常用实验方法和所需试剂的配制.doc

一）Western-blot实验
1. Western blot主要实验试剂
溴酚蓝（Bromphenol Blue）
丽春红（Ponceau S）
考马斯亮蓝（Coomassie brilliant blue R-250）
吐温-20（Tween-20）
β-巯基乙醇(β-Mercaptoethanol)
十二烷基硫酸钠（SDS ）
过硫酸铵（APS）
TEMED
聚丙烯酰胺凝胶单体贮备溶液
4×浓缩胶缓冲液
4×浓缩胶缓冲液
甘氨酸
Tris碱
脱脂奶粉
牛血清白蛋白（BSA）
硝酸纤维素膜（NC膜）
蛋白质Marker和预染 Marker
通用蛋白裂解/提取试剂
BCA法蛋白定量试剂盒
Bradford法蛋白定量试剂盒
兔源性抗抗体
辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG
ECL超敏发光液
定影液、显影液、X光胶片曝光盒
其他试剂（乙醇、甲醇、冰醋酸、二甲苯、戊二醛等）
2. Western-blot主要实验试剂的配制方法
（1）10%SDS溶液: SDS粉末1g,加双蒸水10mL使其溶解，室温保存。
（2）10%APS：APS 20mg,加双蒸水200μL,混匀，现配现用。
（3）10×电极缓冲液（PH8.3）: SDS粉末10g、Tris碱30.4g、甘氨酸144g，双蒸水定溶至1000mL，4℃保存，用时10倍稀释。
（4）考马斯亮蓝固定液：乙醇500mL、冰醋酸10mL、双蒸水定溶至1000mL。
（5）考马斯亮蓝脱色溶液：95%乙醇250mL冰醋酸80mL，双蒸水定溶至1000mL。
（6）考马斯亮蓝染色溶液：0.29g考马斯亮蓝,溶解于250mL脱色液中，过滤后室温保存。
（7）转移缓冲液：甘氨酸2.93g、Tris碱5.812g、甲醇200mL、去离子水定溶至1000mL，4℃保存。
（8）10×TBS溶液：Nacl87.75g、Tris碱12.1g，用双蒸水溶至1000mL，4℃保存，用时10倍稀释。
（9）TBST溶液： 1×TBS溶液1000mL、Tween-20溶液1mL，混匀。
（9）丽春红溶液：100g丽春红,5mL冰醋酸，双蒸水定溶至100mL，室温保存。
（11）5×上样缓冲液：1mol/LTris-HCl(pH6.8) 0.6mL、甘油2.5mL、10% SDS溶液2mL、β-巯基乙醇（使用前加）0.5mL、1%溴酚蓝溶液1mL，去离子水定溶至10mL，4℃保存。
（12）12%分离胶：聚丙烯酰胺单体贮备液3.2mL、4×分离胶缓冲液0.5mL、10%SDS溶液80μL、10%APS溶液25μL、TEMED原液10μL、双蒸水溶至8mL。
（13）5%浓缩胶：聚丙烯酰胺单体贮备液0.68mL、4×浓缩胶贮备液0.25mL、10%SDS溶液40μL、10%APS溶液15μL、TEMED原液5μL、双蒸水溶至4mL。
（14）NC膜封闭液：脱脂奶粉1g，TBST溶液20mL中溶解，4℃保存。
（15）抗体稀释液：TBST溶液20mL、小牛血清白蛋白1g，混匀，4℃保存。
（16）Striping Buffer：β-巯基乙醇 35μL、10%SDS 溶液1mL、0.5MTris溶液(pH6.7) 625μL，去离子水定溶至5mL，室温保存。
3. Western-blot实验步骤
（1）总蛋白的提取 （采用北京普利莱公司蛋白质抽提试剂盒抽提）
①电子天平精确称取组织50mg（±2mg），放入含有1mL细胞裂解液和适量的PMSF（终浓度为1mmoL/mL）的预冷玻璃匀浆器内，冰上匀浆。
②取0.5mL匀浆液移入新的2mLEP管内，加1mL蛋白抽提试剂并混匀静置10min后（偶有颠倒混匀），12000g 4℃离心10min。
③弃去上清保留蛋白质膜，加2%SDS溶液500μL，100℃水浴10min，4℃放置2小时使蛋白质膜充分溶解。
（2）总蛋白浓度的测定（BCA法）
