抗体工程制药.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2003.4.7.,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2003.4.7.,*,第七章,抗体工程制药,1,一,.,概述,抗体,(,工程,),制药,生物技术制药领域的重要组成部分,2,抗 原,(antigen,Ag),-,是指那些能够刺激和,/,或诱导机体免疫系统发生免疫应答、产生抗体和,/,或致敏（效应）淋巴细胞，同时又能与免疫应答产物在体内外特异性结合，发生免疫反应的物质。,如：病原微生物、免疫血清、药物、疫苗,对机体来说，抗原相当于一个国家已知的或潜在的外部的或内部的“敌人”,。,3,免疫原性,：指能刺激机体,产生,抗体和,/,或致,敏淋巴细胞的性能。,反应原性：,能与相应的抗体和,/,或淋巴细胞,发生,特异性结合,，发生反应的性能。,4,完全抗原：,既具有免疫原性，又具有反应原性的抗原。,如微生物、异种血清,半抗原：,又称,不完全抗原,。是指其本身只有反应原性，,但没有免疫原性的简单小分子的抗原物质。如,某些药物（青霉素，等）、多糖、类脂。,5,目前，在中草药中发现广泛存在半抗原，如小檗碱、茶碱、丹参酮等，具有生化活性基因的化学成分都有可能成为半抗原，这些半抗原可与体内蛋白质结合成完全抗原，造成一些过敏反应。,6,抗原的特异性既表现在免疫原性上，也表现在反应原性上。,沙门氏杆菌,大肠杆菌,抗大肠杆菌的抗体,抗沙门氏杆菌的抗体,结合,结合,7,免疫球蛋白的结构,抗体,：,能与相应抗原特异性结合的具有,免疫功能的球蛋白,。,8,抗体的产生过程：,机体免疫系统受抗原物质刺激后，,B,淋巴细胞,被激活，增殖和分化为浆细胞，由浆细胞合成和分泌的球蛋白。,9,免疫球蛋白,(immunoglobulin,Ig),分子量范围从,150,000,到,950,000,道尔顿。,分五类：,IgG,在血清中含量最高，达,75,80%,是抗感染,的主要抗体,;,IgM,是五类免疫球蛋白中分子量最大的，为,五聚体,是对一个抗原作出反应时产生的,第一个抗体IgA,在黏膜表面、乳腺、泪腺形成，主要参,与局部的免疫反应,;,IgD,在血清中含量很低,;,IgE,在血清含量最少。,免疫球蛋白,IgG,IgM,IgA,IgD,IgE,10,动物血清中产生抗体的时间示意图,抗原刺激的第一至三周，,IgM,生成；抗原再刺激后，,Ig,将取代,IgM,11,抗体研究的发展阶段：,以,1890,年,Behring,发现,白喉抗毒素,为代表,用抗原免疫动物来获得,多克隆抗体,。,以,1975,年,Milstein&Kohler,创建,杂交瘤技术,制备,单克隆抗体,(McAb),为代表。,以,1994,年,Winter,创建了,噬菌体抗体库,(repertoire of antibodies displayed on phages),技术,以基因工程方法制备抗体为代表。在此基础上发展成抗体工程。,12,多克隆抗体,:,一种抗原,具有,多个,抗原决定簇,每个抗原决定簇都能刺激,一个,B,细胞产生一种抗体。这样所获得的免疫血清是多种抗体的混和物。,单克隆抗体,(,Monoclonal antibody,McAb):,由,一个,抗原决定簇,刺激的、,单一,的,B,细胞和骨髓瘤细胞融合增殖后所产生的、,高度均一,的抗体。,1,2,3,4,13,多克隆抗体和单克隆抗体,Pure single Ab,After immunization,the mouse spleen contains B cells producing,specific antibodies.,Each B cell produces only one kind of antibody,which binds to i,ts specific antigen.,Conventional antiserum is the mixture of all antibodies produced,by B cells from spleen.,If a single B cell was picked up and cultured,then it will prod,uce only one kind of antibody.,But B cell