两型星形胶质细胞基因表达谱差异的初步观察.docx

两型星形胶质细胞基因表达谱差异的初步观察
【摘要】 目的：研究不同型别星形胶质细胞的基因表达谱，比较1型和2型星形胶质细胞基因表达谱之间的差异，以进一步研究两者的生物学特性及其功能。方法：原代培养新生SD大鼠大脑皮质混合胶质细胞，经振荡和差速消化纯化培养1型星形胶质细胞和2型星形胶质细胞；应用基因芯片技术获取T1A和T2A的基因表达谱，并对两者的基因表达谱进行初步分析。结果：基因芯片上检测点4096个，共有差异表达基因267条，其中113条在T1A中高表达，154条在T2A中高表达。结论：本实验获得大鼠大脑T1A和T2A的基因表达谱，首次报道267条存在于T1A和T2A之间的差异表达基因。

【关键词】 星形胶质细胞；细胞谱系；基因表达谱；基因芯片
随着研究的不断深入，人们已认识到胶质细胞不仅对神经元有支持、分隔绝缘、形成髓鞘、营养、修复和再生等多种功能。并积极参与神经元的活动，调节神经元的代谢和离子环境，对神经系统的发育和正常生理活动以及病理变化都具有重要作用。而且胶质细胞对正常脑发育、神经元的调控和中枢再生等方面所发挥的作用，已不亚于神经元本身。星形胶质细胞是中枢神经系统中最主要的胶质细胞，根据发生分化谱系的不同可分为1型(type 1 astrocyte, T1A)和2型(type 2 astrocyte, T2A)星形胶质细胞，两者行使着某些不同的生物学功能[1~3]。目前有关T1A和T2A基因表达差异的研究尚未见文献报道。本实验应用基因芯片技术研究T1A和T2A基因表达谱及其之间的差异，这对认识不同型别星形胶质细胞的功能有极其重要的意义。
　　1 材料与方法
　　细胞培养 取新生SD大鼠大脑皮质作原代混合胶质细胞培养，采用振荡法和胰酶差速消化法，结合使用富含血清培养基，分别纯化培养T1A和T2A。将大鼠大脑T1A作为对照组，T2A作为实验组。
　　基因芯片 采用上海博星基因芯片责任有限公司芯片，芯片类型为BiostarR-40S。1型星形胶质细胞样品编号T1A，Cy3标记，2型星形胶质细胞样品编号T2A，Cy5标记。
　　细胞 总RNA提取 D-Hank’s液洗涤纯化培养的T1A和T2A，每10cm2细胞加入2ml Trizol试剂裂解细胞，使之充分溶解,分别转移入 15 ml离心管，加入氯仿，15℃~30℃放置3min，4℃12000g/min离心15min,吸取上清分别至另一15ml离心管，加入异丙醇，15℃~30℃放置10min，4℃12000g/min离心10min,弃上清，加入75%乙醇，4℃8000g/min离心10min，弃上清，超净工作台内干燥沉淀，加入适量DEPC水完全溶解RNA沉淀，-80℃保存。
　　探针标记和杂交 预杂交：预杂交液95℃水浴变性2 min，预杂交的玻片95℃水浴变性30 s取出放入无水乙醇中30s，晾干后将变性的预杂交液加到玻片的点样区域内，盖上盖玻片，放入杂交箱内42℃预杂交5～6h；标记探针：分别在2个 Eppendorf管中依次加入ddH2O 23μl、逆转录引物5μl和T1A或T2A总RNA 100μg，反应总体积50μl。混匀置70℃水浴10min，取出后迅速置冰，分别加入逆转录酶缓冲液10μl、DTT 5μl和dNTPs 4μl，在暗室中加入逆转录酶2μl和Cy3-dCTP或Cy5-dCTP3μl，混匀样品，室温2min，42℃水浴2 h，加入标记试剂I 4μl，65℃水浴10 min后加入标记试剂 II 4μl，混匀，合并实验组和对照组，避光，真空抽干至50μl，DNA纯化柱纯化DNA，加入标记试剂III 8μl，真空抽干；杂交：在抽干的探针管中加入μl杂交试剂I，充分混匀至探针溶解，再加入μl杂交试剂II，混匀备用。将预杂交的玻片取出并去除盖玻片，探针置95℃水浴变性2min取出后迅速置冰，玻片置95℃水浴变性30s取出浸入无水乙醇30s，将探针置于芯片上，盖玻片覆盖，置于杂交舱中并以Parafilm密封，42℃杂交箱内杂交18h，取出玻片并去除盖玻片，洗片剂洗涤后晾干扫描。
　　杂交结果检测和图像分析 用ScanArray 4000扫描仪扫描芯片，通过芯片图像分析软件GenePix 对芯片灰度扫描图进行分析。收集Cy3和Cy5荧光标记信号值，将Cy5信号值小于200的以200取代以避免弱信号对实验结果的干扰。为校正Cy5、Cy3标记体系间的系统误差，均对实验数据进行均一化处理：计算每个有效基因点的Ri的自然对数值r [= ln (Cy5 /Cy3)]，算出全部有效基因点r的平均值r’， 实验的均一化系数ND就等于r’的倒数即ND=EXP(r’)。将所有基因点的Cy3信号值乘ND，得出调整后的Cy3*，将所有小于200的Cy3*值以200取代以避免弱信号对实验结果的干扰。计算每个基因点在本次实验中的表达差异值Ratio，Ratio2或的数据项表示差异表达的基因。
　　2 结果
　　总RNA提取 正常SD大鼠大脑1型和2型星形胶质细胞总RNA提取结果：T1A总RNA及T2A总RNA电泳结果均可见清晰的18S和28S条带，两者亮度比为1∶2，隐约可见5S条带，表明RNA没有降解，纯度较高，符合实验要求。
　　基因表达谱 基因芯片上测定了4096个点，包括1500条已知基因，2548条未报道基因，其中48个阴性对照点，实验中这些点的杂交信号很低。经过2次重复试验，发现在T1A高表达()的基因分别有157条和195条，而在T2A高表达()的基因分别有195条和244条。最后筛选出两次试验中均出现高表达的基因，它们在与两种荧光标记的探针杂交时表现出较大的差异，且上下调趋势一致，程度相似，认为它们是表达存在差异的基因，分别有113条和154条基因在T1A和T2A中高表达。统计结果见表1，两型星形胶质细胞基因表达谱。