①配制统一的蛋白质标准品：以牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)的标准品溶液（浓度为1mg/mL）制作蛋白质标准曲线。分别吸取BSA标准品溶液0、100、200、400、800、1200、1600和2000μL，各自加入0.01MPBS溶液补足到2000μL，配成梯度浓度的标准品溶液，分装后-20℃备用。
②配制BCA工作液：按50：1的比例将BCA试剂盒内的A试剂与B试剂进行混合，配成BCA工作液。室温保存，1d内使用。
③样品处理：取各样品10μL，加0.01MPBS溶液490μL，配成待测样品。
④加样：先于酶标板上样孔内加入200μL BCA工作液，再分别加入倍比稀释的标准品及待测样品各20μL，酶标仪上震荡3min，充分混匀。
⑤测定：将酶标板置于恒温水浴箱中，37℃孵育30min。用MRK3型酶标仪测定562nm波长下各孔吸光度值（optical density，OD），采用Softmax5.2软件计算各样本蛋白质浓度。
（3）样品浓度的配平和制备
①配平：按测定的各样品蛋白质浓度，用2%SDS溶液配平各样品总蛋白浓度。根据预实验结果，将组织的总蛋白浓度调为1mg/mL。
②制备：将配平后的样品与5×上样缓冲液按4：1的比例混合。 100℃水浴10min，部分4℃保存用于电泳，部分-20℃保存备用。
（4）样品内蛋白含量的检测
①凝胶的配制：配制12%分离胶和5%浓缩胶（配制方法见附录）。
②上样：分别用Eppendorf微量移液器吸取蛋白质Marker或样品各10μL，将枪尖的插入加样孔的底部，缓慢地将样品或Marker加入加样孔，避免有气泡产生。
③电泳：浓缩胶：电压100V、电流400mA，电泳20min；分离胶：120V，400mA，电泳50min，待溴酚蓝到达凝胶底部，关闭电源。
④蛋白质转膜：恒压转移，转膜参数：电压100V，电流350mA，转移23min。结束后，将硝酸纤维素膜（nitrocellulose，NC膜）于丽春红染液中染色10 min，可见清晰的红色条带，表明转膜成功。去离子水冲洗，根据蛋白质Marker的位置将含有目的蛋白的膜条带上下各0.5cm）裁下。
⑤封闭：把NC膜置于封闭液内室温封闭4h（摇床上进行），TBST液洗膜2min×3次。
⑥免疫反应：将封闭好的膜置于一抗溶液中4℃孵育过夜，TBST溶液洗3min×5次后，NC膜再于辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG溶液中孵4℃育1h，用TBST溶液洗膜3min×5次。以上步骤均在摇床上进行
⑦曝光：将ECL超敏发光液中的A液和B液按1：1比例混合后滴于NC膜上，暗室内曝光30s，X-光片在显影液中显影2min，定影液中定影5min。
⑧分析结果：将NC膜上肌动蛋白染色条带结果扫描后输入电脑，IPP5.0图像分析系统分析结果。
（二）免疫组化（荧光）染色实验
1. 免疫组化（荧光）染色主要实验试剂
防脱片剂
一抗抗体
免疫组化试剂盒（SP或SABC）
DAB试剂盒
罗丹明标记的羊抗兔IgG
组织自身荧光淬灭剂
其他试剂（乙醇、甲醇、冰醋酸、二甲苯、戊二醛等）均为国产分析纯
2. 常用试剂的配制
（1）0.01MPBS溶液：中衫公司的PBS粉末一包，加蒸馏水2000mL，混匀，室温保存。
（2）4%多聚甲醛溶液：500ml 0.01MPBS液加40g多聚甲醛在2000 ml的烧杯内加热至60℃，边搅拌边加热，至溶液呈澄清，另加500 ml 0.01MPBS液至1000 ml。冷却后过滤， 4℃冰箱保存备用。
（3） 苏木素：
（4） 伊红：
3. HE染色方法
（1）二甲苯I脱蜡10min
（2）二甲苯II、III脱蜡各5min
（3）无水乙醇洗1min×2次
（4）95％酒精1min
（5）90％酒精1min
（6）85％酒精1min
（7）自来水洗2min
（8）苏木素染色1～5min
（9）自来水洗1min
（10）1％盐酸酒精分化20s
（11）自来水洗1min
（12）稀氨水（1％）反蓝30s