can not survive well in the culture.,Each hybridoma line can produce pure single antibody,called mon,oclonal antibody.,If B cell is fused with myeloma,the fused cell might be culture,d and produce antibody.,Adapted from M,ilstein(1980),Scientific American,Oct.p.58,1,2,3,4,m,m,m,m,1,2,3,4,1,2,3,4,Monoclonal,antibodies,Cell fusion,Spleen cells,+,Myeloma,x,Antiseum,Antigen,Immunization,A mixture of all Ab,1,2,3,4,B,A,L,B,/,c,1,2,3,4,1,2,3,4,B cell,Pure single Ab,After immunization,the mouse spleen contains B cells producing,specific antibodies.,Each B cell produces only one kind of antibody,which binds to i,ts specific antigen.,Conventional antiserum is the mixture of all antibodies produced,by B cells from spleen.,If a single B cell was picked up and cultured,then it will prod,uce only one kind of antibody.,But B cell can not survive well in the culture.,Each hybridoma line can produce pure single antibody,called mon,oclonal antibody.,If B cell is fused with myeloma,the fused cell might be culture,d and produce antibody.,Adapted from M,ilstein(1980),Scientific American,Oct.p.58,1,2,3,4,m,m,m,m,1,2,3,4,1,2,3,4,Monoclonal,antibodies,Cell fusion,Spleen cells,+,Myeloma,x,Antiseum,Antigen,Immunization,A mixture of all Ab,1,2,3,4,B,A,L,B,/,c,1,2,3,4,1,2,3,4,B cell,14,McAb,（,Monoclonal antibody,，单克隆抗体）：,将在体外不能长期传代的抗体产生细胞（如,Balb/C,小鼠的免疫脾细胞）与在体外能迅速增殖并带有抗药标记的骨髓瘤细胞（如小鼠的,NS-1,或,SP2/0,）在聚乙二醇（,PEG,）作用下融合，然后利用抗药性标记和经稀释法选出单个产生抗体的杂交瘤细胞，再用血清学方法证实其与抗原结合的特异性和亲和力。这样的杂交瘤细胞能长期传代同时分泌针对单一抗原上单一抗原表位的抗体，称为,McAb,（第二代抗体）。,二,.,单克隆抗体的制备,15,二,.,单克隆抗体的制备,单克隆抗体制备过程图解,16,单克隆抗体制备过程图解,17,18,一,.,抗原与动物免疫,1.,抗原选择,完整细胞,(,肿瘤细胞,),；可溶,性蛋白质或多肽,;,2.,免疫动物,小鼠,(Balb/C,鼠龄,6-8,周,),或,大鼠,(Lou);,19,3.,常用的骨髓瘤细胞系,SP2/0,，,P3.653,细,胞，都是次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶,(HGPRT),的缺乏株,。