体外诊断试剂培训-文档资料.ppt

体外诊断产品的生产监管,北京市医疗器械检验所,1,主要内容,体外诊断产品的种类,体外诊断产品生产的基本原理,生化类产品,免疫类产品,分子类和血液类,溯源性问题,体外诊断作用“医生的眼睛”,预测和诊断功能，如：,血细胞,抗体（肝炎、艾滋、,IGE,）,基因（唐氏、小儿耳聋、遗传缺陷基因,BRCA1,）。,疗效和健康监测，如：,代谢物（血糖）,标志物（,AFP,、,PSA,、,HPV,）,蛋白、微量元素（白蛋白、,Ca);,3,体外诊断产品的类别,体外诊断根据风险分,3,类：,III,类：致病性病原体抗原、,抗体,以及核酸、人类基因检测、肿瘤标志物、血型、组织配型、变态反应（过敏原等；,II,类：除,III,、,I,类，如：蛋白质、糖类、酯类、酶类、维生素、无机离子、激素等；,I,类：微生物培养基（不用于微生物鉴别和药敏试验）、样本处理用产品，如溶血剂、,稀释液,、染色液等。,体外诊断产品的类别,体外诊断专业分类,:,生化、免疫、分子生物学、微生物、体液等,临床使用超过千种。,生化：生物化学反应或免疫反应,(,生化仪的项目），酶类、糖类、脂类、蛋白、无机元素、肝功能、肾功等指标。,免疫：抗原与抗体相结合的特异性反应，传染性疾病、内分泌、肿瘤、药物检测、血型鉴定等。,分子诊断：分子生物学方法检测患者体内遗传物质的结构或表达水平的变化，主要用于肝炎、性病、优生优育、遗传病基因、肿瘤等检测。,体外诊断产品的类别,微生物：通过培养鉴别细菌等微生物的方法。,血液学：通过电阻抗、激光和高能电磁波等技术检测血液中血细胞的数量和分类的方法。,生化类,产品,基本方法,生化分析仪反应的一般称为生化试剂,两点法、终点法、速率法、比浊法,两点法,：,测定酶反应开始后某一时间内,(t1,到,t2),产物或底物浓度的总变化量以求取酶反应初速度的方法。,终点法,：,通过测定酶反应开始到反应达到平衡时产物或底物浓度总变化量，以求出酶活力的方法，亦称平衡法。,速率法,：,是指连续测定,(,每,15,秒,1,分钟监测一次,),酶反应过程中某一反应产物或,底物的浓度随时间的变化来求出酶反应的初速度的方法，即连续监测法。,透射比浊法透射比浊法,可用于测定产生浊度反应的项目。,生化类,产品,基本方法,终点法,常用的有总胆红素（氧化法或重氮法）、结合胆红素（氧化法或重氮法）、血清总蛋白（双缩脲法）、血清白蛋白（溴甲酚氯法）、总胆汁酸（酶法）、葡萄糖（葡萄糖氧化酶法）、尿酸（尿酸酶法）、总胆固醇（胆固醇氧化酶法）、甘油三酯（磷酸甘油氧化酶酶法）、高密度脂蛋白胆固醇（直接测定法）、钙（偶氮砷,法）、磷（紫外法）、镁（二甲苯胺蓝法）。,两点法,：苦味酸法测定肌酐采用此法,速率法,对于酶活性测定，如丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、,谷氨氨酰基转移酶、淀粉酶和肌酸激酶等。一些代谢物酶法测定的项目如己糖激酶法测定葡萄糖、脲酶偶联法测定尿素等，也可用连续监测法。,（,7,个酶加葡萄糖、尿素）,免疫比浊法,载脂蛋白、免疫球蛋白、补体、抗,“O”,、类风湿因子，以及血清中的其他蛋白质如前白蛋白、结合珠蛋白、转铁蛋白等均可用此法。,(,蛋白）,生化类,产品,说明书,生化分析仪说明书除法规相关规定外，还至少包括：,适用机型,反应温度（,37,度）,主波长、次波长,孵育时间,（终点法或两点法）,延迟时间,（连续监测法）、,连续监测时间,在延迟时间之后即开始，一般为,60,120s,不少于,4,个吸光度检测点（,3,个吸光度变化值）；,加样量,校准液个数（非线性必须两个以上）,等。