（13）自来水洗或蒸馏水洗1min
（14）伊红染色20s～5min
（15）自来水洗30s
（16）85％酒精脱水20s
（17）90％酒精30s
（18）95％酒精1min
（19）95％酒精1min
（20）无水乙醇2min
（21）无水乙醇2min
（22）二甲苯I、II、III透明各5min
（23）中性树胶封片
4.免疫组化染色
(1)制作切片：组织切片的制作、切片脱蜡、脱水过程按HE染色步骤进行；
(2)抗原修复：0.01M的枸橼酸缓冲液内、中火微波修复15min，冷却至室温后，PBS溶液洗3min×3次；
(3)封闭：封闭液室温封闭30min，弃去封闭液，不洗；
(4)免疫反应：滴加一抗抗体，4℃孵育过夜（保湿盒内进行），PBS溶液洗切片3min×5次后，滴加二抗，室温4℃孵育30min，PBS溶液洗切片3min×5次；滴加DAB试剂、显色。显微镜观察切片，蒸馏水终止显色反应。脱水、透明、封片。
(5)观察：每张切片随机选5个视野，扫描记录，并采用IPP5.0图像分析软件分析图像。
5.免疫荧光染色
(1)制作切片：组织切片的制作、切片脱蜡、脱水过程按HE染色步骤进行；
(2)抗原修复：0.01M的枸橼酸缓冲液内、中火微波修复15min，冷却至室温后，PBS溶液洗3min×3次；
(3)封闭：封闭液室温封闭30min，弃去封闭液，不洗；
(4)免疫反应：滴加一抗抗体，4℃孵育过夜（保湿盒内进行），PBS溶液洗切片3min×5次后，滴加罗丹明标记IgG，室温避光4℃孵育30min，PBS溶液洗切片3min×5次；滴加组织自发荧光淬灭剂，室温孵育30min，PBS溶液洗3min×3次；滴加抗荧光淬灭封片剂封片，4℃避光保存。
(5)观察：荧光显微镜观察切片，每张切片随机选5个视野，扫描记录，并采用IPP5.0图像分析软件分析图像。
（三）RT-PCR实验
1. RT-PCR主要实验试剂
TRIzol Reagent
DEPC
One Step RNA PCR Kit (AMV)
DNA Marker
琼脂糖
Tris
MOPS
MGP试剂
去离子甲酞胺
去离子甲醛
其他试剂（乙醇、甲醇、冰醋酸、二甲苯、戊二醛等）均为国产分析纯
2. 常用试剂的配制
（1）DEPC水(v/v)：在1000 ml去离子水中加入DEPC 1ml，37℃充分振荡过夜，高压灭菌。浸泡实验器具的DEPC水：在1000 m去离子水中加入DEPC 1ml，充分振荡后即可使用。
（2）75%乙醇(DEPC水配制):无水乙醉375ml，加入DEPC水定容至500ml。
（3）0.5M EDAT (pH8.0): EDAT-2Na 186.1g，加DEPC水至800ml，充分搅拌。用NaOH约20g调pH至8.0，用DEPC水定容至1000ml。高温高压灭菌后分装,室温保存。
（4）1×Tri-HCl(pH8.0):Tris 121.1g，加DEPC水800ml搅拌溶解后，用浓HCl约42ml调pH至8.0，用DEPC水定容至1000ml。高温高压灭菌后分装，室温保存"
（5）10×TE(pH8.0): 100mM Tris-HCI(pH8.0), 1mM EDAT(pH8.0), 加800mlDEPC
水混合均匀后定容至IL。高温高压灭菌后分装,室温保存。
（6）EB染液(200μg/μl)I:澳化乙锭2.0mg，,加DEPC水至10ml,充分搅拌数小时完全溶解后室温避光保存。
（7）1MM乙酸钠: 68g乙酸钠, 加DEPC水400ml，搅拌,用DEPC水定容至500ml。（8）10×MOPS电泳缓冲液:41.8gMOPS溶解于700ml灭菌的DEPC水中,用2M的NaOH调整到pH7.0, 加20ml乙酸钠和20 ml MEDAT(pH8.0), 用DEPC水调整到1L, 避光保存。
（9）10×甲醛变性琼脂糖凝胶：加1.5g琼脂糖到72ml灭菌去离子水中，煮沸溶解琼脂糖，将溶液冷却到55℃同时加入10ml 10xMOPS电泳缓冲液和18ml去离子甲醛后灌胶。
