R3004 Sulfonamide 09-07-16磺胺.pdf

RIDASCREEN Sulfonamide Enzymimmunoassay zur quantitativen Bestimmung von Sulfonamiden Enzyme immunoassay for the quantitative analysis of sulfonamides Art.No.:R3004 In vitro Test Lagerung bei 2-8 C Storage at 2-8 C R-Biopharm AG,Darmstadt,Germany Tel.:[phone]/Telefax:[phone] RIDASCREEN Sulfonamide 09-07-16 Anschrift:R-Biopharm AG An der neuen Bergstrae 17 D-642973 Darmstadt www.r-biopharm.de Fr weitere Fragen stehen Ihnen gerne zur Verfgung:Telefon:Zentrale/Auftragsannahme (0 61 51)81 02-0 Telefax/E-Mail:Auftragsannahme (0 61 51)81 02-20 ordersr-biopharm.de Marketing 0 61 51)81 02-40 infor-biopharm.de RIDA und RIDASCREEN sind eingetragene Warenzeichen der R-Biopharm AG Hersteller:R-Biopharm AG,Darmstadt,Deutschland R-Biopharm AG ist ISO 9001 zertifiziert.RIDA and RIDASCREEN are registered trademarks of R-Biopharm AG Manufacturer:R-Biopharm AG,Darmstadt,Germany R-Biopharm AG is ISO 9001 certified.RIDASCREEN Sulfonamide 09-07-16 3 Kurzinformation RIDASCREEN Sulfonamide(Art.Nr.:R3004)ist ein kompetitiver Enzym-immunoassay zur quantitativen Bestimmung von Sulfonamiden in Ei,Fleisch(Huhn und Schwein)Fisch,Shrimps,Honig und Milch.Alle Reagenzien fr die Durchfhrung des Enzymimmunoassays-inkl.Stan-dards-sind im Testkit enthalten.Ein Testkit ist ausreichend fr 96 Bestimmungen(einschl.Standardbestim-mungen).Zur Auswertung bentigt man ein Mikrotiterplatten-Photometer.Probenvorbereitung:Milch:nach 1:5 Verdnnung direkt im Test einsetzen Fleisch(Schwein und Huhn)Ei,Fisch,Shrimps:homogenisieren,extrahieren,zentrifugieren,evaporieren und entfetten Honig:extrahieren,Sulenreinigung mit RIDA C18 column und verdnnen Zeitbedarf:Probenvorbereitung(fr 10 Proben)Milch.ca.10 min Fleisch(Schwein),Ei,Fisch,Shrimps.ca.1,5 h Fleisch(Huhn).ca.2,5 h Honig.ca.2 h Testdurchfhrung(Inkubationszeit).1,15 h Nachweisgrenze:Fleisch(Huhn),Ei.1,5 ppb Fleisch(Schwein),Fisch,Shrimps,Honig.2 ppb Milch.3,5 ppb Wiederfindungsrate:Ei.ca.88%Fleisch(Huhn).ca.70%Fleisch(Schwein).ca.115%Fisch.ca.120%Shrimps.ca.88%Honig.ca.89%Milch.ca.101%Spezifitt:Die Spezifitt des RIDASCREEN Sulfonamide-Tests wurde durch die Bestimmung der Kreuzreaktivitt zu den entsprechenden Substanzen ermittelt.4 RIDASCREEN Sulfonamide 09-07-16 Sulfamethoxypyridazin.100%Sulfapyridin.100%Sulfamethoxydiazin.ca.75%Sulfamethoxazol.ca.58%Sulfadimethoxin.ca.41%Sulfaquinoxalin.ca.34%Sulfathiazol.ca.32%Sulfachloropyridazin.ca.19%Sulfamerazin.ca.18%Sulfadiazin.ca.15%Sulfamethizol.ca.14%Sulfadoxin.ca.10%Sulfachloropyrazin.ca.9%Sulfaguanidin.ca.5%Sulfaphenazol,Sulfamethazin,Sulfisoxazol,Sulfanilamid.ca.2%Sulfacetamid.ca.1%1.Verwendungszweck RIDASCREEN Sulfonamide ist ein kompetitiver Enzymimmunoassay zur quantitativen Bestimmung von Sulfonamiden in Ei,Fleisch(Huhn und Schwein),Fisch,Shrimps,Honig und Milch.2.Allgemeines Sulfonamide werden in der Klber-und Schweinemast hufig als Futtermittelzu-satzstoffe eingesetzt.Zusammen mit Antifolaten(Dihydrofolat-Reduktase-Hemmer)wie z.B.Trimethoprim und Pyrimethamin werden sie in der Veterinr-medizin auch hufig zur Behandlung von Darminfektionen,Mastiden,Lungen-entzndungen und anderen systemischen Infektionen verwendet.Die Kontamination von Lebensmitteln tierischen Ursprungs,wie Milch und Fleisch,mit Sulfonamiden ist deshalb mglich und wurde auch hufig(vor allem im Ausland)nachgewiesen.Laut EU-Recht gilt die Hchstmenge fr alle Stoffe der Sulfonamidgruppe von 100 ppb in Muskel,Fett,Leber und Niere sowie von 100 ppb in Milch.RIDASCREEN Sulfonamide 09-07-16 5 3.Testprinzip Grundlage ist die Antigen-Antikrper-Reaktion.Die Vertiefungen der Mikrotiter-streifen sind mit Fnger-Antikrpern gegen anti-Sulfonamid-Antikrper be-schichtet.Zugegeben werden Standards bzw.Probelsung,enzymmarkiertes Sulfonamid(Enzymkonjugat)und