,4.,免疫方法,:,体外免疫法；体内免疫法,20,体内免疫法颗粒性抗原,(,如细菌、细胞,),的免疫原性强,可不加佐剂,可溶性抗原则按每只小鼠,10-100ug,抗原与,弗氏完全佐剂,等量混合后注入腹腔内,.,弗氏完全佐剂,（,Freund,s complete adjuvant,FCA,）,:,由矿物油（如降脂烷或液体石蜡等）、乳化剂和灭活的分枝杆菌组成的乳化佐剂。,弗氏不完全佐剂,不含,分枝杆菌,21,免疫佐剂（,adjuvant,),（,1,）定义：先于抗原或同时与抗原混合注射机体,可增强抗原的免疫原性的物质。,（,2,）应用,弱免疫原性物质；,免疫原剂量不足。,（,3,）佐剂种类,1),油性乳剂,弗氏佐剂,（,Freund adjuvant,）,2),无机化合物,3),微生物及其产物,4),脂质体,5),细胞因子,22,二,.,细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养,1.,细胞融合的基本方法,(PEG,促融,),脾细胞 骨髓,瘤,细胞,(,“,永久,”,细胞,),(110,8,)(2,310,7,),聚乙二醇,(PEG),37-40,2mins,融合细胞,（杂交瘤细胞）,用作细胞融合剂的聚乙二醇,(PEG),一般选用,MW,4000,，常用浓度为,50,，,pH8.0,pH8.2,。,可加入二甲基亚砜,(DMSO),。,2002,年,12,月神舟,4,号飞船搭载,B,淋巴细胞和骨髓瘤细胞升空进行细胞融合实验,23,原理：,细胞进行融合时，培养液中只有部分细胞融合成杂种细胞，还有大量未融合的双亲细胞。这就需要选择分离纯化杂种细胞。为此要,创造一种只让杂种细胞生长繁殖而亲本细胞死亡的环境,。这就要利用杂种细胞和亲本细胞对生长条件的要求和代谢的差异来进行选择。其中,最常用的是,HAT,选择系统,。,24,2,、杂交瘤细胞的,选择性培养,常用的选择培养基为,HAT,培养基,。,次黄嘌呤,(H),、氨基喋呤,(,A,能阻断,DNA,合成,),、胸腺嘧啶,(T),。,脾细胞具有,次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶,(HGPRT),因此脾,-,瘤融合的杂交瘤细胞可利用,HGPRT,酶,用次黄嘌呤,(H),和胸腺嘧啶,(T),合成,DNA,使杂交瘤细胞得以生长。,25,HAT,选择,培养机制,主要途径,糖,氨基酸 氨甲喋呤,（,A,）,次黄嘌呤,(H),GMP,核苷酸,DNA,HGPRT,核苷酸前体,TK,(,胸苷激酶,),胸腺嘧啶核苷,(T),dTMP,26,HAT,培养基：,H,为次黄嘌呤，是,HGPRT,的底物，为,DNA,合成提供原料（核苷酸旁路合成原料）,A,可阻断正常的,DNA,合成（嘌呤及,TMP,合成受抑制）,T,在胸苷激酶（,TK,）的作用下生成胸腺嘧啶核苷酸，为,DNA,合成提供原料,27,含有饲养细胞的,24/96,孔板内悬浮培养，,2,3,天,换液一次,(HAT,的培养液,7,天内,),第,7,14,天,改用,HT,培养液（对照阻的骨髓瘤细胞已死亡）,14,天以后,用普通的,RPMI1640,完全培养液。,常用的饲养细胞有小鼠腹腔巨噬细胞、脾细胞和胸腺细胞等。,8,9,天可对所有克隆生长孔的培养上清进行抗体检测,筛选出产生抗体的阳性克隆,.,28,培 养 板,29,B,细胞杂交瘤的技术流程,30,三,.,筛选阳性克隆与克隆化,1.,筛选方法：,免疫酶技术,放射免疫技术,免疫荧光技术,31,（,1,）免疫酶技术,原理：将,抗原和抗体,的免疫反应和,酶的催化反应,相结合的技术。酶与抗体或抗原结合后，既不改变抗体或抗原的免疫学反应的特异性，也不影响酶本身的酶学活性，在相应而合适的作用底物参与下，使,基质水解而呈色,，或使供氢体由,无色的还原型,变为,有色的氧化型,，从而表明某种抗原或抗体的存在。,32,33,（,2,）免疫荧光技术,原理：,将,抗原抗体,反应的特异性和敏感性与,显微示踪,的精确性相结合。以,荧光素,作为标记物，与已知的抗体（或抗原）结合，然后将荧光素标记的抗体或抗原作为标准试剂，用于检测和鉴定抗原或抗体,。,免疫荧光技术,用于细胞抗原的抗体检测,特别是检测患者活检组织标本。,34,35,（,3,）放射免疫技术,原理：将,同位素,分析的高灵敏度与,抗原抗体,反应的特异性相结合，以,放射性同位素,作为示踪物的标记免疫测定方法。,放射免疫测定原理示意图,36,2.,克隆化,为提高筛选出来的阳性克隆的稳定性，将,单个细胞通过无性繁殖而获得细胞集团的整个培养过程。