　　3 讨论
　　基因芯片是将大量的靶基因片段有序地、高密度地固定在玻璃、硅等载体上，以检测不同样本基因表达情况的一项技术。自1995年Stanford大学的Schena M等发表第一篇应用基因芯片的论文以来，基因芯片已广泛用于基因功能的研究[5~7]。基因芯片技术大大推动了功能基因相关分子生物学的研究。
　　基因表达谱芯片是目前应用最广泛的基因芯片，是将几千个基因特异探针或其cDNA片段固定在一块基因芯片上，对来源于不同个体、不同组织、不同细胞周期、不同发育阶段、不同病变、不同刺激下的细胞内的mRNA或逆转录产物cDNA进行检测，从而大规模对这些基因表达的个体特异性、组织特异性、发育阶段特异性、分化阶段特异性、病变特异性、刺激特异性进行综合的分析和判断。与传统研究基因表达差异的方法相比[8，9]，基因表达谱芯片具有许多优点：检测系统微型化，对样品等需要量非常小；能同时研究成千上万条基因的表达变化，研究效率明显提高；能
[1] Brown DR. A method for long term culture of murine type 2 astrocytes[J]. J Neurosci Methods, 1998,79:161-167.
　　French-Constant C, Raff MC. The oligodendrocyte-type-2 astrocyte cell lineage is specialized for myelination[J].Nature, 1986, 323: 335-338.
　　Miller RH, Abney ER, David S, et al. Is reactive gliosis a property of a distinct subpopulation of astrocytes[J]. J Neurosci, 1986, 6: 22-29.
　　孙 燕, 王 劼, 夏春林. 新生大鼠大脑皮质O2A 祖细胞的体外诱导分化[J]. 解剖学研究, 2004, 26(3):167-170.
　　Schena M, Shalon D, Dais RW, et al. Quantitative monitoring of gene expression with a complementary DNA microarray[J]. Science, 1995, 270 (2):467-470.
　　Schena M,Shalon D,Heller R,et　human genome analysis：Microarray-based expression monitoring of 1000 genes[J].Prog Nat Acad Sci, USA, 1996,93: 10614-10619.
　　Golub TR, Slonim DK, Tamayo P, et al. Molecular classification of cancer：Class discovery and class prediction by gene expression monitor[J]. Science,1999,286(5439):531-537.
　　Beattie JH. Obesity and hyperleptinemia in metallithionein null mice[J]. Proc Nat Acad Sci, USA, 1998,95:358-363.
　　Kuang WW, Thompson DA, Hoch RV, et al. Differential screening and suppression subtractive hybridization identified genes differentially expressed in an estrogen receptor-positive breast carcinoma cell line[J]. Nucleic Acid Res, 1998, 26(4):1116-1123.
　　[10] Belliveau DJ, Naus CC. Cortical type 2 astrocytes are not dye coupled nor do they express the major gap junction genes found in the central nervous system[J]. Glia, 1994, 12(1): 24-34.
　　[11] Aloisi F, Agresti C, Levi G. Establishment, characterization and evolution of cultures enriched in type-2 astrocytes[J]. J Neurosci Res, 1988, 21: 188-198.
　　[12] Xia CL, Du ZW, Liu ZY, et al. A2B5 lineages of human astrocytic tumors and their recurrence[J].Int J Oncol, 2003, 23: 353-361.