目的基因的功能验证.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,目的基因的功能验证,减弱该基因在细胞内的作用,基因敲除,RNAi,增强该基因在细胞中的作用,基因的过量表达,1,基于同源重组的方法,2,针对单细胞,微生物,小鼠,3,正负双向筛选法,正选择标记,抗生素抗性基因,负选择标记,致死基因,tk,将无毒的核酸类似物（,GANC,）转变为毒性物质,4,完全基因敲除的弊端,基因完全失活，对于看家基因来说，该基因缺失的突变往往具有致死效应，突变体不易存活,改进：条件基因敲除，实现基因敲除在空间和时间上的可控性,5,空间上的可控（组织特异性敲除）,loxP,位点：一段,34,碱基的特定,DNA,序列，具有方向性,Cre,重组酶：介导,loxP,位点发生重组的酶,6,Cre-LoxP,系统的基因敲除,7,构建条件基因打靶小鼠：将靶基因两端锚定上同向的,LoxP,位点,构建组织特异性,Cre,转基因鼠,将上述两小鼠杂交，得到组织特异性基因敲除小鼠,8,时间上的可控性,用可诱导的启动子调控,Cre,重组酶的表达,加入诱导物之后，启动子才具有活性,9,针对,DNA,上的靶位点，根据其两侧序列设计两个锌指蛋白分子,10,CRISPR-Cas9,在,CRISPR/Cas,系统里，短片段的外源,DNA,分子转录为,crRNA,与,tracrRNA,结合，介导了序列特异性的切割作用，最后在,Cas,蛋白的作用下使靶标基因发生突变,11,反义,RNA,是指与,mRNA,互补的,RNA,分子，可直接与,mRNA,形成双链,RNA,。由于核糖体不能翻译双链,RNA,，所以反义,RNA,可抑制该,mRNA,的翻译。,12,如何操作？,1.,向细胞内转化双链,RNA,分子（转化上的难度，不能稳定遗传）,2.,向细胞内转化,DNA,分子，转录后成为双链,RNA,3.,将,2,个,DNA,分子（分别编码靶基因的正义链和反义链），分别转入细胞,4.,较繁琐，如何只通过转化,1,个,DNA,分子，就能实现,RNAi,？,13,基因的过量表达（,overexpression,）,通过强启动子的驱动，使某一功能基因高于正常生理水平表达，通过检测基因过表达后对某一性状和表型造成的影响，来推测基因的功能。,单细胞,多细胞,在特定组织中的,定时表达,14,头部,驱动目的基因在特定组织和细胞内的高效表达,15,16,