,有限稀释法,：通过一系列稀释，使每个细胞培养孔平均,只含一个细胞,，而分离细胞,软琼脂法,：,将杂交瘤细胞悬液分散在半固体营养琼脂糖上，使呈,单个细胞,定位生长繁殖，以达到克隆化的目的。,37,四,.,杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定,1.,杂交瘤细胞借助染色体分析鉴定,多数为端着丝粒染色体,染色体数目,接近两种亲本细胞染色体之和。,2.,抗体鉴定,Ig,类和亚类鉴定：免疫扩散或,ELISA,法,亲和力鉴定,38,抗体类别鉴定（,Ig,类和亚类鉴定）,抗体分子因有大小、带电量、溶解度及其与抗原的作用不同，可分为不同的类和亚类。,IgG,（,IgG1,、,IgG2,、,IgG3,、,IgG4,）,IgA,（,IgA1,、,IgA2,）,IgM,（无）,IgD,（无）,IgE,（无）,39,1,）免疫扩散,指可溶性抗原与相应抗体在,液相中,特异结合后，形成的免疫复合物受电解质影响出现的,沉淀线,现象。,单向免疫扩散,双向免疫扩散,40,（,2,）酶联免疫吸附法,(,ELISA,),原理：先将抗体或抗原包被到某种固相载体表面，再将待检样本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应，用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离的未结合成分，最后加入酶反应底物，根据底物被酶催化产生的颜色及其吸光度,(A),值的大小进行定性或定量分析的方法。,41,ELISA,42,ELISA,43,五,.,单克隆抗体的工业化生产,单克隆抗体的生产包括细胞培养、提纯和制剂等工艺过程。,1.,杂交瘤细胞的大规模培养,生物反应器：气升式发酵罐，中空纤维培养,罐，微囊发酵罐,培养基：牛淋巴液，血清,44,2.,单克隆抗体的大量制备的方法,体外培养法,(,收获,10-400ug/ml,抗体,),酶标板上培养,微载体悬浮培养（固体颗粒用,DEAE-Sephadex A50,等材料）。,动物体内诱生法,用,0.5ml,降脂烷,/,液体石蜡注入腹腔,然后注射,110,6,杂交瘤细胞，再,收获,5,2Omg/ml,抗体。,支原体污染！,45,3.,单克隆抗体,(McAb),的纯化,纯化单克隆抗体流程,(,大鼠,),单抗纯化方法,:,超滤法,盐析法,离子交换法,凝胶过滤法,HPLC,法等,46,三,.,单克隆抗体,药物的现状,250多种抗体类药物在临床试验中,1/3已进入三期临床,1/4已通过临床,III,期试验,美国市场上有13种治疗用的抗体药物,抗体药物的销售额,97-99年由4.68亿美元增长到13亿美元,03年抗体类药物总销售额达到50亿美元,47,抗体药物市场销售额,2011,48,全球有超过200家上市或未上市公司正在研发用于临床诊断和治疗的单克隆抗体,正在进行临床试验的抗体公司（38家）：,Abgenix,Alexion Pharm,Altarex,Applied Molecular Evolution,BASF,Biogen,BioTransplant,CAT(Cambridge Ab Tech),Celltech,Centeon,Centocor(Johnson&Johnson),Elan,Elsai,Eli Lilly,Genzyme,Transgenics,Genentech,Genmab,Hoffman-La Roche,ICOS Pharm,IDEC Pharm/Mitsubishi,ImClone Sys,Immunotech,Kanebo,Knoll Pharm,LeukoSite,Medarex,Medimmune,Norvartis,Ortho Biotech,Pasteur-Merieux,Progenics,Protein Design Lab,Schering,SmithKline Beecham,Tanox Biosystems,Techniclone,Xoma,Zenyaku,49,当前美国治疗性抗体市场,ReoPro(J&J,Centocor,Lilly),1994/,$461 M,Abciximab,鼠 抗,GPIIb/II,抗体,防止血小板凝集,凝血性心血管疾病,-AMI,不稳定型心绞痛,Rituxan(IDEC/Genentech/Roche),1997/,$303 