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1、资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。 米糠多糖的提取研究及米糠中水溶性维生素的测定 ( 江南大学化学与材料工程学院, 江苏无锡214122) 摘要: 微波浸提法研究了米糠多糖的提取, HPLC法同时测定了米糠中4种水溶性维生素。 料液比为1: 8在50％微波火力条件下浸提30min, 三氯乙酸去蛋白, 两步去淀粉, 30％醇沉, 米糠多糖得率达1.41%。以体积比为88:12的0.1％磷酸水溶液-甲醇为流动相, 以0.6 mL/min流速等度洗脱, 在266nm波长下检测。各组分在8min能基线分离。
2、米糠中VB1、 VB6、 烟酸和烟酰胺的含量分别为7.7×10-6 g/g、 1.3×10-6g/g、 14.9×10-6 g/g、 16.2×10-6 g/g。 关键词: 米糠; 多糖; 微波浸提; 水溶性维生素; 高效液相色谱 Study on Microwave Assistant Extraction of Rice Bran Polysaccharides and Determination of Water-Soluble Vitamins in Rice Bran Abstract: Microwave assistant extraction has been appli
3、ed for polysaccharides in rice bran samples. The best technology were that the material-water ratio was 1:8, the time of microwave assistant extraction was 30 min under 50% firepower. It was proved that α-amylase could wipe off amylum effectively by two steps, and trichloroacetic acid method was the
4、 best way to wipe off albuminoid. And the ethanol concentration was 30%, the extraction rate of the water-soluble polysaccharides of rice bran was 1.41%.High performance liquid chromatography (HPLC) has been applied for the simultaneous determination of four kinds of water-soluble vitamins including
5、 vitamin B1, vitamin B6, nicotinic acid, and nicotinamide in rice bran. The separation was performed on a Hypersil C18 column (250 cm×4.6mm i.d., 5.0 μm) with a mobile phase of 0.1% H3PO4- methanol (88:12, V/V) at flow rate of 0.6 mL /min, and detection wavelength was 266 nm.. Baseline separation of
6、 four vitamins can be achieved within 8 minutes.The content of 7.7×10-6 g/g、 1.3×10-6g/g、 14.9×10-6 g/g、 16.2×10-6 g/g for vitamin B1, nicotinic acid ,vitamin B6 and nicotinamide. Key words: rice bran; polysaccharides; microwave assistant extraction; water-soluble vitamins; high performance liquid
7、chromatography 米糠是一类具有广泛开发潜力的高附加值资源, 含有稻米的64％营养物质及90％人体所需要的各种营养元素[1], 包括维生素、 米糠多糖、 氨基酸、 脂肪酸、 矿物质, 还有二十八碳烷醇、 神经酰胺等生理功能卓越的活性物质[2]。米糠多糖( Rice Brain polysaccharide, RBP) 存在于稻谷的颖果皮层里, 主要是指分子量不等的一类非淀粉多糖。采用不同的提取工艺会得到不同的米糠多糖组分。米糠多糖具有广泛的生理活性, 在抗肿瘤, 增强免疫力, 降血糖, 降脂方面有显著效果; 水溶性维生素是一类重要的营养成分, 在各种保健品[3], 功能型饮料中得
8、到应用。烟酸和烟酰胺能够促进头皮血液循环, 防止脱发; VB6具有美发功效; VB1具有滋养与深层清洁的作用, 因此化妆品中也常添加微量的维生素[4]。因此, 本实验对这两种活性成分进行了研究。 多糖提取的方法有微波浸提法, 热水蒸煮法, 超声波提取法等。实验中考察了米糠多糖的提取方法及去除杂质方法。选取较优的微波提取法, 并对其提取工艺参数进行了进一步优化。测定维生素的方法有紫外分光光度法[5]、 荧光法[6]和高效液相色谱法( HPLC) [7]。但HPLC技术用于米糠中水溶性维生素的测定还未见报道。实验采用HPLC建立了米糠中的水溶性维生素的测定方法, 对样品前处理方法进行了研究, 对
9、测定体系各影响因素进行了优化。方法简便快速, 准确可靠, 对复杂体系中水溶性维生素的测定具有重要的参考价值。 一 米糠多糖的提取研究 1. 米糠多糖的提取 1.1 实验材料 米糠: 无锡秦良商贸有限公司 耐高温α-淀粉酶: 无锡酶制剂厂, 0IU/g 试剂: 无水乙醇、 石油醚、 三氯乙酸、 盐酸均为分析纯, 购自国药集团化学试剂有限公司。 1.2仪器 722型可见光分光光度计; LD4-2A型台式离心机; Panasonic微波炉; 真空冷冻干燥机。 1.3实验方法 1.3.1 米糠样品的前处理 将米糠用石油醚按1: 3比例脱脂1小时, 重复3次, 自然干燥。 1.
