流行性脑脊髓膜炎实验室诊断.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,流行性脑脊髓膜炎实验室诊断,天津市卫生防病中心病原生物学部,井良义,何谓流行性脑脊髓膜炎？,流行性脑脊髓膜炎（简称流脑），是由脑膜炎奈瑟菌（,Neisseria meningitides,，,Nm,）通过呼吸道传播所引起的化脓性脑膜炎，常在冬春季节引起发病与流行,患者以儿童为多见，现在成年人发病有增多趋势。人受,Nm,感染后大多数表现为鼻咽部带菌状态，只有少数成为流脑患者。,正常人群中,Nm,带菌率可达,5,30%,。，带菌者为流脑流行的重要传染源。,细菌经飞沫传播，患者潜伏期,1,4,天，其发展经过可分为三期：,1.,首先侵入鼻咽腔，引起上呼吸道感染，有时局部有炎症。,2.,少数细菌侵入血流，造成单纯 菌血症，可有突然发作的恶寒、发热、恶心、呕吐等，并可有出血性或红斑性皮疹，或称淤血点。,3.,大量细菌侵入，由血液或淋巴到达脑脊髓膜，引起脑脊髓膜炎的症状与体征，如头痛、呕吐、颈项强直、发热等一般脑膜炎症状。,适宜的检测样品,鼻咽拭子、血液、皮肤粘膜出血点挤出液、血清及脑脊液等。,其中脑脊液、血液、皮肤粘膜出血点挤出液中检出脑膜炎奈瑟氏菌可直接作为确诊依据。,样品采集与运送,样品采集（一）,脑脊液：无菌操作，吸出,CSF 35mL,，立即放到无菌试管内离心,(2000,3000r/min,，,30min),，用灭菌过的毛细管吸取沉淀物直接接种到,10,羊血巧克力色琼脂上,(CSF,上清液部分供检测,Nm,特异抗原，亦可将其置于,20,待测,),，,5,二氧化碳环境,37,培养,24,72h,，每日检查细菌生长的情况，及时分离纯培养物供鉴定。,样品采集（二）,血液：采取病人急性期静脉血液,6mL,，无菌操作往盛有,30mL,增菌用的葡萄糖肉汤三角瓶内注入,4mL,血液,(,余下的,2mL,血液同上离心后吸出血清，供检测,Nm,特异抗原和抗体，亦可将其置于一,20,待测,),，同上述条件培养,2472h,，每日进行分离培养。,样品采集（三）,淤血点：选病人皮肤上的新鲜淤血点或淤斑，消毒后用针头挑破，挤出组织液，用无菌棉签蘸取先接种含双抗的葡萄糖增菌肉汤管中增菌,812h,后分离培养或直接接种,10,羊血巧克力色琼脂；涂片，干后革兰染色，直接镜检。,样品采集（四）,咽拭子：用长柄棉拭子采咽后壁两侧分泌物，立即接种卵黄双抗培养基或巧克力双抗平板，也可将咽拭子放入液体双抗增菌管内，增菌,8,12h,后分离培养。,咽拭子接种,咽拭子接种,不合格咽拭子接种,不合格咽拭子接种,样品的处理和运送,早期采集样品：应尽可能采集病人用药前的早期样品，这可以明显提高病原的检出水平。,及时处理样品：应尽可能地做到床边接种，若无可能则应在最短的时间内送到实验室进行接种培养。,保温运送：应尽可能保持样品处于,2036,之间，切记不能低温运送（检测抗体的血清标本除外）。,流脑病原学检查方法,生长特性,脑膜炎双球菌为专性需氧菌，初次分离时需,510%,的二氧化碳环境才能生长，最适生长温度为,37,。,菌落特征及菌体形态,菌落：,Nm,接种于巧克力色琼脂平皿上，,5%CO2,，,37,培养,24,小时后，其菌落直径约,1mm,，表面突起、光滑、湿润、圆整、略带灰白色、半透明、不溶血、无色素。,细菌形态：为革兰氏阴性，呈卵圆形和肾形，,0.80.6,大小。常成对排列，邻近两边扁平凹陷,菌 落 特 征,菌 落 特 征,脑 脊 液 涂 片,生化特征,分解葡萄糖和麦芽糖，产酸不产气。,不分离蔗糖、果糖和乳糖。,过氧化酶和氧化酶阳性,血清分群鉴定,检查从病人分离的疑似,Nm,时，先用多价,、多价,、多价,抗血清检测，如果阳性再用分群血清（,A,群、,B,群、,C,群、,W135,群抗血清等）检测。