M,Rituximab,嵌合 抗,CD20,抗体,非霍奇金氏淋巴瘤,Herceptin(Genentech),1998/,$204 M,Trastuzumab,人源化 抗,HER-2/Neu,抗体,HER-2,过量表达乳腺癌,Synagis(Medimmune),1998/,$285 M,Palivizumab,人源化 抗-,RSV F,糖蛋白抗体,小儿,RSV,感染,50,当前美国治疗性抗体市场,Remicade(Centocor),1998,$130 M,Infliximab,嵌合 抗,TNF-,抗体,局限性肠炎,，,类风湿关节炎,Zenapax(PDL,Roche),1997,$130 M,Dacliximab,人源化,抗,Tac(IL-2 Receptor),抗体,移植排斥,Orthoclone OKT3(Ortho Biotech),1998,$60 M,Muromonab,鼠 抗,CD-3(T cells),抗体,移植排斥,Simulect(Novartis),1998,$54 M,Basiliximab,嵌合 抗,CD25(IL-2 Receptor),抗体,移植排斥,51,抗体类型,商品名,应用,鼠源单克隆抗体,Orthoclone,器官移植排斥,嵌合抗体,Peopro,冠状动脉成形术，心绞痛,嵌合抗体,Rituxan,B,细胞型非霍奇金淋巴瘤,嵌合抗体,Simulect,器官移植排斥,嵌合抗体,Remicade,回肠炎，类风湿性关节炎,人源化抗体,Zenapax,器官移植排斥,人源化抗体,Synagis,婴儿呼吸道合胞病毒,人源化抗体,Herceptin,乳腺癌,人源化抗体,Campath,慢性淋巴细胞白血病,人源化抗体偶联物,Mylotarg,急性复发骨髓白血病,鼠源抗体放射性偶联物,Zevalin,B,细胞型非霍奇金淋巴瘤,52,中国抗体研究现状,单抗诊断剂：,针对乙型肝炎表面抗原,流行性出血热,抗人,T,淋巴细胞及亚群,风疹病毒,黑热病,抗人绒毛膜促性腺激素,霍乱,抗人白细胞相关抗原,抗人免疫球蛋白的系列,脊髓灰质炎病毒,呼吸道合胞病毒,登革热,99,mTc,肺癌单抗片段诊断剂进入,I,期临床。,单抗治疗剂：,碘131,I-,肝癌单抗片段,注射液，,2010,年已完成,V,期临床 成为低毒、安全、有效的,肝癌靶向治疗药物,。,华神利卡汀,2.88w/,支,乙脑单抗治疗剂进入、和期,临床试验，,肾综合症出血热单抗进入、和期临床。,53,中国,人源基因工程抗体,研究获重大,成果,中国预防医科院病毒所青年科学家,梁米芳,研究员率领的课题组，在,“,治疗用人源基因工程抗体基础与应用研究,”,中取得多项重要成果。在,世界上首先研制成功抗坦病毒、抗甲肝病毒、抗狂犬病毒,人源基因工程抗体,，并获得拥有自主知识产权的全抗体表达载体系统。,与血源制品比较，此抗体具有抗体含量高、无免疫源性、无污染源、可连续规模生产等优势，,是一类新兴的特异性抗病毒感染的生物工程药物,。此成果为我国防治病毒性疾病探索出一条新的途经，具有良好的应用开发前景。,-2004,54,原液保存,细菌疫苗工艺流程示意图,菌种筛选,种子批的,建立及检定,菌种接种,原液合并,半成品,配置,杀菌,原液收获,扩大培养,分装,包装,检定,中国疫苗研究：,55,病毒原,液保存,病毒疫苗,工艺流程,毒种筛选,种子批的,建立及检定,毒种接种,#,培养细胞,原液合并,半成品,配置,病毒灭活,病毒的收,获过滤,扩大细,胞培养,分装,包装,检定,原代细胞的,制备或传代,细胞复苏,减毒活疫苗,56,抗体的治疗应用,抗肿瘤,抗感染,抗器官移植排斥反应,治疗自身免疫性疾病和变态反应性疾病,57,抗体药物迅速发展的主要障碍,人体免疫系统对鼠源蛋白的排斥反应,抗体,人源化,是解决问题的唯一途径,58,四,.,单克隆抗体人源化的改进,鼠抗体人源化（人-鼠嵌合、改型抗体）,小分子抗体（,Fab、,单链、单域、超变区多肽）,基因工程抗体（双特异、免疫黏连素、催化抗体）,人源抗体（噬菌体抗体库、转基因小鼠）,人-人抗体,59,基因工程抗体研究内容：,抗体人源化：,鼠单克隆抗体的人源化,(嵌合抗体、改型抗体),小分子抗体,单价(,Fab、ScFv、,单域抗体、超变区多肽)多价（,Diabody,Triabody,Minibody）,特殊类型抗体,(双特异性抗体、细胞内抗体、抗原化抗体、免疫脂质体),抗体融合蛋白,（免疫粘连素、免疫毒素、催化抗体）,构建抗体库从中筛选新的单抗,，即噬菌体抗体。