anti-Sulfonamid-Antikrper.Freie Sulfonamide und enzymmarkiertes Sulfonamid konkurrieren um die Sulfonamid-Antikrper-bindungsstellen(kompetitiver Enzymimmunoassay).Gleichzeitig werden auch die anti-Sulfonamid-Antikrper von den immobilisierten Fnger-Antikrpern gebun-den.Nicht gebundenes,enzymmarkiertes Sulfonamid wird anschlieend in einem Waschschritt wieder entfernt.Der Nachweis erfolgt durch die Zugabe der Substrat-/Chromogenlsung.Gebundenes Enzymkonjugat wandelt das Chromo-gen in ein blaues Endprodukt um.Die Zugabe des Stopp-Reagenzes fhrt zu einem Farbumschlag von blau nach gelb.Die Messung erfolgt photometrisch bei 450 nm;die Extinktion der Lsung ist umgekehrt proportional zur Sulfonamid-Konzentration in der Probe.4.Packungsinhalt Mit den Reagenzien einer Packung knnen 96 Bestimmungen durchgefhrt werden(einschlielich Standardbestimmungen).Jeder Testkit enthlt:1 x Mikrotiterplatte mit 96 Kavitten(12 Streifen 8 Einzelkavitten)beschichtet mit Fnger-Antikrpern gegen anti-Sulfonamid-Antikrper 6 x Standardlsungen(je 1,3 ml)0 ppb(Nullstandard),1 ppb,3 ppb,10 ppb,30 ppb,100 ppb Sulfamethoxypyridazin in wssriger Lsung gebrauchsfertig 1 x Konjugat(6 ml).roter Verschluss Peroxidase-konjugiertes Sulfonamid gebrauchsfertig 1 x Anti-Sulfonamid-Antikrper(6 ml).schwarzer Verschluss gebrauchsfertig 1 x Red Chromogen Pro(10 ml).brauner Verschluss (Substrat-/Chromogenlsung),rtlich gefrbt enthlt Tetramethylbenzidin 1 x Stopp-Reagenz(14 ml).gelber Verschluss enthlt 1 N Schwefelsure 6 RIDASCREEN Sulfonamide 09-07-16 1 x Puffer(110 ml).weier Verschluss Probenverdnnungspuffer 1 x Waschpuffer(Salz)zur Herstellung eines 10 mM PhoshatpufferspH 7,4 enthlt 0,05%Tween 20 5.Zustzlich bentigte Reagenzien erforderliches Zubehr 5.1.Gerte:Mikrotiterplatten-Photometer(450 nm)Zentrifuge Schttler(Vortex)Mixer(Stomacher,Ultraturrax)Rotationsverdampfer oder anderes Gert zur Evaporation Pasteurpipetten Messpipetten variable 20 l-200 l und 200-1000 l Mikropipetten 5.2.Reagenzien:Methanol p.a.Ethylacetat Acetonitril n-Hexan(oder n-Heptan)NaCl 50 mM Natriumazetatpuffer:4,1 g Natriumazetat(CH3COONa)in 900 ml dest.Wasser lsen,mit HCl auf pH 5 einstellen und mit dest.Wasser auf 1000 ml auffllen 6.Vorsichtsmanahmen Die Standards enthalten Sulfamethoxypyridazin.Vorsicht ist geboten.Das Stopp-Reagenz enthlt 1 N Schwefelsure(R36/38,S2-26).7.Reagenzien und ihre Lagerung Die Reagenzien bei 2-8 C lagern.Komponenten des Testkits auf keinen Fall einfrieren.RIDASCREEN Sulfonamide 09-07-16 7 Nicht bentigte Kavitten zusammen mit dem Trockenmittel im Folienbeutel gut verschlossen aufbewahren und weiterhin bei 2-8 C lagern.Die rtlich gefrbte Substrat-/Chromogenlsung ist lichtempfindlich,deshalb direkte Lichteinwirkung vermeiden.Nach Ablauf des Verfallsdatums(siehe Testkit-Auenetikett unter Expiration)kann keine Qualittsgarantie mehr bernommen werden.Ein Austausch von Einzelreagenzien zwischen Kits verschiedener Chargennum-mern ist nicht zulssig.8.Anzeichen fr Reagenzienverfall bluliche Frbung der rtlichen Substrat-/Chromogenlsung vor Zugabe in die Kavitten Extinktion kleiner 0,6(E450 nm 100%Sulfamethoxydiazine.approx.75%Sulfamethoxazole.approx.58%Sulfadimethoxine.approx.41%Sulfaquinoxaline.approx.34%Sulfathiazole.approx.32%Sulfachloropyridazine.approx.19%Sulfamerazine.approx.18%Sulfadiazine.approx.15%Sulfamethizole.approx.14%Sulfadoxine.approx.10%Sulfachloropyrazine.approx.9%Sulfaguanidine.5%Sulfaphenazole,Sulfamethazine,Sulfisoxazole,Sulfanilamide.2%Sulfacetamide.1%1.Intended use RIDASCREEN Sulfonamide is a competitive enzyme immunoassay for the quantitative analysis of sulfonamides in egg,meat(chicken and pork),fish,shrimps,honey and milk.2.General Sulfonamides are widely used as feed additives,mainly for fattening of calves and