有机酸—苹果酸的发酵生产工艺设计.docx

有机酸—苹果酸的发酵生产工艺设计》报告
精细0520 陈思 陈姣丽 孙鑫 冯琪
（有机酸的分类：
1、柠檬酸
柠檬酸是生物体主要代谢产物之一，在自然界中分布很广，主要存在于柠檬、柑橘、菠萝、梅、李、梨、桃、无花果等果实中，尤其以未成熟者含酸量较多。植物叶子中（如烟叶、棉叶、菜豆叶等）也含有柠檬酸。柠檬酸在植物体内常与苹果酸、草酸及酒石酸等共同存在。在动物中，柠檬酸存在于骨骼、肌肉、血液、乳汁、唾液、汗和尿中，或者以游离状态或金属盐类的形式存在。
2、乳酸
早在1841年，Boutron和Fremy的记载中就有关于乳酸的生产方法，即是将麦芽或酸乳放入淀粉浆和牛乳中，任其自然发酵，然后逐渐中和而的记载中就有关于乳酸的生产方法，即是将麦芽或酸乳放入淀粉浆和牛乳中，任其自然发酵，然后逐渐中和而产出乳酸。但是，实际上用工业方法生产乳酸是在1881年开始于美国。约在1894年，乳酸开始成功地用于皮革和纺织工业，当时美国的生产量折合纯品约为每年5吨。
我国也早就有乳酸盐额度研究和生产。1944年，重庆振元化学药品厂首先生产乳酸钙，在1955年发表了“乳酸发酵和乳酸钙制造”一文。该厂以后迁到无锡，改名为无锡第二制药厂，生产乳酸钙。现在已采用真菌制剂代替砻糠曲的生产工艺，采用大米等为原料，并发行发酵法生产乳酸钙。
3、醋酸
醋酸发酵可以说是起源于食醋发酵，而食醋发酵在古代最早只是酿酒受细菌污染的结果，即所谓“酒酸变醋”。因此醋酸发酵的历史几乎与酿酒一样悠久，可以追溯到一万年以前。中国的“醋”一词有陈酒之意。
能生产食醋的原料很多，如葡萄、苹果、麦芽、谷物原料、乳清等天然含糖原料皆可。我国食醋生产的历史非常悠久，现已有多种风味和特色的食醋生产方法。
早先获得醋酸的方法有天然发酵醋的蒸馏和木材的分解蒸馏(所谓“木醋”)。真正的醋酸发酵应该说是从快速制醋法开始发展起来的，它是现代淋醋工艺的前身。快速制醋工艺由德国学者舒莱巴赫在1823年首先提出，因此在国外称为“德国工艺”。
4、葡糖酸
1880年，Boutroux首先发现利用微生物的氧化作用，能将葡萄糖氧化成葡糖酸。他发现用醋化醋杆菌能发酵葡萄糖产生一种不挥发酸，后来确定为葡糖酸。以后许多研究者也相继报道，其他数种细菌也能产生葡糖酸或酮基葡糖酸。本世纪30年代以前，细菌发酵是生产葡糖酸的主要方法。1922年，Molliard发现，利用霉菌的氧化作用也能产生葡糖酸。后来人们知道，黑曲霉、米曲霉、文民曲霉和青霉都有上述氧化作用。Bernhager1942年发现，采取中和生成酸的方法，黑曲霉能高效地将葡萄糖转化成葡糖酸，而添加碳酸钙最好。在较低温度、限制氮源的条件下，生成的葡糖酸几乎可达理论产率。
我国在1955年由轻工业部上海工业试验所试制葡糖酸成功，选出了黑曲霉87号菌种，不久即在山东投入生产。目前，我国已经有数家葡糖酸发酵工厂。
5、衣康酸
衣康酸（又称为甲叉琥珀酸、分解乌头酸）最早是由Baup1836年蒸馏分解柠檬酸时发现的。而微生物产生衣康酸的能力是日本人木下广野1929年在一种嗜高参压的霉菌培养物中首先发现的，他称之为衣康酸曲霉。原来Raistrick通过对霉菌代谢物的长期研究发现，土曲霉表面培养时也能产生衣康酸。
我国的衣康酸生产尚属空缺。金其荣等人于1984年开始着手对衣康酸产生菌进行选育和工艺条件的研究。
6、苹果酸
苹果酸广泛存在于生物体中，它在很多水果中是占优势的酸。微生物产生苹果酸的能力也早已被人们所认识，早在1928年，Yuill就报道过，在培养黄曲霉时，有少量苹果酸伴随琥珀酸和富马酸产生。Schreyer1931年报道，在丛花青霉的表面培养液中，生成的有机酸钙相当于耗糖的1/4，其中大部分是苹果酸钙。Bernhauer等报道，在蔗糖为碳源的黑曲霉发酵液中，除生成大量的柠檬酸之外，也有少量苹果酸生成。
我国在发酵法生产苹果酸方面也有很大进展。北京微生物研究所研究了固定化皱褶假丝酵母的苹果酸生产技术。福建三明真菌研究所试验过L-苹果酸的霉菌固体发酵。
6/1苹果酸的性质
苹果酸是一种较强的有机酸，又名羟基丁二酸，是一种白色或荧白色粉状、粒状或结晶状固体。晶体中不含结晶水，DL型熔点129℃，L-型熔点100℃，加热到180℃可以失水分解成富马酸或马来酸。在通常条件下，苹果酸是稳定的，但其纯晶体稍有吸湿性，在高湿度条件下可能液化。在相对湿度98％，25℃下放置6天，约增重50.4％.
