米糠多糖的提取研究及米糠中水溶性维生素的测定样本.doc

资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。 米糠多糖的提取研究及米糠中水溶性维生素的测定 ( 江南大学化学与材料工程学院, 江苏无锡214122) 摘要: 微波浸提法研究了米糠多糖的提取, HPLC法同时测定了米糠中4种水溶性维生素。料液比为1: 8在50微波火力条件下浸提30min, 三氯乙酸去蛋白, 两步去淀粉, 30醇沉, 米糠多糖得率达1.41%。以体积比为88:12的0.1磷酸水溶液-甲醇为流动相, 以0.6 mL/min流速等度洗脱, 在266nm波长下检测。各组分在8min能基线分离。米糠中VB1、 VB6、 烟酸和烟酰胺的含量分别为7.710-6 g/g、 1.310-6g/g、 14.910-6 g/g、 16.210-6 g/g。关键词: 米糠; 多糖; 微波浸提; 水溶性维生素; 高效液相色谱Study on Microwave Assistant Extraction of Rice Bran Polysaccharides and Determination of Water-Soluble Vitamins in Rice BranAbstract: Microwave assistant extraction has been applied for polysaccharides in rice bran samples. The best technology were that the material-water ratio was 1:8, the time of microwave assistant extraction was 30 min under 50% firepower. It was proved that -amylase could wipe off amylum effectively by two steps, and trichloroacetic acid method was the best way to wipe off albuminoid. And the ethanol concentration was 30%, the extraction rate of the water-soluble polysaccharides of rice bran was 1.41%.High performance liquid chromatography (HPLC) has been applied for the simultaneous determination of four kinds of water-soluble vitamins including vitamin B1, vitamin B6, nicotinic acid, and nicotinamide in rice bran. The separation was performed on a Hypersil C18 column (250 cm4.6mm i.d., 5.0 m) with a mobile phase of 0.1% H3PO4- methanol (88:12, V/V) at flow rate of 0.6 mL /min, and detection wavelength was 266 nm. Baseline separation of four vitamins can be achieved within 8 minutes.The content of 7.710-6 g/g、 1.310-6g/g、 14.910-6 g/g、 16.210-6 g/g for vitamin B1, nicotinic acid ,vitamin B6 and nicotinamide.Key words: rice bran; polysaccharides; microwave assistant extraction; water-soluble vitamins; high performance liquid chromatography米糠是一类具有广泛开发潜力的高附加值资源, 含有稻米的64营养物质及90人体所需要的各种营养元素1, 包括维生素、 米糠多糖、 氨基酸、 脂肪酸、 矿物质, 还有二十八碳烷醇、 神经酰胺等生理功能卓越的活性物质2。