,60,1,人一鼠嵌合抗体,(Chimeric Antibodies),人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与人抗体的恒定区融合而得到的抗体。,第一代,61,人鼠嵌合抗体构建过程：,将鼠源单抗的,可变区基因,克隆出来，连到包含有,人抗体恒定区基因,及表达所需的其它元件,(,如启动子、增强子、选择标记等,),的表达载体上，在哺乳动物细胞,(,如骨髓瘤细胞、,CHO,细胞,),中表达。,62,克隆鼠单抗的可变区基因，可从,基因组文库,中分离，也可用,PCR,技术,分离。,人抗体恒定区可根据需要选择，不同的恒定区会带给嵌合抗体不同功能。为避免人抗体的恒定区产生不需要的副作用，可通过点突变来修饰调整其效应。,人一鼠嵌合抗体与鼠单抗相比，,免疫原性大大降低，利于在人体内应用,，所以目前已制备出上百种抗各种抗原,(,包括肿瘤相关抗原,),的嵌合抗体。,嵌合抗体,独特的抗体亲和力保持得很好，但因鼠单抗可变区的存在，应用时仍有较强的,人抗鼠抗体反应,(,HAMA),反应。,63,在嵌合抗体的基础上进一步将鼠,MAb,可变区中相对保守的,FR(framework region),替换成人的,FR，,保留与抗原结合的,CDR,(complementary determinant region,互补决定区,),部位(即,CDR,移植),2,鼠单抗可变区的人源化,改型抗体,第二代,64,CDR,移植即把鼠抗体的,CDR,序列移植到人抗体的可变区内，所得到的抗体称,CDR,移植抗体或,改型抗体。,65,改型抗体的发展,早期的改型抗体：,简单的,CDR,移植，通过点突变进行,“,微调,”,即更换某个位点上的氨基酸,第二代改型抗体：,应用了人抗体基因库；,引进计算机技术模拟抗体分子的立体结构；,使用了鼠人嵌合,FR。,其目的是获得具有高亲,和力的治疗性抗体,66,抗体类型,商品名应用,鼠源单克隆抗体,Orthoclone,器官移植排斥,嵌合抗体,Peopro,冠状动脉成形术，心绞痛,嵌合抗体,Rituxan,B,细胞型非霍奇金淋巴瘤,嵌合抗体,Simulect,器官移植排斥,嵌合抗体,Remicade,回肠炎，类风湿性关节炎,人源化抗体,Zenapax,器官移植排斥,人源化抗体,Synagis,婴儿呼吸道合胞病毒,人源化抗体,Herceptin,乳腺癌,人源化抗体,Campath,慢性淋巴细胞白血病,人源化抗体,偶联物,Mylotarg,急性复发骨髓白血病,鼠源抗体放射性偶联物,Zevalin,B,细胞型非霍奇金淋巴瘤,67,Fv,ScFv,单域抗体,最小识别单位,Fab,3,小分子抗体,68,由完整的,轻链和,Fd,组成，大小为完整分子的,1/3,。,把,Fab,与细菌的前导肽相连，在前导肽的作用下,Fab,进入周,质,腔，装配折叠后，它具有结合抗原的活性。,(1)Fab,69,Fv,、,ScFv,的大小约为全分子的,1/6,。,(2)Fv,或,ScFv,Fv,ScFv,连接肽,（,10-15,个氨基酸）,70,单链抗体,的构建在已知亲本,DNA,序列时可用完全,人工合成法,;,在具备亲本单抗可变区的,cDNA,克隆时，可用,定点突变法,在其两端造成适当的内切酶位点，与人工合成的连接肽编码序列连接，组装到表达载体中,;,如果从杂交瘤细胞系构建单链抗体，可用,PCR,方法,扩增可变区基因，再组装到适当的表达载体上。,71,单链抗体最常用的表达体系是,大肠杆菌，,有,2,种方式,:,一是表达为,包涵或非包涵体的不溶蛋白,。产量高，可达细菌蛋白总量的,5%-20%,，但需进行变性复性，使其形成正确的立体结构，恢复抗体活性,;,二是,分泌型表达,，将细菌的信号肽序列与单链抗体的氨基端相连，单链抗体分子就可分泌到质周腔和细菌体外，进行折叠后成为有活性的分子。但产量不及前者，一般实验室培养条件下每升细菌的产量仅在数毫克左右,。,72,即为,VH,，约为完整分子的,1/12,。它只由一个结构域构成，故称,单域抗体。,单域抗体尽管亲和力有所降低，但仍保持着原单抗的特异性。,(3),单域抗体,VH,73,约为完整分子的,1/80-1/70,大小，一般由一个,CDR,构成，它也保持着抗体的特异性。