10、3.2 用改进的硫酸-苯酚法测米糠多糖含量 1.3.2.1 显色剂的制备 将50 mL浓硫酸缓缓加入10 mL水中, 冷却至室温, 加入0.6 g苯酚晶体搅拌使其溶解配成显色液。 1.3.2.2 硫酸-苯酚法测米糠多糖含量 取1.00 mL稀释一定倍数的糖液于试管中加入5.00 mL显色液振荡混匀; 取1.00 mL蒸馏水于试管中加入5.00 mL显色液振荡混匀, 得到参比溶液。将标准溶液和参比溶液置于沸水浴中保温30~35 min, 取出后放在冷水浴中冷却至室温, 于490 nm波长处测定其吸光值。 传统的硫酸-苯酚测糖法的操作过程是: 取1.00 mL样品加1.00 mL水, 加
11、1.00 mL 6 %苯酚摇匀后再加入5 mL浓硫酸, 振荡显色, 静置30 min后, 于490 nm处检测其吸光度。加入硫酸时系统显色温度相差较大, 而造成相应的偶然偏差。而改进后的方法, 由于先把水和硫酸混合, 对浓硫酸起到了稀释作用, 用冰水冷却最后加入苯酚晶体, 配成显色液。经过沸水浴加热来使其显色, 保证了反应系统温度一致, 很好地解决了检测重现性与准确度的问题。 1.3.3去除杂质方法的比较 在多糖提取的过程中, 蛋白与淀粉的去除会影响到多糖的纯度与得率。因此本实验采用50%微波火力浸提30min, 重复两次提取。考察了Sevage法与三氯乙酸法去蛋白法; 同时也考察了淀粉一
12、步消化法与两步消化法。正交实验见表1。实验结果见图 1。 Sevage法 三氯乙酸法 一步消化法 两步消化法 30%醇沉 Ⅰ √ √ √ Ⅱ √ √ √ Ⅲ √ √ √ Ⅳ √ √ √ 由此能够看出: 淀粉一步消化所得多糖略高于两步消化所得, 可能是由于在较短的时间内淀粉未去尽, 而淀粉本身就是一种多糖物质, 为了得到较纯的米糠多糖, 实验优先考虑采用两步消化法; 在去蛋白的方法中, 比较Ⅱ、 Ⅳ得知, 采用Sevage法与三氯乙酸法所得米糠多糖含量差别不大, 考虑到Se
13、vage法毒性较大, 耗时较长, 实验优先考虑三氯乙酸法。 图 1 正交实验结果 1.3.4 米糠多糖提取方法选择 1.3.4.1 微波浸提法 脱脂米糠与pH=5的盐酸水溶液以料液比为1: 10混合置于50％微波火力下浸提30min, 冷却, 离心得上层液, 重复提取两次, 合并上层液。在上层液中加入0.5％的耐高温α-淀粉酶于70oC的水浴锅中保温消化2小时后, 再加入0.25％的0.5％的耐高温α-淀粉酶, 在相同的条件下保温消化15小时, 离心得上清液。用30％的三氯乙酸调节上述得到的上清液的pH＝4.5( 即米糠蛋白等电点, pI) , 置于4oC冰箱中
14、静置过夜, 使得米糠蛋白得以充分沉淀。离心得上清液。在上述得到的上清液中, 加入无水乙醇, 使其含量为30％( V/V) , 置于4oC冰箱中静置过夜, 离心, 得到米糠粗多糖RBPa溶液。用722型分光光度计测其吸光值, 计算米糠多糖含量。 1.3.4.2热水蒸煮浸提法 脱脂米糠与pH=5的盐酸水溶液以料液比为1: 10混合置于110oC水浴锅中, 使其保持沸腾状态2小时, 期间不断搅拌, 定时补入损失的水分, 冷却, 离心得上层液, 重复提取两次, 合并上层液。下续步骤同1.3.4.1。 1.3.4.3 超声波浸提法 脱脂米糠与pH=5的盐酸水溶液以料液比为1: 10混合, 在
15、80oC条件下超声提取30min, 冷却, 离心得上层液, 重复提取两次, 合并上层液。下续步骤同1.3.4.1。 1.3.5比较结果 上述方法均是参考了有关文献报道, 采用的提取率相对较高的实验条件。经过722型分光光计对两种糖含量的测定, 见图2。可见, 微波法不但在提取时间而且在糖的浸出率方面更具有优势。因此实验采用微波浸提法, 并对提取时间, 提取火力进行了研究。 图 2 3种提取方法所得米糠多糖含量 1.3.5 微波浸提工艺 1.3.5.1 微波提取 脱脂米糠与pH=5的盐酸水溶液以料液比为1: 8混
