实验三ELISA检测溶血素.pptx

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,试验三,ELISA检测溶血素,实验三ELISA检测溶血素,第1页,【试剂与器材】,绵羊红细胞（SRBC）免疫小鼠血清,抗SRBC阳性和阴性血清,辣根过氧化物酶（HRP）标识抗甲胎蛋白抗体,碳酸盐缓冲液（PH9.6）,磷酸盐缓冲液（PBS，PH7.4）,邻笨二胺液,硫酸（2M）,酶标反应板、微量加样器、温箱、冰箱、酶标仪等。,实验三ELISA检测溶血素,第2页,【试剂与器材】,包被稀释液（0.05mol/L Na2CO3NaHCO3 缓冲液，PH9.6）,Na2CO3 1.5g,NaHCO3 2.9g 加双蒸水至1000ml,封闭液（5%小牛血清/PBS 溶液）,小牛血清50ml,PBS（PH7.4）950ml,洗涤液（PBST，PH7.4）,NaCl 8.0g,KH2PO4 0.2g,Na2HPO4.12H2O 2.9g,KCl 0.2g,Tween 20 0.5ml 加双蒸水至1000ml,实验三ELISA检测溶血素,第3页,【试剂与器材】,样本稀释液（PBS，PH7.4）,NaCl 8.0g,KH2PO4 0.2g,Na2HPO4.12H2O 2.9g,KCl 0.2g 加双蒸水至1000ml,酶标第二抗体：羊抗人IgG 标识HRP（1：）,实验三ELISA检测溶血素,第4页,【试剂与器材】,底物液（OPDH2O2）,A 液（0.1mol/L 柠檬酸溶液）柠檬酸19.2g 加双蒸水至1000ml,B 液（0.2mol/L Na2HPO4 溶液）Na2HPO4.12H2O 71.7g 加双蒸水1000ml,临用前取A 液24.3ml，B 液25.7ml,终止液（2mol/LH2SO4 溶液）,双蒸水600ml，浓硫酸100ml（迟缓滴加并不停搅拌），加双蒸水至900ml,实验三ELISA检测溶血素,第5页,【操作方法】,（1）包被酶标反应板,用pH9.6 碳酸盐缓冲液1：200 稀释抗体，用之包被聚乙烯塑料板，每孔加0.2ml，4C 1224h。,（2）封闭酶标反应板,弃掉包被液，用PBS 洗涤3 次，甩干后用5%小牛血清/PBS 液封闭。放37C40min（或4C 过夜）。封闭结束后用洗涤液洗板，并在滤纸上拍干，每孔洗3遍，每遍3min。,实验三ELISA检测溶血素,第6页,ELISA平板包被,间接法,抗原包被:将包被液稀释抗原（SRBC）BSA（2-10ug/ml）加入96孔酶标版中，每孔100ul，4C过夜。吸出上清液，加入封闭液200ul/孔。37C封闭1-1.5小时或4C过夜。封闭结束后用洗涤液洗板3次，每次3分钟。,实验三ELISA检测溶血素,第7页,【操作方法】,（3）按图1-11 所表示加入待测样品及阳性对照（用PBS 稀释）,将稀释好待测血清样品加入酶标反应板中，每孔0.2ml，阳性对照样品亦对应稀释。置于37C 温箱0.51h。弃去孔中液体，用洗涤液洗涤3 遍，每遍3min。,（4）加酶标二抗（用PBS 稀释）,加入辣根过氧化物酶标识抗甲胎蛋抗体，每孔0.2ml 置于37C 温箱，3045 min。弃去孔中液体，拍干，每孔洗涤3 遍，每遍3min。,实验三ELISA检测溶血素,第8页,【操作方法】,（5）加入底物液,取底物液：A 液24.3ml，B 液25.7ml，加双蒸水50ml 得pH5.0 磷酸枸缘酸缓冲液100ml。再加入邻苯二胺40mg，充分溶解，最终加入30%H2O2 0.15ml。每孔加入底物液100l。避光室温作用510min。,（6）终止反应,当阳性对照出现显著颜色改变后，每孔加入终止液50l 终止反应。,实验三ELISA检测溶血素,第9页,【结果分析】,目测：依据显色深浅，用（-）为无色，（+）为浅色，（+）为黄色，（+）为棕黄色表示。普通呈+以上者为阳性,酶标仪测定：在492nm 波长下测OD 值（A,492,）。,当待测样品A,492,值与阴性对照A,492值,比值（P/N）大于2.1时，或待测样品A,492,对照A,492,值,+3s，即可判断为阳性。以最大显色至阳性显色孔50%反应孔抗体稀释倍数为抗体效价。,x,实验三ELISA检测溶血素,第10页,【注意事项】,1.封闭时注意将封闭液加满各反应孔，并去除各孔中可能产生贴孔壁气泡。,2.加洗涤液时，每孔加满，但不要溢出。,3.每次洗涤液在孔中停留时间不应少于1 分钟。,4.洗涤后板要甩干，不要残留液体。,实验三ELISA检测溶血素,第11页,