,(4),最小识别单位,CDR,74,4,双特异抗体和多价抗体,双链抗体（,Diabody,）一词最早由,Hollinger,等于,1993,年提出。乃是一种小分子的双价双特异性抗体片段。,75,双特异性抗体,(bispecific antibody,BSAb),是指能同时识别,2,种抗原的抗体。,1,种为对应肿瘤相关抗原。另,1,种为对应效应成分。,即能,结合靶肿瘤细胞,又能,结合高细胞毒性的效应细胞,将效应细胞富集在肿瘤周围,而且可以模拟天然配体的作用与细胞表面引发分子结合,激活效应细胞,实现对肿瘤细胞的杀伤和裂解。,76,抗体的一部分被非抗体序列替代，所形成的融合蛋白具有新的特性,称之为抗体融合蛋白。,根据构建方式，抗体融合蛋白主要分两种形式：,Fc,融合蛋白,（,Fc fusion protein,FcFP）,抗原结合融合蛋白,（,antigen-Binding,fusion protein,ABFP）,抗体融合蛋白,77,Fc,融合蛋白,由抗体的,Fc,段与某些具有特定功能的蛋白结构域融合而成。如,CD4,免疫粘附素（,immunoadhesin）,就是由抗体的,Fc,段与2个,CD4,分子的,Ig,同源区重组而成。,抗原结合融合蛋白,由具有抗原结合功能的抗体结构与其他功能性蛋白融合构成。如免疫毒素，抗体部分主要包括嵌合抗体、单链抗体形式。,抗体融合蛋白,78,一、免疫粘附素,定义,将人抗体恒定区(主要是,Fc,段),N-,端连接于人细胞表面的受体分子或细胞粘附分子上，在真核细胞中表达出正确折叠的融合抗体蛋白分子，这种分子可同时发挥抗体的效应功能及其它相应的效应功能，这种分子被称为,免疫粘附素,(,immunoadhension),或,新效能抗体,。,79,二、免疫毒素,免疫毒素又称生物导弹，是由导向性的载体分子与具有毒性的弹头蛋白交联而制成，属于导向药物的一种。,80,81,82,三、催化抗体,天然抗体体现的是结合活性而酶发挥的是催化活性。如何把这两者的特点集为一体，从而使抗体也能成为具有催化活性的物质，同时也能使酶与有关的抗原结合。即,催化抗体,(,catalytic antibody),催化抗体的构建主要是把具有,催化作用的基团与抗体分子进行重组,。,83,噬菌体抗体,噬菌体抗体库(,phage antibody library),技术,定义：,通过,PCR,将全套人抗体重链和轻链,V,区基因克隆出来，并在噬菌体表面表达、分泌，经筛选后获得特异性抗体。,84,85,噬菌体表面展示文库技术的要点,:,外源基因表达多肽以融合蛋白形式展示在外壳蛋白,N,端,将基因组合文库插入噬菌体编码膜蛋白的基因,g3,或g8,的先导系列的紧靠下游,随机克隆入相应载体形成组合文库,从免疫或未被免疫的,B,细胞中,PCR,扩增抗体全套基因片段,86,用固相化抗原经,“,亲和结合一洗脱一扩增,”,数个循环直接、方便、简捷、高效地筛选出表达特异性好、亲和力强的抗体噬菌体库。,使翻译出的抗体分泌到细菌的周,质,腔内，形成游离的抗体片段，经过纯化即可获得目的抗体。,筛选到的噬菌体再将基因,g3,或,g8,切除后，转入大肠杆菌，,87,该项技术的优点,:,将,抗体的基因型和表型紧密联系,起来,;,可绕过杂交瘤技术，不需要复杂的基因工程技术,;,抗体基因筛选的范围广,;,技术稳定、可靠、生产周期短,;,可规模化生产,;,适用范围广，既可用于抗体制备，也适用于其它蛋白如激素、酶、药物、随机多肽等的生产。,不经过细胞融合及动物免疫等步骤,88,89,噬菌体抗体库的分类,（一）按抗体基因的性质分,1.,DNA,文库,2.,cDNA,文库,（二）按抗体基因的来源分,1天然抗体库(,native antibody