pigs.Combined with inhibitors of dihydrofolate reductase such as trimethoprim,tetroxoprim,or pyrimethamine sulfonamides are also used in veterinary medicine for the treatment of intestinal infections,mastitis,pulmonitis and other(systemic)diseases.Therefore sulfonamide residues may occur in food of animal origin such as meat and milk and were found frequently abroad.According to the EU-Law a maximum residue limit for all substances of the sulfonamide-group of 100 ppb in muscle,fat,liver and kidney and of 100 ppb in milk is valid.RIDASCREEN Sulfonamide 09-07-16 13 3.Test principle The basis of the test is the antigen-antibody reaction.The microtiter wells are coated with capture antibodies directed against anti-sulfonamide antibodies.Standards or sample solution,sulfonamide enzyme conjugate and anti-sulfonamide antibodies are added.Free sulfonamides and sulfonamide enzyme conjugate compete for the sulfonamide antibody binding sites(competitive enzyme immunoassay).At the same time,the anti-sulfonamide antibodies are also bound by the immobilised capture antibodies.Any unbound enzyme conjugate is then removed in a washing step.Substrate/chromogen solution is added to the wells and incubated.Bound enzyme conjugate converts the chromogen into a blue product.The addition of the stop solution leads to a color change from blue to yellow.The measurement is made photometrically at 450 nm.The absorption is inversely proportional to the sulfonamide concentration in the sample.4.Reagents provided Each kit contains sufficient materials for 96 measurements(including standard analyses).Each test kit contains:1 x Microtiter plate with 96 wells(12 strips with 8 removable wells each)coated with capture antibodies against anti-sulfonamide antibodies 6 x Standard solutions(1.3 ml each)0 ppb(zero standard),1 ppb,3 ppb,10 ppb,30 ppb,100 ppb sulfamethoxypyridazine aqueous solution ready to use 1 x Conjugate(6 ml).red cap peroxidase conjugated sulfonamide ready to use 1 x Anti-sulfonamide antibody(6 ml).black cap ready to use 1 x Red Chromogen Pro(10 ml).brown cap(Substrate/chromogen solution),stained red contains tetramethylbenzidine 1 x Stop solution(14 ml).yellow cap contains 1 N sulfuric acid 1 x Buffer(110 ml).white cap sample dilution buffer 1 x Washing buffer(salt)for preparation of a 10 mM phosphate buffer,pH 7.4 contains 0.05%Tween 20 14 RIDASCREEN Sulfonamide 09-07-16 5.Materials required but not provided 5.1.Equipment:microtiter plate spectrophotometer(450 nm)centrifuge shaker(Vortex)mixer(Stomacher,Ultraturrax)rotary evaporator pasteur pipettes graduated pipettes variable 20 l-200 l and 200-1000 l micropipettes 5.2.Reagents:methanol p.a.ethyl acetate acetonitrile n-hexane(or n-heptane)NaCl 50 mM Sodium acetate buffer:dissolve 4.1 g sodium acetate(CH3COONa)in 900 ml distilled water,adjust pH 5 with HCl and fill up to 1000 ml with dist.water 6.Warnings and precautions for the users The standards contain sulfamethoxypyridazine,particular care should be taken.The stop solution contains 1 N sulfuric acid(R36/38,S2-26).7.Storage instructions Store the kit at 2-8 C(35-46 F).Do not freeze any of the test kit components.Return any unused microwells to their original foil bag,reseal them together with the desiccant provided and further store at 2-8 C(35-46 F).The reddish substrate/chromogen solution is light sensitive,therefore,avoid exposure to direct light.No quality guarantee is accepted after the expiration date on the kit label.Do not interchange individual reagents between kits of different lot numbers.RIDASCREEN Sulfonamide 09-07-16 15 8.Indication of instability or deterioration of reagents any bluish coloration of the substrate/chromogen solution prior to test implementation a value of less than 