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格列酮对内皮祖细胞增殖、黏附及迁移能力的影响【摘要】 目的:观察罗格列酮(rosiglitazone，Ros)对体外培养内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs) 增殖、黏附及迁移能力的影响。方法:以密度梯度离心法获取脐血单个核细胞，培养7 d后收集贴壁细胞并分为正常对照组、单独Ros (1mol/L、5mol/L及10mol/L)组、H2O2氧化应激模型组、Ros(1mol/L、5mol/L及10mol/L)和H2O2共同干预组，培养24 h。用流式细胞仪检测细胞表达CD34、CD133、VEGFR-2、VE-Cadherin并用荧光显微镜观察细胞吞噬DiI-ac-LDL和FITC-UEA-1来鉴定EPCs。分别用CCK-8、普通光学倒置显微镜、改良的Boyden小室检测EPCs的增殖、黏附和迁移能力。结果:与正常对照组相比，单独Ros干预组呈浓度依赖性促进脐血来源的EPCs增殖、黏附及迁移能力，但是Ros 5mol/L和10mol/L组间没有显着差异；与H2O2氧化应激损伤组相比，Ros能呈浓度依赖性改善H2O2对EPCs增殖、黏附及迁移功能的抑制，Ros 5mol/L和10mol/L干预保护组之间没有显着差异。结论:噻唑烷二酮类药物Ros除具有激动PPAR-受体降糖作用外，还具有抗氧化应激损伤作用。Ros能促进EPCs功能，改善H2O2致EPCs功能的氧化应激损伤。【关键词】 罗格列酮 内皮祖细胞 过氧化氢 氧化应激 Abstract: Objective: To study the effect of rosiglitazone on the ability of proliferation, conglutination and transfere of endothelial progenitor cell in vitro. Methods: Total mononuclear cells were isolated from the umbilical cord blood with ficoll density gradient centrifugation, after the red 内皮祖细胞被认为是表达CD34/CD133/VEGFR-2的一群细胞，可以分化为内皮细胞，参与成体血管新生，同成熟内皮细胞相比具有迟发性的高增殖性。EPCs具有干/祖细胞增殖分化的特性，大量的动物实验和一些临床研究证明，EPCs是治疗缺血性疾病和修复血管内皮的良好种子细胞，具有巨大的临床应用潜能。越来越多的研究结果揭示，心血管危险因素如高血压、糖尿病、高血脂、年龄、吸烟都会抑制EPCs的功能，促进细胞衰老和凋亡1，2，EPCs的数量和功能可作为心血管疾病危险程度新的预测因子。近年来我国的糖尿病发病率明显上升，糖尿病被认为是冠心病的等危症，糖尿病患者10年心脑血管疾病发病率大于20%。噻唑烷二酮(TZDs)Ros是选择性激活过氧化物酶体增殖激活受体激活剂,是治疗糖尿病的常用药。最近研究发现，TZDs类药物具有抗炎、抗免疫、保护血管内皮、抗动脉粥样硬化、降血压等胰岛素增敏效果的外作用3-5。本实验旨在观察Ros在体外正常培养和H2O2氧化应激损伤模型下对EPCs功能的影响，为明确Ros治疗糖尿病外的血管保护作用提供新的依据。 1 材料和方法 材料 6%羟乙基淀粉，纤维连接蛋白，VEGF，PE-CD34，FITC-VE-cadherin，PE-VEGF-2及FITC-AC133，胎牛血清、M199，Dil-ac-LDL，FITC-UEA-1、rosiglitazone，改良的Boyden小室(江苏海门麒麟医用仪器厂生产)，CCK-8细胞计数试剂盒，胃癌细胞株(SGC7901，中国科学院上海生科院细胞资源中心提供)。EPCs培养及鉴定人脐血培养EPCs：外周血采集于温州医学院第一附属医院分娩室。参考文献，取健康孕妇分娩后脐血50 ml，6%羟乙基淀粉沉淀红细胞，以密度梯度离心法分离脐血单个核细胞，以5106/cm2接种于包被有纤维连接蛋白的6孔培养板中，每孔加入2 ml包含有20%胎牛血清、VEGF(10 ng/ml)，青霉素(100 IU/ml)及链霉素(100 IU/ml)的M199培养液，置37 、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养。3 d后，洗去未贴壁细胞，添加培养液继续培养，以后每隔3 d换培养液。EPCs鉴定：在培养的第7天，细胞以%胰酶消化，制成1106/ml的单细胞悬液，加入荧光标记的抗CD34、VE-Cadherin、VEGFR-2及CD133单克隆抗体各10l(1mg/ml)，流式细胞仪分析内皮祖细胞CD34、VE-Cadherin、VEGFR-2及CD133的表达情况。