNase U,2,水解腺苷酸的磷酸二酯键，多头黏菌中提取的,RNase Phy,水解,A,、,U,、,G,三种核苷酸的磷酸二酯键）,凝胶电泳分离，用类似蛋白质序列分析的方法推断核苷酸序列。,2.,也可以用化学试剂断裂,RNA,链，用类似,DNA,化学测序的方法推断核苷酸序列。,3.,最常用的方法是逆转录成,cDNA,，用,DNA,测序的方法推断核苷酸序列。,（四）聚合酶链反应（,PCR）,原理,PCR(polymerase chain reaction),是应用最广的分子生物学技术之一，模板,DNA,的含量依指数方式增加，可用来快速在体外扩增,DNA,PCR,技术在临床检验和分子生物学中的应用十分广泛。耐热,DNA,聚合酶的发现推动了这一技术的广泛应用。,PCR,技术的扩展,典型的,PCR,经过一定的调整可用于特殊的研究工作，使,PCR,技术扩展到分子生物学的各个方面，较常用的技术扩展有：,1.“,巢式”,PCR(nested PCR),先用一对引物对模板进行扩增，然后再用另一对引物扩增第一对引物扩增的产物，这一,PCR,技术即巢式,PCR,。第一次扩增所用引物称,外引物,(outer-primer),，第二次扩增作用的引物称,内引物,(inter-primer),。,进行,“,巢式,”,PCR,可将,外引物设计得比内引物长一些，且用量较少,，用外引物进行时，采用,较高退火温度使内引物不能与模板结合,，故只有外引物扩增。经过若干循环，待外引物基本消耗完毕后，只需降低退火温度即可直接进行内引物的,PCR,扩增。这种,PCR,技术被称为,“,中途进退式,”,PCR,(drop-in-drop-out PCR),。,“,巢式,”,及,“,中途进退式,”,PCR,主要用于,极少量模板,的扩增。,2.,复合,PCR(multiplex PCR),在同一反应中用,多组引物同时扩增几种基因片段,的方法称复合,PCR,。复合,PCR,主要用于同一病原体分型及同时检测多种病原体。此外也常用于多点突变性分子病的诊断。,3.,不对称,PCR(asymmetric PCR),两种引物比例相差较大,的,PCR,称不对称,PCR,。不对称,PCR,可制备用于核酸序列分析的单链,DNA,片段或核酸杂交的探针等。,4.,反转录,PCR(reverse transcription PCR),由于,Taq,酶只能以,DNA,为模板，当待扩增模板为,RNA,时，需先将其,反转录为,cDNA,才能进行,PCR,扩增,，这种,PCR,技术称为反转录,PCR,，在分子生物学和临床检验等领域均有广泛应用。,5.,涂片,PCR(slide-PCR),直接对载玻片上,细胞涂片或组织切片进行,PCR,扩增的方法称涂片,PCR,。涂片,PCR,结合原位杂交技术特别适用于病理切片中含量较少的靶序列的,PCR,检测。,6.,反向,PCR(inverse PCR),扩增引物相反方向,DNA,序列的,PCR,技术称反向,PCR,。在反向,PCR,中，要先将含有一段已知序列的感兴趣的未知,DNA,片段进行,酶切和环化,，然后直接进行,PCR,，也可将已知序列酶切后再进行,PCR,。反向,PCR,主要用于,已知序列两翼未知,DNA,序列的扩增。,7.,锚定,PCR(anchored PCR),用酶法在一通用引物反转录的,cDNA,3,端加上一段已知序列,，然后以此序列,为引物结合位点对该,cDNA,进行,PCR,扩增称为锚定,PCR,，可用于未知,cDNA,的制备及低丰度,cDNA,文库的构建,。,8.,修饰引物,PCR,为达到某些特殊应用目的如,定向克隆、定点突变、体外转录及序列分析,等，可在引物的,5-,末端加上酶切位点、突变序列、转录启动子及序列分析物结合位点等，这种,PCR,技术称为修饰引物,PCR,。此外，还可将一些信号分子如荧光素、生物素等连接于引物的,5,末端，当,PCR,完成后可对产物直接进行检测。,PCR,在生命科学中的应用非常广泛，已有不少专著可供读者参考。,（五）,DNA,的化学合成,固相磷酰亚胺法合成时，末端核苷酸的,3-OH,与固相载体成共价键，,5-OH,被,4,，,4-,二甲氧基三苯甲基,(DMTr),保护，下一个核苷酸的,5-OH,亦被,DMTr,保护，,3-OH,上的磷酸基上有,-N(C,3,H,7,),2,和,-OCH,3,两个基团，,3-OH,因此被活化。,每延伸一个核苷酸需四步化学反应：,(1),脱三苯甲基：末端核苷酸的,DMTr,用三氯乙酸,/,二氯甲烷溶液脱去，游离出,5-OH,。,(2),缩合：新生成的,5-OH,在四唑催化下与下一个核苷,3-,磷酰亚胺单体缩合使链增长。,(3),盖帽：有少量,(,小于,0.5%),未缩合的,5-OH,要在甲基咪唑或二甲氨基吡啶催化下用乙酸苷乙酰化封闭，以防进一步缩合造成错误延伸。,(4),氧化：新增核苷酸链中的磷为三价亚磷，需用碘氧化成五价磷。上述步骤循环一次，核苷酸链向,5,方向延伸一个核苷酸。,基本要求,1.,掌握核酸的分离、提纯、定量测定、超速离心和凝胶电泳等基本方法。,（重点）,2.,熟悉核苷酸序列测定的原理。,（难点）,3.,熟悉,DNA,聚合酶链反应的原理及应用。,（难点）,4.,熟悉,DNA,化学合成的原理及应用。,（难点）,</p>