library),2,免疫抗体库,3半合成抗体库,4全合成抗体库,90,用,SCID,小鼠制备人单抗,SCID,小鼠,移植入人淋巴细胞（人鼠嵌合模型）,抗原免疫,杂交瘤技术,基因工程,人单抗,91,人抗体鼠,将小鼠,Ig,基因灭活，然后转入人,Ig,基因，生产出人单抗,遗传工程鼠,92,基因工程抗体真核细胞高效表达流程图,93,单抗研发的演变历程,鼠单抗,100%鼠源,OKT-3,Panorex,Zevalin,鼠/人崁合单抗,(66-75%人源),ReoPro,Rituxan,Remicade,Simulect,人源化单抗,(90-95%人源),Zenapax,Mylotarg,Herceptin,Campath,Synagis,100%人源,94,抗体在体外人源化存在的问题,操作过程复杂,需付出昂贵的代价,抗体的亲和力降低,抗体不是人体免疫系统天然产生,异源抗体与免疫系统的配合,95,最理想的单克隆抗体,100%人源,人类免疫系统自然产生,96,全人抗体的理论基础,癌症细胞、病毒、细菌对人机体而言均为异己物,人体不断受异己物攻击，但免疫系统通常有清除能力,免疫系统通过体液免疫和细胞免疫对异己物做出反应,体液免疫就是针对异己物天然地产生抗体,97,全人抗体面临的关键问题,持续分泌抗体的人,B,细胞,抗体分泌细胞的保持,98,30,年来的全人抗体的尝试,鼠骨髓瘤不适合与人,B,细胞融合,-,稳定性差,-,抗体产量低,非洲淋巴细胞瘤病毒(,EBV),保存抗体分泌细胞,-,细胞株不稳定,-,抗体的产量低,-,不能特异性地保存抗体分泌细胞,很难获得人类骨髓瘤细胞株,99,全人抗体技术的最新突破,成功建立人骨髓瘤细胞系，人源抗体的研究进入新的里程,用途：能稳定的保持人,B,细胞分泌抗体的能力,发明人：英国剑桥大学的,Dr.Karpas,教授,意义：1 在整体水平上研究人类产生的抗体,2 开创人类抗体基因组学的研究,评价：诺贝尔奖得主,Dr.Milstein,推荐发表,在,PNAS,，世界权威杂志,“,科学,”,发表了,新闻评述，剑桥大学开了新闻发布会,100,人人杂交瘤技术,开发针对未知抗原的全人治疗用抗体的唯一技术,分离、保存稳定分泌天然抗体的,B,细胞先进方法。,寻找新型肿瘤相关抗原的捷径,101,人人杂交瘤技术的优势,（1）迅速高效的生产天然人类单克隆抗体,抗原选定和抗体产生都由人类免疫系统完成，,不会引起自身免疫反应，与人体免疫系统配合良好,能获得最佳亲和力和中和活性的抗体,更合理的自然选择药物设计方式,加速抗原的发现和抗体的开发过程,102,人人杂交瘤技术的优势,（2）简便、低费用的抗原抗体研究生产方式,与其他抗体改良技术相比操作更简便,起始抗体分泌水平较高，可直接用于工业规模生产,避免了改良技术引起的抗体失活,无需发现抗原和对抗原进行功能确定,103,人人杂交瘤技术的优势,（3）唯一研究全人抗体图谱的技术。,确定人类免疫识别系统，确定人类免疫系统在不同的生理、病理以及发育条件下得到的抗体图谱。,（4）研究癌症免疫学和抗原基因组的最新技术。,寻找人类癌症抗原，将找到的抗原作为癌症疫苗和抗体药物开发的靶标。,104,人人杂交瘤技术的优势,（5）开发针对已知抗原的第二代全人抗体产品，如,HERE-2/neu,TNF,以及感染性疾病如乙型肝炎病毒,HCV,和,HIV,（6）,与其他细胞融合，产生杂交瘤，制造其他有用的人类蛋白质。,105,未来单抗开发的完美方案,从已知治疗靶子生产高亲和力全人抗体,全人抗体挑战靶分子的筛选,开发未知抗原的治疗用抗体,106,人-人杂交瘤技术的应用,1.癌症：,抗肝癌单克隆抗体,抗乳腺癌单克隆抗体,抗肺癌单克隆抗体,抗结肠癌单克隆抗体,2.病毒性疾病：,乙型肝炎病毒单克隆抗体,丙型肝炎病毒单克隆抗体,艾滋病病毒单克隆抗体,107,治疗乳腺癌曲妥珠单抗药物,108,我国第一个基因重组人源化单克隆抗体药物泰欣生（尼妥珠单抗）,109,治疗直肠、结肠癌的贝伐单抗,瑞士罗氏生产的安维汀,110,111,112,需要整合的技术平台,蛋白组学,蛋白芯片、2维,-,电泳技术,免疫组学,组织信息学,细胞阵列技术,组织微阵列技术,人人杂交瘤,113,人-人杂交瘤与肿瘤相关抗原,癌症免疫组学,癌症患者免疫反应的全过程,癌症抗原和抗体库,SEREX,重组,cDNA,表达文库血清分析,确定可能作为癌症疫苗的靶抗原,确定能够作为抗体靶向的抗原,经典方法认识的肿瘤相关抗原再认证,HERE-2/neu,CEA,AFP(,甲胎球蛋白),MAGE,P53,，,CA125,114,肿瘤相关抗原制备的单克隆抗体的应用,115,基因组、蛋白质组和抗体组,基因组,蛋白质组,抗体组,50,000,10 to 20 million100 millions,genes,distinct proteinsantibodies,Antibodomics,Proteomics,Genomics,116,思考题,:,单克隆抗体的定义和它的不足,基因工程抗体有那些类型,如何制备杂交瘤细胞,117,