16、合, 分别在50％微波火力条件下浸提30min( Ⅰ) , 50min( Ⅱ) ; 100％微波火力条件下浸提30min( Ⅲ) 、 50min( Ⅳ) 。冷却, 离心。各重复两次提取, 合并上层液。 1.3.5.2 两步消化法去除淀粉 在上层液中加入0.5％的耐高温α-淀粉酶于70oC的水浴锅中保温消化2小时后, 再加入0.25％的0.5％的耐高温α-淀粉酶, 在相同的条件下保温消化15小时, 离心得上清液。 1.3.5.3 三氯乙酸去除蛋白质 用30％的三氯乙酸调节上述得到的上清液的pH值＝4.5( 即米糠蛋白等电点, pI) , 置于4oC冰箱中静置过夜, 使得米糠蛋白
17、得以充分沉淀。离心得上清液。 1.3.5.4乙醇沉淀米糠多糖 在上述得到的上清液中, 加入无水乙醇, 使其含量为30％( V/V) , 置于4oC冰箱中静置过夜, 离心, 得到米糠粗多糖RBPa。 1.3.5.5 不同提取条件下米糠多糖含量比较 图 3 微波提取4种条件所得米糠多糖含量 由图 3得知, 微波提取条件Ⅰ＞Ⅱ＞Ⅲ＞Ⅳ, 可见微波火力增大会对多糖造成一定的破坏; 提取时间过长也存在同样的情况。 当微波辐射时间一定时, 微波火力越高, 物系吸收微波能越多, 物系温度升的越快, 固液传质速度亦越快; 且温度越高, 对物料
18、细胞破坏作用越大, 有利于物料有效成分浸出。但当微波火力增加到一定程度时, 微波有可能促使米糠多糖分解, 反而使米糠多糖提取率下降。 1.3.5.6 真空冷冻干燥 将微波方法Ⅰ所得的米糠多糖RBPa透析48小时后, 冷冻干燥得到RBPa的固体粉末。 2讨论 因此, 脱脂米糠与pH=5的盐酸水溶液以料液比为1: 8混合, 三氯乙酸法去除蛋白, 两步法去除淀粉, 在50％微波火力条件下浸提30min( Ⅰ) 为最佳米糠多糖提取方法。米糠得率为1.41％。 RBPa为淡黄色絮状固体, 无味。苯酚－硫酸试剂反应均呈棕红色, 与碘反应不显蓝色; 易溶于水, 不溶于乙醇、 乙醚和丙酮, 无甜味,
19、 无挥发性, 水溶液为浅黄色。 二、 高效液相色谱法测定米糠中的水溶性维生素 1 实验部分 1.1 仪器、 试剂与样品 仪器: Waters505高效液相色谱仪( 包括2487紫外检测器) , Empower色谱工作站。色谱柱: Hypersil C18( 250 cm×4.6mm i.d., 5.0μm) 。超声波振荡器( BRANSON SB 3200－T, 上海) ; 固相萃取柱( 固相PT-系列, 河北省津杨滤材厂) 等。 试剂: VB6( 纯度≥ 99％) 、 烟酰胺( 纯度≥ 99％) 、 烟酸( 纯度≥99.5％) 、 VB1( 纯度≥98％) 。均购自国药集团化
20、学试剂有限公司( 上海) ; 甲醇为色谱纯, 水为超纯水, 其它试剂为分析纯。 米糠样品来源于无锡秦良商贸有限公司。 1.2 色谱条件 色谱柱: Hypersil C18 柱( 250 cm×4.6mm i.d., 5.0μm) , 流动相: A: 0.1 %磷酸水溶液, B:甲醇, 以体积比 A:B=88:12等度洗脱; 流速为0.6 mL/min。检测波长: 266nm; 进样量 20 μL。 1.3试液的制备 1.3.1标准溶液的制备 精确称取约0.05g的四种维生素标准品, 用0.01mol/L盐酸溶解并稀释到50 mL, 摇匀, 分别得到1.36×10-3 g/mL, 1
21、18×10-3 g/mL, 1.04×10-3g/mL和1.00 ×10-3.g/mL的 VB1, VB6, 烟酸和烟酰胺的标准储备液, 于4℃冰箱中保存。储备液用流动相稀释得所需浓度的标准溶液。 1.3.2 米糠供试品溶液的制备 取10.00g米糠于100mL锥形瓶中, 加入20mL混合溶剂( 体积比为80:20的甲醇－0.01mol/L盐酸溶液) 超声提取30min, 过滤, 滤渣用相同的条件重复提取两次, 合并提取液。用旋转蒸发仪蒸发浓缩, 浓缩液用无水乙醚萃取两次脱脂, 水相经0.45μm滤膜过滤, 再过固相萃取柱, 定容至10mL容量瓶中, 即得米糠供试品溶液。 2结果与讨论