,标准液个数的原因,校准液个数,浓度校准曲线线性好并通过坐标零点的，可采用一个校准液；线性好但不通过坐标零点，应使用两个校准液；对于校准曲线呈非线性者，必须使用两个以上校准液。每一个校准液都要有一个合适的浓度。,吸光度,浓度,10,5,6000,3000,8,生化类,产品,基本原理,氧化反应:,还原反应：,生化类,产品质量风险点分析,原材料,(,辅酶,I),（进货检验记录或生产记录中，应包括辅酶空白吸光度的检验记录，且不同的类别符合下述特点）,还原性辅酶,I,主要用于下降反应，当还原性辅酶,I,质量出现问题时，试剂的空白吸光度降低，导致试剂测量结果的不确定度变大，测量的灵敏度也随之降低，测量线性范围变小。,氧化性辅酶,I,主要用于上升反应，当氧化性辅酶,I,质量出现问题时，试剂的空白吸光度升高，导致试剂测量结果的不确定度变大，测量的灵敏度也随之降低，测量线性范围变小。,生化类,产品质量技术风险点分析,生产记录中应包括试剂用水的电导率、,PH,值及微生物检验记录,生化类,产品质量风险点分析,免疫类,产品,基本原理,Elisa,反应的基本原理（酶标仪、发光仪等）,将含有已知抗体的抗血清吸附在微量滴定板上的小孔里，洗涤一次；加待测抗原，如两者是特异的，则发生结合，然后把多余抗体洗除；加入与待测抗原呈特异反映的酶联抗体（二抗），使形成“夹心”；加入该酶的底物，若看到有色的酶解产物产生，说明在孔壁上存在相应的抗原。,免疫类,产品质量技术风险点分析,辣根过氧化物酶,过氧化物酶（,HRP,）广泛分布于植物中，辣根中含量最高，从辣根中提取的称辣根过氧化物酶（,HRP,），酶蛋白和辅基的最大吸收光谱分别为,275nm,和,403nm,。,酶的纯度以,RZ,表示：,RZ=OD403/OD275,纯酶的,RZ,多在,3.0,以上，最高为,3.4,。,RZ,在,0.6,以下的酶制品为粗酶，非酶蛋白约占,75%,，不能用于标记。,RZ,在,2.5,以上者方可用于标记。（检查进货检验记录或生产过程记录）,免疫,产品质量风险点分析,酶与抗体的活性常用琼脂扩散或,免疫电泳法,，使抗原与抗体形成沉淀线，经,PBS,漂洗,1,天，再以,蒸馏水,浸泡,1,小时，将,琼脂凝胶,片浸于酶底物溶液中着色，如果出现应有的,颜色反应,，再用生理盐水浸泡，颜色仍然不褪，表示结合物既有酶的活性，也有抗体活性。良好的结合物在,显色,后，琼扩滴度应在,1:16,以上。另一个测定方法是用系列稀释的酶标抗体直接以,ELISA,方法进行方阵滴定，此法不仅可以测定标记效果，还可以确定酶标抗体的使用浓度。,免疫类,产品质量风险点分析,在产品进货检验记录或生产记录中检查以下内容：,1,、酶,标记,二抗的活性；,2,、用于,ELISA,的结合物的酶量为,400(g/ml,时效果一般，为,500(g/ml,时效果较好，达,1000(g/ml,时效果最好,；,3,、酶结合率为,7%,时效果一般，为,9%,10%,较好，达,30%,以上最好；,4,、一抗进货检验记录，单抗还是多抗，也可小样测试活性；,5,、一抗包被的工艺记录与质量体系文件中要求是否一致；,5,、储存环境同生化产品；,分子类,产品,基本原理,PCR(,聚合酶链式反应）是利用,DNA,在体外摄氏,95,高温时变性会变成单链，低温（经常是,60,C,左右）时引物与单链按,碱基,互补配对的原则结合，再调,温度,至,DNA,聚合酶最适反应温度（,72,C,左右），,DNA,聚合酶,沿着磷酸到五碳糖,(5-3),的方向合成互补链。