,不与盐水发生凝集，与一种脑膜炎抗血清发生凝集反应，即为某一型的流脑菌。,在盐水中发生凝集反应，不能作为抗血清分群。,菌种保存,短期保存：保存脑膜炎双球菌，用卵黄盐水保存，可保存,7,天。,2,长期保存：最好方法是低温冷冻或冷冻干燥。所有的细菌都可在,-70,冰箱中冷冻保存。将脑膜炎双球菌接种巧克力平板中，放二氧化碳培养箱中,35,37,孵育,18,20,小时，收集细菌放到含,1ml,脱脂牛奶的,2ml,螺盖冷冻瓶中。将菌苔在管壁研磨振荡，使细菌分散在培养基中。,-70,低温冰箱分类保存。,流脑血清学检查方法（一）,玻片凝集试验,:,应用玻片凝集试验对,Nm,病原菌株或带菌者菌株进行血清学分群。,Nm,诊断血清：国产售品有多价,（包含,A,、,B,、,C,、,D,群），多价,含,1889,（,Y,）、,1890,（,H,）、,1892,（,29E,）,，多价,含,319,（,W135,）、,1916,（,X,）、,1486,（,I,）、,1811,（,K,）群,及各群单价血清，共计,14,种。（括号内为国际编码）,流脑血清学检查方法（二）,酶联免疫吸附试验（,ELISA,）：应用,ELISA,间接法测病人急性期和恢复期血清中抗,A,群流脑,IgG,的抗体水平。此方法也可以应用于健康者血清抗体的测定。若病人恢复期血清抗体效价较急性期呈现,4,或,4,倍以上升高有追溯诊断的意义。,流脑血清学检查方法（三）,杀菌力试验：应用微量杀菌力试验,(TTC,法,),测定病人急性期和恢复期血清中对,Nm,的杀菌抗体水平。此方法也可用于健康人群的血清抗体测定。,流脑其它检查方法（一）,胶乳凝集试验应用胶乳凝集实验测定病人,CSF,、急性期血清和尿中,Nm,群特异抗原，辅助流脑临床诊断。可用市售的脑膜炎乳胶凝集试剂盒（如法国梅里埃公司的试剂盒）。方法：一滴乳胶试剂（,30l,）加上一滴病人的脑脊液，涂匀，在,2,分钟内出现明显凝集者为阳性。,流脑其它检查方法（二）,PCR,检测：应用,PCR,检查病人急性期血清或,CSF,中,Nm,的,DNA,特异片段，对流脑病人进行早期诊断。,培养基制备,巧克力色血液琼脂：成份：营养琼脂（,pH7.6,）,100ml,脱纤维血,510ml,制法：将营养琼脂溶解，以无菌手续加入羊血，摇匀。置水浴锅内，维持在,902030min,。待培养基冷至,50,时才倾注平板。如做病人密切接触者或健康人群带菌调查时，则需加双抗，每,1000ml,培养基加入多粘菌素,4.2mg,（或,2.5,万单位），万古霉素,3.3mg,。,卵黄盐水,将新鲜鸡蛋洗净，在,70%,酒精中浸泡消毒,1h,后取出，用,3%,碘酒消毒蛋壳，以无菌操作于鸡蛋的一端开一小孔，使蛋清全部流尽，蛋黄倒入置有玻璃珠的三个烧瓶中，打碎后，一份蛋黄加一份生理盐水，再在摇珠瓶中振摇，使其混匀呈乳状分装试管，,56,加温,30 min,，置,37,作无菌试验。（脑膜炎双球菌保菌用）,增菌肉汤,成份：新鲜牛肉汤,100ml,葡萄糖,0.5g,配制：混合上述成份，调,pH,至,7.47.6,分装试管，,2ml/,管或,30ml/,瓶，高压灭菌,10,磅,10,分钟，无菌检验合格后供增菌用。,诊断试剂,1,、诊断血清：中国,CDC,传控所呼吸道细菌室流脑组（北京昌平流字五号）或中国药品生物制品检定所（天坛西里,2,号）。,2,、巧克力平板：自制或市售。,3,、多粘菌素或万古霉素：北京陆桥技术有限责任公司有售。,4,、胶乳凝集试剂盒：法国梅里埃公司有乳胶凝集法脑膜炎检测试剂盒。可测定,A,群、,B,群及,C,群流脑，所用材料为病人脑脊液。,谢 谢,2006.08.23,