苹果酸在催化剂存在下与醇可发生酯化反应。以三氟化硼为催化剂与醇回流可形成单酯。与多元醇、芳香多元羧酸作用，可形成树脂类产品，如醇酸聚酯树脂。
在氧化银存在下，苹果酸酯与卤代烷反应可以产生醚类，如乙氧基琥珀酸。
在醇溶液中，苹果酸酯与氨作用，可以生成苹果酸酰胺。
6/2苹果酸的发酵机理
L-苹果酸在生物体中普遍存在，它作为三羧酸循环的一员而参与细胞代谢。在一般生物中它只参与循环而不会大量积累，否则会造成代谢流的阻塞。要想积累苹果酸，必须要有补充4碳酸的途径。理论上讲，补充4碳酸的途径有两种：乙醛酸循环和丙酮酸羧化支路。
实际上，苹果酸的生物合成机理虽然早就研究得很清楚，但它只是从生物生理学的角度去研究的。对于微生物发酵中苹果酸合成机理尚没有进行过细致研究。一般认为，苹果酸发酵牵涉到CO2的固定（即丙酮酸羧化），其证据有：发酵依赖于CaCO3或其他碳酸盐，添加生物素可以促进苹果酸积累等。但是，CO2固定反应在各种菌的发酵中究竟占多大比例还未见有报道。毫无疑问，无论有无乙醛酸循环存在，提高丙酮酸羧化的比例则能提高碳源的利用率，也即能提高苹果酸产率。因此，这是苹果酸发酵值得研究的课题。
6/3苹果酸发酵微生物的分类
一、 黄曲霉
二、 米曲霉
三、 寄生曲霉
四、 华根霉
五、 无根根霉
六、 膜瞨毕赤酵母
七、 短乳杆菌
八、 产氨短杆菌
6/4苹果酸的发酵工艺
L-苹果酸的发酵工艺大体可以分为三类：一步发酵法、两步发酵法和酶法转化。一步发酵又称为直接发酵，它用糖类为原料，用霉菌直接发酵产生苹果酸。两步发酵法也是用糖类为原料，先由根霉发酵成富马酸（或富马酸-苹果酸混合物），再由酵母或细菌转化成苹果酸。酶法转化是用富马酸（盐）或马来酸为原料，用微生物酶（包括全细胞）转化成苹果酸。与化学合成法不同的是，发酵方法利用了微生物酶的立体异构专一性，生产的都是L-苹果酸，是生物体内所存在和可以利用的构型，而化学合成法只能生产DL-苹果酸，如作为食品和药物，则有一半不能得到利用。
6/4.1直接发酵工艺
(一) 菌种扩大培养
用于苹果酸直接发酵的黄曲霉和米曲霉都易于产生孢子。将保存在麦芽汁琼脂斜面上的黄曲霉孢子用无菌水洗下，接到三角瓶中。瓶中装有种子培养基。在33℃静置培养2~~4天，待长出大量孢子，接到种子罐中。
种子罐装有下述种子培养基（g/L）
葡萄糖（水解糖中）30
豆饼粉 10 FeSO4 0.5
K2HPO4 0.2 NaCL 0.01
MgSO4 0.1 CaCO3 60(单独灭菌)
种子罐培养的目的是使孢子发芽，以缩短生产罐的发酵迟滞期。种子罐的体积是生产罐的10％，装液70％，例如50L罐装液35L。在100℃灭菌20~30min后，冷至40℃以下，加入单独灭菌的CaCO3，接种黄曲霉孢子后在33~34℃通气搅拌培养。通气量0.15~0.3vvm，罐压维持100KPa，加入泡敌（50l罐加20ml）抑制泡沫生成。培养18~20h后接入生产罐。
（二）发酵规程
发酵培养基采用葡萄糖70~80g/l,其余成分与种子培养基相同。
生产培养基除CaCO3以外直接在生产罐内配制，在缓慢搅拌下直接通蒸汽升温至100℃，维持20min灭菌。冷至40℃时，加入单独灭菌（干热160℃，2h）的CaCO3。当品温降到34℃时，接种10％种子培养液，通气搅拌进行发酵。发酵时控制温度33~34℃，通气量0.7vvm,搅拌转速180r/min,泡沫自由控系统流加泡敌控制。整个发酵过程约需40h。待残糖降到1g/l以下，放罐进入提取工序。
(三)、影响苹果酸发酵的因素
1.氮源
2.碳酸盐种类
3.碳酸钙用量
4.碳源种类
5.金属离子
6.铁盐
7.抑制剂
8.氨基酸和维生素
9.温度
6/4.2两步发酵工艺