米糠多糖( Rice Brain polysaccharide, RBP) 存在于稻谷的颖果皮层里, 主要是指分子量不等的一类非淀粉多糖。采用不同的提取工艺会得到不同的米糠多糖组分。米糠多糖具有广泛的生理活性, 在抗肿瘤, 增强免疫力, 降血糖, 降脂方面有显著效果; 水溶性维生素是一类重要的营养成分, 在各种保健品3, 功能型饮料中得到应用。烟酸和烟酰胺能够促进头皮血液循环, 防止脱发; VB6具有美发功效; VB1具有滋养与深层清洁的作用, 因此化妆品中也常添加微量的维生素4。因此, 本实验对这两种活性成分进行了研究。多糖提取的方法有微波浸提法, 热水蒸煮法, 超声波提取法等。实验中考察了米糠多糖的提取方法及去除杂质方法。选取较优的微波提取法, 并对其提取工艺参数进行了进一步优化。测定维生素的方法有紫外分光光度法5、 荧光法6和高效液相色谱法( HPLC) 7。但HPLC技术用于米糠中水溶性维生素的测定还未见报道。实验采用HPLC建立了米糠中的水溶性维生素的测定方法, 对样品前处理方法进行了研究, 对测定体系各影响因素进行了优化。方法简便快速, 准确可靠, 对复杂体系中水溶性维生素的测定具有重要的参考价值。一 米糠多糖的提取研究1. 米糠多糖的提取1.1 实验材料米糠: 无锡秦良商贸有限公司耐高温-淀粉酶: 无锡酶制剂厂, 0IU/g试剂: 无水乙醇、 石油醚、 三氯乙酸、 盐酸均为分析纯, 购自国药集团化学试剂有限公司。1.2仪器722型可见光分光光度计; LD4-2A型台式离心机; Panasonic微波炉; 真空冷冻干燥机。1.3实验方法1.3.1 米糠样品的前处理将米糠用石油醚按1: 3比例脱脂1小时, 重复3次, 自然干燥。1.3.2 用改进的硫酸-苯酚法测米糠多糖含量1.3.2.1 显色剂的制备将50 mL浓硫酸缓缓加入10 mL水中, 冷却至室温, 加入0.6 g苯酚晶体搅拌使其溶解配成显色液。1.3.2.2 硫酸-苯酚法测米糠多糖含量取1.00 mL稀释一定倍数的糖液于试管中加入5.00 mL显色液振荡混匀; 取1.00 mL蒸馏水于试管中加入5.00 mL显色液振荡混匀, 得到参比溶液。将标准溶液和参比溶液置于沸水浴中保温3035 min, 取出后放在冷水浴中冷却至室温, 于490 nm波长处测定其吸光值。传统的硫酸-苯酚测糖法的操作过程是: 取1.00 mL样品加1.00 mL水, 加1.00 mL 6 %苯酚摇匀后再加入5 mL浓硫酸, 振荡显色, 静置30 min后, 于490 nm处检测其吸光度。加入硫酸时系统显色温度相差较大, 而造成相应的偶然偏差。而改进后的方法, 由于先把水和硫酸混合, 对浓硫酸起到了稀释作用, 用冰水冷却最后加入苯酚晶体, 配成显色液。经过沸水浴加热来使其显色, 保证了反应系统温度一致, 很好地解决了检测重现性与准确度的问题。1.3.3去除杂质方法的比较在多糖提取的过程中, 蛋白与淀粉的去除会影响到多糖的纯度与得率。因此本实验采用50%微波火力浸提30min, 重复两次提取。考察了Sevage法与三氯乙酸法去蛋白法; 同时也考察了淀粉一步消化法与两步消化法。正交实验见表1。实验结果见图 1。Sevage法三氯乙酸法一步消化法两步消化法30%醇沉 由此能够看出: 淀粉一步消化所得多糖略高于两步消化所得, 可能是由于在较短的时间内淀粉未去尽, 而淀粉本身就是一种多糖物质, 为了得到较纯的米糠多糖, 实验优先考虑采用两步消化法; 在去蛋白的方法中, 比较、 得知, 采用Sevage法与三氯乙酸法所得米糠多糖含量差别不大, 考虑到Sevage法毒性较大, 耗时较长, 实验优先考虑三氯乙酸法。图 1 正交实验结果1.3.4 米糠多糖提取方法选择1.3.4.1 微波浸提法脱脂米糠与pH=5的盐酸水溶液以料液比为1: 10混合置于50微波火力下浸提30min, 冷却, 离心得上层液, 重复提取两次, 合并上层液。在上层液中加入0.5的耐高温-淀粉酶于70oC的水浴锅中保温消化2小时后, 再加入0.25的0.5的耐高温-淀粉酶, 在相同的条件下保温消化15小时, 离心得上清液。