22、 在上述色谱条件下, 四种维生素在8min内达到基线分离, 得到4种维生素的标样图, 见图1 t/min 图1 水溶性维生素混合标准溶液色谱图 峰标: 1.VB1; 2.烟酰胺; 3.烟酸; 4.VB6 2.3方法学评价 2.3.1 重现性试验 取4种维生素的标准储备液等体积混和, 然后稀释16倍, 在上述优化实验条件下连续5次进样, 测得其峰面积及保留时间的相对标准偏差( RSD) 均小于2％, 结果表明其重现性较好。如表1所示 表1 重现性试验 组分 RSD( %) (n=5) 保留时间 峰面积 VB1 0.
23、04 0.70 烟酸 0.05 0.50 VB6 0.12 2.0 烟酰胺 0.04 0.79 2.3.2标准曲线及检出限 配置了一系列不同浓度的 VB1、 VB6、 烟酸和烟酰胺的混合标准溶液, 在优化的实验条件下, 进行了测定, 得出各组分的线性回归方程、 线性范围, 并以3倍信噪比得到检测限, 结果如表2所示。结果显示线性范围宽, 检测限低。 表2 回归方程及检测限 组分 线性范围/( g/mL) 回归方程 R2 检测限/ (g/mL) VB1 8.5×10-7–8.5×10-5 Y=5.84×107X+28.42 0.9999 4.
24、3×10-7 烟酸 9.3×10-7–6.5×10-5 Y=4.91×107X+7.07 0.9999 3.2×10-7 VB6 1.0×10-6–7.4×10-5 Y=1.45×107X+65.27 0.9999 3.4×10-7 烟酰胺 6.0×10-7–6.2×10-5 Y=6.06×107X–5.91 0.9999 3.0×10-7 2.4 样品的测定及回收率实验 按1.3.2和1.3.3方法处理好样品, 在优化好的色谱条件下, 进行测定。米糠样品的色谱图见图2; 米糠中维生素测定结果见表3。 t/min 图2 米糠样品的色谱图 表3
25、米糠中维生素的测定结果 (n=3) 样品 组分 含量 RSD( ％) 米糠 VB1 7.7×10-6 g/g 1.6 烟酸 14.9×10-6 g/g 2.1 VB6 1.3×10-6 g/g 1.2 烟酰胺 16.2×10-6 g/g 0.7 取米糠供试液做加标回收试验。结果见表4。回收率在96.0％～99.9％, 结果可靠。 表4 4种水溶性维生素的回收率测定结果 ( n=3) 维生素 试液浓度(g/mL) 加标准试液(g/mL) 测定含量(g/ml) 平均回收率/(%) RSD/(%) VB1 7.6×10-6
26、 8.5×10-6 15.76×10-6 96.0 0. 5 VB5 14.8×10-6 6.5×10-6 21.07×10-6 96.4 1.6 VB6 1.3×10-6 7.4×10-6 8.69×10-6 99.9 4.9 烟酰胺 16.4×10-6 6.3×10-6 22.8×10-6 98.0 3.0 三、 结论 由此可见, 采用50％微波火力提取30min, 米糠多糖得率可达1.41％; 采用体积比为80:20的甲醇－0.01mol/L盐酸溶液超声提取30min, 经过高效液相色谱法对4种水溶性维生素含量进行了测定, 表明米糠中含有丰富的VB1、 、 烟酸、 烟酰胺、 VB6。本文的测定结果为开发绿色米糠化妆品提供了一定的依据。 参考文献 [1]毛金水,贺绪军,李翔,等.米糠营养素提取的研究与生产应用[J].副产物综合利用, ,34(6):45～47 [2]刘元法,王兴国,倪伯文,等.米糠活性物质二十八醇功能性研究[J].中国油脂, ,26(5):63～65
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