两步发酵是先用根酶将糖类发酵成富马酸（或富马酸与苹果酸混合物），再由酵母或细菌发酵成L-苹果酸的工艺。这前一步称为富马酸发酵，后一步称为转换发酵。
（一）富马酸发酵
根霉产生富马酸的能力早就被人们所认识。著名的根霉富马酸发酵菌种有华根霉、无根霉和黑根霉。根霉在葡萄糖马铃薯汁琼脂斜面上，于30℃培养7天后，易于长出大量孢子。
对于华根霉6508的富马酸发酵，可以采用下述培养基（％）
：
葡萄糖 10 （NH4）2SO4 0.5
K2HPO4 0.1 MgSO4·7H2O 0.05
FeCl3·6H2O 0.002 CaCO3 5
在500ml三角瓶中装液50ml，另外还要加入各种表面活性剂，具体添加量见后述。接种华根霉孢子后，先静置培养一段时间，再振荡培养，维持温度30℃。
（二）转换发酵
转换发酵是在根霉发酵一定时间后，再加入第二种微生物使富马酸发酵转换成苹果酸发酵。有这种转换能力的微生物很多。佐佐木等普查了分别属于假丝酵母属、德巴利酵母属、汉逊酵母属、毕赤酵母属、红酵母属、酵母属和球拟酵母属的23株酵母，发现膜璞毕赤酵母的转化率最高。
6/4.3酶法转化工艺
酶法转化工艺相当于两步发酵工艺中的转换发酵。转换发酵是将第一步发酵生成的富马酸转化成苹果酸;而酶法转化是用富马酸盐（一般是化学合成的）为原料，利用微生物的富马酸酶转化成苹果酸(盐)。酶法转化是现在国外生产L-苹果酸的主要方法。如果转化是以钙盐的形式进行的，则称为“转晶”，即富马酸钙晶体转化成苹果酸钙晶体:
Ef
CaFu Ca2+ + Fu2- Ma2+ + Ca2+ CaMa
6/4.4固定化细胞转化工艺
前面已经提到，富马酸向L-苹果酸的转化只牵涉一步酶催化反应，因此只要把富马酸酶提取出来，固定到载体上，就可以利用固相酶反应柱连续生产L-苹果酸。但实际上遇到的问题是，酶的提纯手续复杂，酶的回收率低，成本高。
（一） 产氨短杆菌细胞固定与苹果酸生产
（二） 黄色短杆菌细胞固定与苹果酸生产
1. 氮源
2. 碳源
3. 玉米浆
4. 通气
5. 温度
6. 培养时间
6/4.5其他发酵方法
（一） 担子菌发酵法
（二） 产碱杆菌酶法转化
（三） 解脂假丝酵母转化法
（四） 解烃富马酸假丝酵母发酵法
（五） 假丝酵母酶法转化
（六） 栖热菌酶法转化
（七） 固定化皱褶假丝酵母转化法
6/5苹果酸的提取和精制
一． 苹果酸的提取
发酵液的处理包括前6个步骤，即酸解、过滤、中和、过滤、酸解、过滤。由于苹果酸发酵中需要添加过量的CaCo3，另外形成放的苹果酸钙盐溶解度也极低，所以成熟的发酵酿成浓浆状。
酸解
过滤
中和
过滤
酸解
发酵液—— —— —— —— ——
无砷硫酸—
石膏渣、菌体 CaCo3+Ca(OH)2
干燥
过滤
滤液 无砷硫酸
结晶
真空浓缩
精制
——
石膏渣
结晶成品
50％浓缩液
苹果提取工艺流程
二、苹果酸的精制
三、苹果酸结晶工艺流程
中间浓缩
过滤
第一次富马酸结晶
前浓缩
苹果酸溶液
苹果酸结晶
过滤
第二次富马酸结晶

干燥
富马酸晶体
富马酸晶体
苹果酸结晶工艺流程
6/6苹果酸的检验
6/6.1定性检验
1. 三氯化钛法
2. 美国药典法
3. 纸层析法
6/6.2定量检验
1. 酸碱滴定法
2. 紫外分光光度法
3. 荧光分光光度法
6/7苹果酸的用途
苹果酸广泛存在于各种生物体中，是生物体重要的代谢循环——三羧酸循环的成员之一。在天然水果（苹果、山楂、葡萄、樱桃）中含量较高，它具有明显的呈味作用，其酸味柔和别致，解渴爽口。苹果酸广泛用于食品和医药工业中，它的质地稳定，在水中溶解度大。它在食品等部门中的用途简介如下：
1. 食品酸味剂
2. 食品加工
3. 食品添加剂加工
4. 烟草加工
5. 医药
6. 日用化工
7. 化学工业