基于聚合酶制造的,PCR,仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。,分子类,产品,质量风险点,1,、引物质量，多为购买，可做小样，采购记录中查小样测试记录；,2,、聚合酶质量，多为购买，可测定，可做小样，采购记录中查小样测试记录；,3,、内标：已知带有引物片段样本，与被测样本同时扩增，应显示阳性，检查测试记录；,4,、,PCR,生产企业控温精度（,95,度、,55,度和,75,度）和变化率的记录。,5,、实地检查,PCR,试剂的质控（内标）和生产是否在各自独立的建筑中进行。并且实验室分为试剂配制区、样品处理区、核酸扩增区、产物分析区。并且考虑房间的正负压保护样本不被污染、人员不被感染95度(高温）,55度低温,75度（反应温度）,95度,血液类,产品,基本原理,悬浮在电解液中的颗粒,/,细胞，随电解液通过小孔管时，因取代了相同体积的电解液，在恒电流设计的电路中导致小孔管内外两电极间电阻发生瞬时变化，而产生了电位脉冲。,脉冲,信号的大小和次数与颗粒的大小和数目成正比。,血液类,产品,质量控制点,1,、生产记录中检查溶血剂、稀释液的颗粒物、微生物检验记录；,2,、血细胞分析仪稀释液生产车间需控制洁净度和菌落数；,3,、检验室的血液分析仪是否采用定值血定期校准；,4,、检验室的血液分析仪内部质控结果，红白偏差是否符合要求（特别是血小板）。,体外诊断试剂溯源,校准液个数,浓度校准曲线线性好并通过坐标零点的，可采用一个校准液；线性好但不通过坐标零点，应使用两个校准液；对于校准曲线呈非线性者，必须使用两个以上校准液。每一个校准液都要有一个合适的浓度。,吸光度,浓度,10,5,6000,3000,8,2009,年国家食品药品监督管理局体外诊断试剂监督抽验,61,个国产,TG,试剂,新鲜混合血清,最大正偏倚为,22.1,，最大负偏倚为,-18.9,，,39%bias,5,体外诊断试剂溯源,校准品与质控品区别,校准品目的是为了产品的准确性，溯源性是必须的；,质控品目的是为了产品的精密度，稳定性是必须的，可不具备溯源性。,溯源性有多重要？,临床检验：对收集的患者标本只做一次检验，就发出报告,准确性不足是重要的临床检验质量问题,影响检验结果“临床准确性”的因素是多方面的,样品采集与处理，病人准备，,(,生物变异,),，人为错误,方法：正确度（校准）、精密度、特异性、线性、检测限等,溯源理论上解决的是正确度问题,(,校准问题,),体外诊断试剂溯源,体外诊断试剂溯源,标准物质,制造商选定方法,主校准品,制造商常设方法,产品校准品,常规方法,血样,体外诊断试剂溯源,1,、,有溯源性才能判断准确性；,2,、检验结果才能互认；,目前问题,1,、,CRM,缺乏；,2,、反应原理差异，导致结果有差异，但,Cutoff,值也不同，不影响临床判断，结果无法互认；,3,、各自溯源路径不同，结果存在差异。,体外诊断试剂溯源,目前采用的准确性评价方法,1.,国家标准物质、国际标准物质（有溯源性）（查验标准物质证明材料，一般为证书）,2.,回收实验（有一定溯源性）（添加物质纯度，实验记录）,3.,与大公司比对（无溯源性）（样本数，相关系数，偏差等）,体外诊断试剂溯源性的检查,1,、,检查所用国家标准品或国际标准品的证书文件、值及不确定度（如为定量标准品）；,2,、企业产品校准品的定值记录，产品校准品应标注值，宜带有不确定度（质控品可以无值）,。,体外诊断产品,性能指标,原则参考国家、行业标准,定量试剂：,准确性、重复性、线性范围、空白吸光度（如有）等；,定性试剂：,灵敏度（假阴性率）、特异性（假阳性率）、干扰等；,谢 谢！,34,