根据EPCs具有吞噬DiI-ac-LDL的特性，将DiI-ac-LDL以g/ml的终浓度加入培养液共孵育3 h，以2%的多聚甲醛固定10 min，再加入3l FITC-UEA-1(避光操作)，于37 孵育1 h。荧光显微镜下观察。以不加DiI-ac-LDL和FITC-UEA-1的同批培养细胞为对照。阴性对照采用SGC7901。实验分组 在培养第7天后，以%胰酶将各孔细胞消化下来制成细胞悬液，以等数量细胞接种，随机分为正常对照组、Ros组(浓度分别为1、5、10mol/L)、H2O2氧化应激损伤模型组、Ros+H2O2共同干预组，每组6孔培养24 h后，进行细胞功能检测。CCK-8增殖能力检测 单细胞悬液以1104/孔的接种密度接种到96孔板，随机分组培养24 h后，更换新鲜培养液，每孔加入10l CCK-8细胞计数试剂，于37 孵育 h，酶标仪450 nm下读取吸光度OD值。黏附能力检测 单细胞悬液以5104/孔的接种密度接种到24孔板，随机分组，培养24 h后，各组细胞以%胰酶消化制成细胞悬液，以相同细胞数接种96孔板，置37 培养箱中培养30 min，洗去未贴壁细胞，倒置显微镜下随机选取10个视野(400)，计数黏附细胞数。迁移能力检测 单细胞悬液以5104/孔的接种密度接种到24孔板，随机分组，培养24 h后，各组细胞以%胰酶消化制成细胞悬液，并计数。将培养液100l加入改良Boyden小室的下室，将2104/ml EPCs悬浮在150l培养液，注入上室，培养24 h，刮去滤膜上未移动的细胞，用甲醛固定，苏木素染色，随机选择4个显微镜视野(200)，计数迁移的细胞。统计学处理方法 用统计软件进行统计分析，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较方差齐者采用LSD检验，方差不齐者采用Dunnetts T3检验。 2 结果 EPCs鉴定培养3 d洗去不贴壁细胞及碎片后，可见典型细胞集落:中间为大量的圆形细胞， 层层叠叠，外周为纺锤形细胞，向外扩散(见图1A)。培养第7天荧光显微镜检显示:细胞吞噬DiI-ac-LDL，显微镜下激发红色荧光(见图1B)，细胞吞噬FITC-UEA-1，显微镜下激发绿色荧光，空白对照及阴性对照均无荧光。用流式细胞仪分析表明，表达CD34、CD133、VEGFR-2、VE-Cadherin的细胞分别为()%、()%、()%及()%。Ros对EPCs增殖能力的影响 由表1可知，与对照组相比，Ros干预组呈浓度依赖性地促进EPCs的增殖(或)；与H2O2组相比，Ros加H2O2干预组也呈浓度依赖性地保护EPCs的氧化应激损伤，改善EPCs的增殖能力（或)。Ros 5mol/L组、Ros 10mol/L组和Ros 5mol/L加H2O2干预组、Ros 10mol/L加H2O2干预组，两组间差异均无显着性（均)。Ros对EPCs黏附能力的影响由表1可知，与对照组相比，(5mol/L、10mol/L) Ros组能明显提高EPCs黏附能力(均)，1mol/L Ros干预组无明显差异向内皮系转化，增加球囊损伤血管内膜的内皮覆盖率，抑制平滑肌细胞增殖，这一作用可能与APC的eNOs活性有关。但是Gensch C等11研究发现，TZDs类药物吡格列酮促进大鼠皮下聚乙烯抑制物上血管新生，减少内皮祖细胞的凋亡，改善内皮祖细胞功能，可能是通过PI3K/Akt而不是eNOs途径起作用。Onuta G等研究发现Ros能显着抑制小鼠颈动脉移植后细胞免疫、炎症反应，抑制中膜、内膜平滑肌增生，减小动脉粥样硬化斑块形成。 Dernbach等11研究发现与脐静脉内皮细胞相比，EPCs具有较低的活性氧水平；H2O2或LY-83583(10mol)干预培养18 h，EPCs较脐静脉内皮细胞胞内的活性氧水平低、凋亡细胞少，其认为与EPCs胞内高表达过氧化物歧化酶、谷胱甘肽还原酶、过氧化氢酶有关。由于EPCs自身具有很强的抗氧化、低活性氧的特点，本实验采用过氧化氢500mol/L作用24 h，制造细胞的氧化损伤模型12，13。本实验证实Ros在正常培养条件下促进EPCs增殖、黏附、迁移能力；在H2O2氧化应激损伤培养条件下Ros能保护H2O2致氧化应激损伤对EPCs的功能抑制，改善增殖、黏附、迁移能力。因此Ros在治疗糖尿病的同时可以起到与糖代谢无关如抗氧化应激损伤、抑制炎症反应、保护循环中的EPCs作用，而发挥修复损伤内皮的血管保护作用。其保护EPCs可能是通过活化PPAR-再通过PI3K/Akt和eNOs途径起作用，具体机制待进一步实验明确。 【参考文献】 1 Imanishi T,Hano T, Nishio I. 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