（10）10×甲醛凝胶缓冲液：甘油5ml, 25mg固体澳酚蓝, 25mg二甲苯青FF, 10mM EDAT(PH8.0) 5ml定容至10m。
（11）1.5%琼脂糖凝胶：琼脂糖1.5g，加入100ml l×TBE电泳缓冲液P(H8.3)后在微波炉内加热溶解，冷却至55℃左右加入EB染液(终浓度0.5μg/μl)充分混匀后灌胶。
（12）5×TBE电泳缓冲液(pH8.3): 54gTris碱，27.59硼酸，20ml 0.5M EDAT(pH8.0),定容至1L。
（13）6×凝胶载样缓冲液：0.25%嗅酚蓝(m/v)、0.25%二甲苯青(m/V), 30%甘油水溶液，4℃保存。
3. RNA提取方法
（1）组织取出后立刻至于液氮中。
（2）脑组织称取后在液氮存在下研磨3次成粉末状（需要磨成非常细的粉末,否则抽提效率会降低）。
（3）待液氮挥发干，立即加入TRIzol，每100mg组织加1ml TRIzol，用加样枪吹吸，使样品充分裂解，移入1.5 ml EP管中，静止5min，以使核酸蛋白复合体完全分离。
（4）在EP管中加200μL氯仿，剧烈振荡15秒，静置5min。
（5）将EP管在4℃ 12000g，离心15min，离心后混合物分离成一个较低的红色苯酚-氯仿的有机相，一个中间相和一个无色的上层的水相。
（6）用移液器小心吸出上层水相(不要吸取中间白色的中间层)300ml，加入另一EP管中。
（7）加入500 μL预冷过的异丙醇，振荡混匀。-20℃沉淀过夜。
（8）4℃ 12000g，离心15min，此时在EP管中常常能看到白色沉淀，小自移出
上清。
（9）沉淀中加入lml预冷过的75%乙醇，振荡混匀后4℃ 7500g，离心5min。
（10）重复用75%乙醇洗涤RNA沉淀一次。
（11）去上清，RNA沉淀于空气干燥5-10min，,加入DEPC水充分济解(难溶时可在55-60℃孵育10min助溶。
4. RNA定量检测
（1）提取适量总RNA用1×xTE稀释200倍，以1xTE作为空白对照。
（2）分别测定在260nm和280nm处的吸光值，纯RNA的OD260/OD280比值应接近2.0(比值最好在1.7-2.0之间)。
(3)在260nm处的吸光度，1OD=40μg/ml NRA。浓度计算公式如下：A260光密度值×40×稀释倍数/1000=μg/μl RNA。
5、琼脂糖变性凝胶电泳质检RNA
（1）在EP管内建立变性反应:
对照组总RNA（约5μg）2.0 μl
10×MOPS电泳缓冲液 2.0 μl
去离子甲醛 4.0 μl
去离子甲酰胺 10.0μl
澳化乙锭(200μg/μl) 1.0 μl
（2） 将EP管置于水浴恒温器中65℃ 温育5min，取出立刻置丁冰上10min，然后离心5s，将所有液体沉淀到EP管内底部。
（3）加2.0 μl 10×甲醛凝胶缓冲液并重新置于冰上。
（4）将1.5%甲醛变性琼脂糖凝胶放入水平电泳槽内，加入足量1×MOPS电泳缓冲液覆盖凝胶约lmm，加RNA样品到凝胶加样孔中。
（5）5V/cm电压下电泳直到溴酚蓝移出约8厘米，由于电泳过程中电泳缓冲液的pH值会发生变化，需每小时人工转变缓冲液。
（6）紫外线下观察，拍照。提取质量较好RNA电泳结果为5s、18s和28s三条带清晰，没有明显的降解，28s RNA条带是18s RNA条带亮度的两倍。
6、RT-PCR反应
（1）按照试剂盒说明书加入试剂。
（2）RT-PCR反应。
（3）反应结束后，取PCR反应液各5μl进行1.5%琼脂糖凝胶（含EB）电泳。
（4）5V/em电压下电泳40min。
（5）紫外线下观察，拍照。
（四）ElISA实验
1. RT-PCR主要实验试剂
2.ElISA操作步骤
（1）取右心血液,在4℃下2000r/min离心10min,取上层血清。
（2）取出ELISA试剂盒平衡至室温。
（3）取出反应板每孔分别加入20μl标准品、20μl血清于反应板孔中。
（4）每孔加入100μl Zero Buffer,轻轻混匀30秒,室温温育30min。
（5）洗板:甩尽板内液体,用蒸馏水或者洗涤液洗涤反应板,并去除水滴(在厚叠吸水纸上拍干),这样反复洗涤5次。