用30的三氯乙酸调节上述得到的上清液的pH4.5( 即米糠蛋白等电点, pI) , 置于4oC冰箱中静置过夜, 使得米糠蛋白得以充分沉淀。离心得上清液。在上述得到的上清液中, 加入无水乙醇, 使其含量为30( V/V) , 置于4oC冰箱中静置过夜, 离心, 得到米糠粗多糖RBPa溶液。用722型分光光度计测其吸光值, 计算米糠多糖含量。1.3.4.2热水蒸煮浸提法脱脂米糠与pH=5的盐酸水溶液以料液比为1: 10混合置于110oC水浴锅中, 使其保持沸腾状态2小时, 期间不断搅拌, 定时补入损失的水分, 冷却, 离心得上层液, 重复提取两次, 合并上层液。下续步骤同1.3.4.1。1.3.4.3 超声波浸提法 脱脂米糠与pH=5的盐酸水溶液以料液比为1: 10混合, 在80oC条件下超声提取30min, 冷却, 离心得上层液, 重复提取两次, 合并上层液。下续步骤同1.3.4.1。1.3.5比较结果 上述方法均是参考了有关文献报道, 采用的提取率相对较高的实验条件。经过722型分光光计对两种糖含量的测定, 见图2。可见, 微波法不但在提取时间而且在糖的浸出率方面更具有优势。因此实验采用微波浸提法, 并对提取时间, 提取火力进行了研究。 图 2 3种提取方法所得米糠多糖含量1.3.5 微波浸提工艺1.3.5.1 微波提取 脱脂米糠与pH=5的盐酸水溶液以料液比为1: 8混合, 分别在50微波火力条件下浸提30min( ) , 50min( ) ; 100微波火力条件下浸提30min( ) 、 50min( ) 。冷却, 离心。各重复两次提取, 合并上层液。1.3.5.2 两步消化法去除淀粉 在上层液中加入0.5的耐高温-淀粉酶于70oC的水浴锅中保温消化2小时后, 再加入0.25的0.5的耐高温-淀粉酶, 在相同的条件下保温消化15小时, 离心得上清液。1.3.5.3 三氯乙酸去除蛋白质 用30的三氯乙酸调节上述得到的上清液的pH值4.5( 即米糠蛋白等电点, pI) , 置于4oC冰箱中静置过夜, 使得米糠蛋白得以充分沉淀。离心得上清液。1.3.5.4乙醇沉淀米糠多糖在上述得到的上清液中, 加入无水乙醇, 使其含量为30( V/V) , 置于4oC冰箱中静置过夜, 离心, 得到米糠粗多糖RBPa。1.3.5.5 不同提取条件下米糠多糖含量比较 图 3 微波提取4种条件所得米糠多糖含量 由图 3得知, 微波提取条件, 可见微波火力增大会对多糖造成一定的破坏; 提取时间过长也存在同样的情况。当微波辐射时间一定时, 微波火力越高, 物系吸收微波能越多, 物系温度升的越快, 固液传质速度亦越快; 且温度越高, 对物料细胞破坏作用越大, 有利于物料有效成分浸出。但当微波火力增加到一定程度时, 微波有可能促使米糠多糖分解, 反而使米糠多糖提取率下降。1.3.5.6 真空冷冻干燥将微波方法所得的米糠多糖RBPa透析48小时后, 冷冻干燥得到RBPa的固体粉末。2讨论因此, 脱脂米糠与pH=5的盐酸水溶液以料液比为1: 8混合, 三氯乙酸法去除蛋白, 两步法去除淀粉, 在50微波火力条件下浸提30min( ) 为最佳米糠多糖提取方法。米糠得率为1.41。RBPa为淡黄色絮状固体, 无味。苯酚硫酸试剂反应均呈棕红色, 与碘反应不显蓝色; 易溶于水, 不溶于乙醇、 乙醚和丙酮, 无甜味, 无挥发性, 水溶液为浅黄色。二、 高效液相色谱法测定米糠中的水溶性维生素1 实验部分1.1 仪器、 试剂与样品仪器: Waters505高效液相色谱仪( 包括2487紫外检测器) , Empower色谱工作站。色谱柱: Hypersil C18( 250 cm4.6mm i.d., 5.0m) 。超声波振荡器( BRANSON SB 3200T, 上海) ; 固相萃取柱( 固相PT-系列, 河北省津杨滤材厂) 等。试剂: VB6( 纯度 99) 、 烟酰胺( 纯度 99) 、 烟酸( 纯度99.5) 、 VB1( 纯度98) 。均购自国药集团化学试剂有限公司( 上海) ; 甲醇为色谱纯, 水为超纯水, 其它试剂为分析纯。米糠样品来源于无锡秦良商贸有限公司。