0.6 absorbance units(A450 nm 0.6)for the zero standard 9.Preparation of Samples store the sample in a cool place,protected against light homogenize the sample,use stomacher or mixer 9.1.Milk samples dilute milk samples 1:5(1+4)with sample dilution buffer(see 4.);e.g.100 l milk+400 l sample dilution buffer)use 50 l per well in the test 9.2.Meat(pork),egg,fish and shrimps weigh in 1 g of the homogenized sample into a centrifugal screw cap vial,add 2 ml methanol and vortex for 30 sec centrifuge:10 min/4000 g/20-25 C(68-77 F)transfer 1.5 ml of the methanolic solution into a new centrifugal vial and evaporate to dryness dissolve the residue in 0.5 ml sample dilution buffer,add 1 ml of n-hexane(or n-heptane)for degreasing and vortex for 10 sec centrifuge:10 min/4000 g/20-25 C(68-77 F)use 50 l of the lower phase per well in the test 9.3.Meat(chicken)weigh in 2 g of the homogenized sample into a centrifugal screw cap vial,add 6 ml acetonitrile/water(84:16;v:v)and shake for 10 min(with up-side-down shaker)centrifuge:10 min/3000 g/15 C(59 F)transfer 4 ml of the supernatant into a new centrifugal vial,add 2 ml 2 M NaCl,7 ml ethylacetate and shake for 10 min(with up-side-down shaker)centrifuge:10 min/3000 g/15 C(59 F)transfer the whole supernatant into a new centrifugal vial and evaporate to dryness dissolve the residue in 1 ml sample dilution buffer,vortex for 1 min,add 1 ml n-hexane(or n-heptane)and,vortex again for 2 min centrifuge:10 min/3000 g/15 C(59 F)use 50 l of the lower phase per well in the test 16 RIDASCREEN Sulfonamide 09-07-16 9.4.Honey weigh in 3 g of honey in a centrifugal screw cap vial and mix for extraction with 6 ml of 50 mM sodium acetate buffer,pH 5,(see 5.2.)vortex until complete dissolving of honey centrifuge:10 min/4000 g/20-25 C(68-77 F)Purify the whole extract with RIDA C18 column(Art.No.R2002);flow rate:1 drop/sec:rinse the column with 2 ml methanol equilibrate the column with 2 ml 50 mM sodium acetate buffer(pH 5)apply the whole sample extract rinse the column with 8 ml 50 mM sodium acetate buffer(pH 5)remove any excess fluid by pressure and flushing the cartridge with a stream of either air or nitrogen for 2 min elute sample with 1 ml methanol/sample dilution buffer(20:80;v:v)slowly dilute the eluate 1:3(1+2)with sample dilution buffer(e.g.100 l eluate+200 l sample dilution buffer)use 50 l per well in the assay 10.Test implementation 10.1.Preliminary comments Bring all reagents to room temperature(20-25 C/68-77 F)before use.A PBS-Tween buffer is needed as washing buffer,please use the washing buffer salt(pouch)contained in the kit(see 4.).Dissolve the total content of the pouch in one liter of distilled water.The ready to use washing buffer expires after approx.4-6 weeks at 2-8 C(36-46 F).Alternatively:Dissolve the contents of the pouch in 100 ml of distilled water to obtain a 10fold concentrated washing buffer.This solution expires after approx.8-12 weeks,stored at room temperature(20-25 C/68-77 F).Use one part of this concentrate and dissolve with 9 parts of distilled water to obtain the ready to use washing buffer.RIDASCREEN Sulfonamide 09-07-16 17 10.2.Test procedure Carefully follow the recommended washing procedure.Do not allow microwells to dry between working steps.1.Insert a sufficient number of wells into the microwell holder for all standards and samples to be run in duplicate.Record standard and sample positions.2.Add 50 l of each standard solution or prepared sample to separate duplicate wells.Use a new pipette tip for each standard or sample.3.Add 50 l of enzyme conjugate(red cap)solution to the bottom of each well.4.Add 50 l of antibody solution(black cap)to each well,mix gently by shaking the plate manually and incubate for 1 h at room temperature(