（6）每孔加入150ul酶联物(Reagent),轻轻混匀10秒,室温温育30min。
（7）洗板：与步骤5相同。
（8）每孔加入IO0μl TMB显色液，轻轻混匀10秒钟，置暗处室温温育20 min。
（9）每孔加入50μl终止液(stop solution)，轻轻混匀30s；确定兰色变为黄色(重要)，30min内在45Onm处读OD值。
（10）以OD值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据豚鼠血清样品的OD值可在标准曲线上查出其浓度。
（五） 原位杂交实验
1. 原位杂交实验所需试剂
TriS
曲拉通X-100
吐温-20
DEPC
mRNA原位杂交试剂盒及专用盖玻片
原位杂交寡核昔酸探针
2. 原位杂交所需试剂的配制方法
（1） DEPC水：在1000ml去离子水中加入DEPC 1ml，37℃下充分振荡过夜，高温高压灭菌，浸泡实验器具的DEPC水：在1000ml去离子水中加入DEPC1ml而，充分振荡后即可使用。
（2） 组织细胞打孔液：DEPC处理的构椽酸缓冲液(0.01mol)99.5ml,加入曲拉通X-100 0.5ml，混匀即可。
（3）DEPC处理的PBS缓冲液：1000 ml PBS缓冲液(0.01mol)中加入DEPC 1ml，
荡过夜，高温高压灭菌。
（4）0.1 mol TBS: 8.5g NaCI、l.2g Tris用DEPC处理的去离子水定容至I000ml,混匀, 用乙酸调pH至7.5。
（5）过氧化氢封闭液: 市售30%的过氧化氢10ml，加DEPC处理的PBS缓冲液定容至100ml, 此液现用现配。
（6）4%多聚甲醛 4g多聚甲醛溶于DEPC处理的双蒸水100ml中, 50℃加热搅拌，滴加IN氢氧化钠直至白色的多聚甲醛完全溶解，3号定性滤纸过滤备用。
（7）20×SSC 缓冲液的配制：氯化钠 175.3g、柠檬酸三钠 88.2g 加 DEPC 处理的去离子水混合均匀后定容至 1L。2×SSC、0.2×SSC 依次稀释 10 倍。
3. 原位杂交实验步骤
（1）取组织，于DEPC处理的4%多聚甲醛中固定2h，15%蔗糖(4℃)脱水1天,冰冻切片12μm。
（2）原位杂交合成探针（8μg/ml, 地高辛标记)
（3）切片丙酮中浸泡10min，DEPC处理的PBS(0.01M, pH7.4)冲洗3min。
（4）置打孔液中室温10分钟，以改变组织细胞的通透性使探针快速顺利地穿透细胞膜，0.01 M PBS冲洗3次, 每次3min。
（5）加过氧化氢封闭液室温20分钟，以封闭内源性过氧化氢酶，0.01 M PBS冲洗3min。
（6）滴加复合消化工作液覆盖组织表面，4℃ 20min，0.01M PBS冲洗3次，0.2×
SSC冲洗一次(室温3min)。
（7） 滴加预杂交工作液(25μl/张)覆盖组织，37℃孵育盒孵育过夜。
（8）预杂交后，揭去盖玻片，以0.2×SSC 37℃洗3次,每次5min。以上步骤所
用洗液均经DEPC处理。
（9） 滴加杂交工作液(25μl/张)覆盖组织，37℃孵育盒孵育6h。
（10） 揭去盖玻片以2×SSC 37℃洗3次,每次5min；0.2×SSC 37℃洗3次,每次5min；0.l mol TBS 37℃洗4次, 每次5分钟。
（11） 滴加小鼠抗地高辛生物素标记的抗体工作液，37℃孵育30 min，0.0l M PBS
冲洗3次,每次5min。
（12） 滴加高敏过氧化物酶链亲和素复合工作液，37℃孵育30 min，0.0l M PBS 冲洗3次,每次5min。
（13） DAB显色，光镜下观察，当细胞浆内阳性颜色与细胞外背景色对比度反差明显时，蒸馏水洗终止反应。胞浆显棕黄色颗粒为阳性反应。80%酒精-90%酒精-无水乙醇-二甲苯脱水,每步4分钟,中性树胶封片，4℃保存。
或（13） 滴加高敏荧光链亲和素复合物（FITC）工作液，4℃湿盒孵育 2h。 0.01M PBS 冲洗，5min×3 次。甘油封片。