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实验三ELISA检测溶血素.pptx

1、Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,试验三,ELISA检测溶血素,实验三ELISA检测溶血素,第1页,【试剂与器材】,绵羊红细胞(SRBC)免疫小鼠血清,抗SRBC阳性和阴性血清,辣根过氧化物酶(HRP)

2、标识抗甲胎蛋白抗体,碳酸盐缓冲液(PH9.6),磷酸盐缓冲液(PBS,PH7.4),邻笨二胺液,硫酸(2M),酶标反应板、微量加样器、温箱、冰箱、酶标仪等。,实验三ELISA检测溶血素,第2页,【试剂与器材】,包被稀释液(0.05mol/L Na2CO3NaHCO3 缓冲液,PH9.6),Na2CO3 1.5g,NaHCO3 2.9g 加双蒸水至1000ml,封闭液(5%小牛血清/PBS 溶液),小牛血清50ml,PBS(PH7.4)950ml,洗涤液(PBST,PH7.4),NaCl 8.0g,KH2PO4 0.2g,Na2HPO4.12H2O 2.9g,KCl 0.2g,Tween 20

3、0.5ml 加双蒸水至1000ml,实验三ELISA检测溶血素,第3页,【试剂与器材】,样本稀释液(PBS,PH7.4),NaCl 8.0g,KH2PO4 0.2g,Na2HPO4.12H2O 2.9g,KCl 0.2g 加双蒸水至1000ml,酶标第二抗体:羊抗人IgG 标识HRP(1:),实验三ELISA检测溶血素,第4页,【试剂与器材】,底物液(OPDH2O2),A 液(0.1mol/L 柠檬酸溶液)柠檬酸19.2g 加双蒸水至1000ml,B 液(0.2mol/L Na2HPO4 溶液)Na2HPO4.12H2O 71.7g 加双蒸水1000ml,临用前取A 液24.3ml,B 液25

4、7ml,终止液(2mol/LH2SO4 溶液),双蒸水600ml,浓硫酸100ml(迟缓滴加并不停搅拌),加双蒸水至900ml,实验三ELISA检测溶血素,第5页,【操作方法】,(1)包被酶标反应板,用pH9.6 碳酸盐缓冲液1:200 稀释抗体,用之包被聚乙烯塑料板,每孔加0.2ml,4C 1224h。,(2)封闭酶标反应板,弃掉包被液,用PBS 洗涤3 次,甩干后用5%小牛血清/PBS 液封闭。放37C40min(或4C 过夜)。封闭结束后用洗涤液洗板,并在滤纸上拍干,每孔洗3遍,每遍3min。,实验三ELISA检测溶血素,第6页,ELISA平板包被,间接法,抗原包被:将包被液稀释抗原(

5、SRBC)BSA(2-10ug/ml)加入96孔酶标版中,每孔100ul,4C过夜。吸出上清液,加入封闭液200ul/孔。37C封闭1-1.5小时或4C过夜。封闭结束后用洗涤液洗板3次,每次3分钟。,实验三ELISA检测溶血素,第7页,【操作方法】,(3)按图1-11 所表示加入待测样品及阳性对照(用PBS 稀释),将稀释好待测血清样品加入酶标反应板中,每孔0.2ml,阳性对照样品亦对应稀释。置于37C 温箱0.51h。弃去孔中液体,用洗涤液洗涤3 遍,每遍3min。,(4)加酶标二抗(用PBS 稀释),加入辣根过氧化物酶标识抗甲胎蛋抗体,每孔0.2ml 置于37C 温箱,3045 min。弃

6、去孔中液体,拍干,每孔洗涤3 遍,每遍3min。,实验三ELISA检测溶血素,第8页,【操作方法】,(5)加入底物液,取底物液:A 液24.3ml,B 液25.7ml,加双蒸水50ml 得pH5.0 磷酸枸缘酸缓冲液100ml。再加入邻苯二胺40mg,充分溶解,最终加入30%H2O2 0.15ml。每孔加入底物液100l。避光室温作用510min。,(6)终止反应,当阳性对照出现显著颜色改变后,每孔加入终止液50l 终止反应。,实验三ELISA检测溶血素,第9页,【结果分析】,目测:依据显色深浅,用(-)为无色,(+)为浅色,(+)为黄色,(+)为棕黄色表示。普通呈+以上者为阳性,酶标仪测定:在492nm 波长下测OD 值(A,492,)。,当待测样品A,492,值与阴性对照A,492值,比值(P/N)大于2.1时,或待测样品A,492,对照A,492,值,+3s,即可判断为阳性。以最大显色至阳性显色孔50%反应孔抗体稀释倍数为抗体效价。,x,实验三ELISA检测溶血素,第10页,【注意事项】,1.封闭时注意将封闭液加满各反应孔,并去除各孔中可能产生贴孔壁气泡。,2.加洗涤液时,每孔加满,但不要溢出。,3.每次洗涤液在孔中停留时间不应少于1 分钟。,4.洗涤后板要甩干,不要残留液体。,实验三ELISA检测溶血素,第11页,

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