原位杂交操作流程PPT课件.ppt

原位杂交操作流程1.冰冻切片的（DIG-labeledRNAprobe）原位杂交操作程序一、切片制备用新鲜组织制作6m厚冰冻切片，37干燥14小时，进行下一步操作。二、预杂交前处理预固定：4%PFA（inDEPC-PBSPh7.4）RT3060min4%PFA：多聚甲醛20g1PBS450ml加热（60、20min）溶解冷却后调pH至7.41PBS500mlPBSRT5min210PBS：500mlNaCl40gKCl1gKH2PO41gNa2HPO47.7gDEPC水450ml调Ph至7.5DEPC水加至500mlPBS(含0.3%v/vTritonX-100)RT15min临用前配制10%TritonX-10015ml1PBS500mlPBSRT5min22.消化：2g/mlProteinaseKinTEbuffer3710minTE：pH8.0Tris-HCl1M5mlpH8.0EDTA0.5M1mlDEPC水500ml0.2%GlycininPBSRT5min2(50 xDenharts;Ficoll400聚蔗糖1g后固定：4%PFAinPBSRT15minPVP聚乙烯基吡咯烷酮1gBSA牛血清白蛋白1g DEPC水100ml）PBSRT3min20.1M三乙醇胺（TEA）/0.25%乙酸酐RT5min20.1M三乙醇胺：三乙醇胺2.64mlDEPC水200ml用前加入乙酸酐500lPBSRT5min23.三、预杂交 预杂交502h预杂交液：50%去离子甲酰胺5SSC5Denhardts0.02%SDS0.1mg/mltRNA四、杂交杂交5012h以上4.五、杂交后处理2SSC脱去盖膜（片）502SSC清洗3710min220g/mlRNaseAinRnsaebuffer3730minRnsaebuffer;2MTris5ml0.25MEDTA4ml3MnaCl167mlpH8.0DW1000mlRnasebuffer3730min2SSC5015min21SSC（含0.02%SDS）3715min25%SDS2ml1SSC500ml0.1SSC3715min25.Buffer3710min2Buffer:2MTris-HClPh7.625ml3MNaCl25mlD.W.500ml封闭；0.5%抗体阻断液inBuffer（含0.2%Tween20）3720min抗体阻断液:(1:500抗地高辛抗体in阻断液372h)阻断剂1gTween-200.4mlBuffer3710min2Buffer200mlBuffer3710min26.显色；Buffer:2MTris10ml（1:50NBT/BCIPStockSolutioninBuffer224h）3MNaCl6.67mlMgCl22.033g（湿合、避光）D.W.180ml 浓HCl调pH至9.5DW.200ml终止反应：BufferRT5min2流水冲洗5-10min1%甲基绿复染3-10min，水洗，晾干，封固7.DNA探针检测石蜡切片中DNA8.组织标本肝穿刺组织，常规石蜡包埋，4m连续石蜡切片，贴在涂有切片粘合剂的干净载玻片上，58烤18h。9.试剂1 120SSC20SSC2 2HBV cDNA-DigHBV cDNA-Dig探针 5 5 g g3 34 4多聚甲醛4 40.1mol/L PBS0.1mol/L PBS，pH7.4pH7.45 50.2mmol/L HCl 0.2mmol/L HCl 和0.1mol/L0.1mol/L甘氨酸 PBS pH7.4 PBS pH746 60.4 0.4 Tritor X-100 PBS pH7.4Tritor X-100 PBS pH7.47 7蛋白酶 20 20 g/mlg/ml8 80.250.25乙酸酐，用0.1mol/L0.1mol/L三乙醇胺配制9 9预杂交缓冲液和杂交缓冲液10.AKP10.AKP标记抗Dig FabDig Fab段二抗，可1:5001:500稀释11.TSM11.TSM、TSM2TSM2（配制参阅附录4 4）12.NBT12.NBT和BCIPBCIP显色液或用AKPAKP显色KitKit 10.