1.2 色谱条件色谱柱: Hypersil C18 柱( 250 cm4.6mm i.d., 5.0m) , 流动相: A: 0.1 %磷酸水溶液, B:甲醇, 以体积比 A:B=88:12等度洗脱; 流速为0.6 mL/min。检测波长: 266nm; 进样量 20 L。1.3试液的制备1.3.1标准溶液的制备精确称取约0.05g的四种维生素标准品, 用0.01mol/L盐酸溶解并稀释到50 mL, 摇匀, 分别得到1.3610-3 g/mL, 1.1810-3 g/mL, 1.0410-3g/mL和1.00 10-3.g/mL的 VB1, VB6, 烟酸和烟酰胺的标准储备液, 于4冰箱中保存。储备液用流动相稀释得所需浓度的标准溶液。1.3.2 米糠供试品溶液的制备取10.00g米糠于100mL锥形瓶中, 加入20mL混合溶剂( 体积比为80:20的甲醇0.01mol/L盐酸溶液) 超声提取30min, 过滤, 滤渣用相同的条件重复提取两次, 合并提取液。用旋转蒸发仪蒸发浓缩, 浓缩液用无水乙醚萃取两次脱脂, 水相经0.45m滤膜过滤, 再过固相萃取柱, 定容至10mL容量瓶中, 即得米糠供试品溶液。2结果与讨论在上述色谱条件下, 四种维生素在8min内达到基线分离, 得到4种维生素的标样图, 见图1t/min图1 水溶性维生素混合标准溶液色谱图 峰标: 1.VB1; 2.烟酰胺; 3.烟酸; 4.VB62.3方法学评价2.3.1 重现性试验取4种维生素的标准储备液等体积混和, 然后稀释16倍, 在上述优化实验条件下连续5次进样, 测得其峰面积及保留时间的相对标准偏差( RSD) 均小于2, 结果表明其重现性较好。如表1所示表1 重现性试验组分RSD( %) (n=5)保留时间峰面积VB10.040.70烟酸0.050.50VB60.122.0烟酰胺0.040.792.3.2标准曲线及检出限配置了一系列不同浓度的 VB1、 VB6、 烟酸和烟酰胺的混合标准溶液, 在优化的实验条件下, 进行了测定, 得出各组分的线性回归方程、 线性范围, 并以3倍信噪比得到检测限, 结果如表2所示。结果显示线性范围宽, 检测限低。表2 回归方程及检测限组分线性范围/( g/mL) 回归方程R2 检测限/ (g/mL) VB18.510-78.510-5Y=5.84107X+28.420.99994.310-7烟酸9.310-76.510-5Y=4.91107X+7.070.99993.210-7VB61.010-67.410-5Y=1.45107X+65.270.99993.410-7烟酰胺6.010-76.210-5Y=6.06107X5.910.99993.010-72.4 样品的测定及回收率实验按1.3.2和1.3.3方法处理好样品, 在优化好的色谱条件下, 进行测定。米糠样品的色谱图见图2; 米糠中维生素测定结果见表3。t/min图2 米糠样品的色谱图表3 米糠中维生素的测定结果 (n=3)样品组分含量 RSD( ) 米糠VB17.710-6 g/g1.6烟酸14.910-6 g/g2.1VB61.310-6 g/g1.2烟酰胺16.210-6 g/g0.7取米糠供试液做加标回收试验。结果见表4。回收率在96.099.9, 结果可靠。表4 4种水溶性维生素的回收率测定结果 ( n=3) 维生素试液浓度(g/mL)加标准试液(g/mL)测定含量(g/ml)平均回收率/(%)RSD/(%)VB17.610-6 8.510-615.7610-696.00. 5VB514.810-6 6.510-6 21.0710-696.41.6VB61.310-67.410-6 8.6910-699.94.9烟酰胺 16.410-6 6.310-6 22.810-698.03.0三、 结论 由此可见, 采用50微波火力提取30min, 米糠多糖得率可达1.41; 采用体积比为80:20的甲醇0.01mol/L盐酸溶液超声提取30min, 经过高效液相色谱法对4种水溶性维生素含量进行了测定, 表明米糠中含有丰富的VB1、 、 烟酸、 烟酰胺、 VB6。本文的测定结果为开发绿色米糠化妆品提供了一定的依据。 参考文献1毛金水,贺绪军,李翔,等.米糠营养素提取的研究与生产应用J.副产物综合利用, ,34(6):45472刘元法,王兴国,倪伯文,等.米糠活性物质二十八醇功能性研究J.中国油脂, ,26(5):6365