操作流程杂交前处理预杂交杂交杂交后漂洗杂交后检测结果判断11.杂交前处理1.石蜡切片常规脱蜡至水2.0.02M pH7.4 PBS洗33min3.0.2M HCI 20min 室温（除去蛋白）4.2SSC（内含5M EDTA）50 洗 30min5.蛋白酶 2g/ml 37 20min6.0.1M甘氨酸PBS洗 10min 室温，中止酶反应7.4多聚甲醛，20min 室温8.PBS洗 33min9.75，85，95和无水乙醇各2min12.预杂交和杂交加预杂交液 20l/每片，42 2h。加杂交液1020ul/每片（内含HBV-cDNA Dig标记探针4g/ml），加盖硅化玻片，将切片置于95 10min，使探针和靶病毒DNA双链打开（变性），然后迅速置于冰上5min，再将切片置于盛有2SSC湿合内，42杂交过夜(1216h)。13.杂交后漂洗1.将切片置于2SSC液内振动移去盖片2.2SSC洗 210min，553.0.5SSC 25min，504.PBS洗33min5.10醋酸 20min 室温，阻断内源性碱性磷酸酶6.PBS洗33min14.信号放大和显示1.1:500稀释AKP标记抗Dig二抗，37 4h，或4过夜2.PBS洗 33min3.TSM1洗 25min4.TSM2洗 25min5.显色液 在1mlTSM2中加入4.5lNBT，3.5l，BCIP 混合后，显色30min12h，中间不断观察6.TSM2洗，PBS洗33min，核固红或甲基绿衬染7.蒸镏水洗，系列乙醇脱水，二甲苯透明，树脂封片15.结果判断16.ISHISH流程探针合成组织细胞标本的准备ISHISH试剂的配制操作流程17.探针 1、根据文献报道合成PCR引物一对。2、PCR扩增：用高保真DNA聚合酶 进行PCR扩增。18.3、将PCR扩增产物亚克隆入pGEM2Z质粒（EcoRI和ACC I酶切位点），在大肠杆菌中扩增，纯化。原理：PGEM3质粒购于promega公司，含有位于pUc19 MCS侧面的SP6和T7 RNA聚合酶启动子，在将所需序列插入MCS后，一个简单的基于lac Z-肽灭活的颜色选择方案将促进重组体的筛选。在体外，将SP6或T7 RNA聚合酶加入到含有标记物的三磷酸核苷前体的转录系统中，可允许从任何一方向产生多拷贝DNA插入序列的标记RNA探针。19.4、利用Roche生产的体外转录标记RNA kit（Cat.No 999644）操作流程参阅原位检测技术p132-133。20.组织细胞标本的准备 ISHISH试剂的配制（所有试剂和用具均用DEPCDEPC水处理）21.操作流程11、活细胞经4多聚甲醛固定20min，室温，PBS洗，系列乙醇脱水。2、组织标本：标准取材后，4多聚甲醛固定6h，用25遮糖或液氮速冻，切片贴在涂有APES胶的干净载玻片上。3、PBS洗33min，冰冻切用4%柠檬酸盐90保温20min，石蜡切片98 10min，细胞片不用。4、2g/ml蛋白酶K 37 20min，PBS洗33min。5、0.1mol/L甘氨酸PBS洗10min.6、0.25%乙酸酐的0.1mol/L三乙醇胺(pH8.0)洗10min，PBS洗10min。22.7 7、预杂交 0.2SSC 0.2SSC5050甲酰胺 30min 37 30min 37。8 8、杂交：滴加杂交液（2g/ml2g/ml）加一层复盖膜，4848杂交8-12h8-12h。9 9、杂交后洗：2SSC 2SSC洗 25min 45 25min 45 1SSC 1SSC洗 25min 25min 室温 0.5SSC 0.5SSC洗 25min 25min 室温 0.1SSC 0.1SSC洗 25min 25min 室温 PBS PBS洗 33min 33min23.10、用10正常血清封闭 30min11、抗Dig IgG 1:500 37 1h12、PBS洗 33min13、0.02M TBS pH9.015min14、NBT/BCIP显色 1h-24h15、洗后，核固红衬染，蒸馏水洗，脱 水，透明，封片。16、结果观察：紫蓝色为阳性信号，红 色为背景。24.