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CD8mAb对呼吸道合胞病毒诱导的哮喘小鼠气道炎症的影响
【摘要】 目的： 观察CD8mAb对呼吸道合胞病毒诱导哮喘小鼠气道炎症的影响. 方法： Balb/c小鼠50只，随机分成5组： 磷酸盐缓冲液对照组；卵白蛋白组；OVA/RSV模型组；CD8mAb治疗组；IgG2αmAb治疗对照组. 应用OVA腹腔注射致敏、OVA气道雾化结合RSV滴鼻激发复制小鼠哮喘模型，观察实验动物气道炎症和气道反应性变化，支气管肺泡灌洗液作细胞分类计数，测定BALF上清中白细胞介素4, IL5, 干扰素γ含量并采用三色光流式细胞分析法检测气管旁淋巴结中CD4+, CD8+T细胞及细胞内细胞因子IFNγ, IL4, IL5表达. 结果： 与模型组相比，CD8mAb可明显减轻小鼠气道炎症和气道高反应. CD8mAb治疗后BALF中嗜酸性粒细胞及上清中细胞因子IFNγ, IL4, IL5含量明显减少，CD8+T细胞百分比及Tc2/Tc1比值明显下降. PBLN中CD8+T细胞百分比与BALF中IFNγ, IL4, IL5含量呈显着正相关(分别rs=, ; rs=, ; rs=, ). 结论： CD8mAb对RSV诱导的哮喘小鼠气道炎症和气道高反应具有抑制作用，其部分机制可能与致敏条件下病毒感染引起CD8+T细胞功能发生转化，即由产生IFNγ为特征的细胞毒CD8+T细胞转化为产生IL4, IL5为特征的非细胞毒CD8+T细胞有关.
【关键词】 呼吸道合胞病毒；哮喘；CD8+T细胞；CD8单克隆抗体；气道炎症
0引言
临床及流行病学研究表明，呼吸道病毒感染是哮喘急性加重、致死的重要原因［1］. Osullivan等［2］在因重度哮喘死亡患者的肺标本中检测到呼吸道合胞病毒,鼻病毒基因组，并发现气管旁有大量CD8+T细胞浸润，且CD8+T细胞表面分子CD25,穿孔素表达增高，提示重度哮喘患者气道局部存在CD8+T细胞数量和功能的异常. Schwarze等［3］的研究表明，病毒诱导的哮喘与过敏性哮喘在气道炎症的发生机制上有所不同，前者的Th2型炎症主要由CD8+T细胞产生和维持，而后者主要由CD4+T细胞产生和维持. 上述研究提示，CD8+T细胞在呼吸道病毒诱导的哮喘发作及急性加重中起重要作用. 因此，我们采用RSV诱导的小鼠哮喘模型，观察CD8mAb对哮喘气道炎症和气道反应性的影响.
1材料和方法
材料
动物、试剂和仪器清洁级雌性Balb/c小鼠50只，6~8周龄，体质量17~20 g. 乙酰胆碱,卵白蛋白; IFNγ, IL4, IL5酶联免疫吸附试验试剂Kit; 大鼠抗小鼠CD8a(Ly2) mAb，大鼠抗小鼠IgG2αmAb对照抗体;流式细胞检测试剂盒包括：刺激剂卟啉醇肉豆蔻酸乙酸酯,离子霉素, 阻断剂(brefeldinA,BFA)，大鼠抗小鼠PECy5标记CD3， FITC标记CD8，PE标记IFNγ, IL4, IL5 mAb及大鼠IgG1阴性对照(Caltag);动物肺功能体描箱，呼吸机(北京鑫奥成科技有限公司提供)；软件分析系统，酶标仪，真空冻干机，FACScalibur流式细胞仪.
细胞和病毒RSV Long株A型;人喉癌上皮细胞. HEp2细胞在含100 mL/L灭活胎牛血清的DMEM中37℃, 50 mL/L CO2条件下培养，细胞长满单层后，RSV接种HEp2细胞，继续在含20 mL/L灭活胎牛血清的DMEM的维持液中培养，待细胞病变达100%时收获病毒，并冻存于-80℃冰箱中，反复冻融、离心后，留上清备用. 参照文献［4］的方法采用空斑形成试验测定病毒滴度，取滴度为×106空斑形成单位RSV备用.
方法
实验分组和动物模型 Balb/c小鼠50只随机分成5组，每组10只，分别为磷酸盐缓冲液对照组；卵白蛋白(OVA)组；OVA/RSV模型组；CD8mAb治疗组；IgG2αmAb治疗对照组. 动物分别于第1，14日腹腔注射致敏液 mL，第15日起将小鼠置于透明密闭容器中以10 g/L OVA溶液10 mL雾化吸入，每次20 min，隔日1次，连续5 wk，并分别于第21, 35, 49日用滴度为×106 PFu/mL的RSV 50 μL鼻腔滴入，每日观察小鼠症状，于最后1次RSV滴入4 d后测气道反应性. CD8mAb治疗组和IgG2αmAb治疗对照组分别于RSV应用6 h后按1 mg/kg ip CD8mAb和IgG2αmAb对照抗体.
气道反应性测定小鼠经腹腔麻醉、气管切开后，置密闭体描箱中，吸气管、呼气管、测压管按指示连接，小鼠按频率90次/min、潮气量5~6 mL/kg机械通气，调节呼气末压为-8 cmH2O，记录经肺压、流速、潮气容积变化. 气道反应性用ACH激发后以肺阻力(RL)表示，将ACH分别按浓度、容积为35 μL/次尾静脉注射激发，经肺压和潮气容积曲线回到基线后，将浓度增加3倍，每次应用ACH后记录至少10次峰反应的肺变量.
肺泡灌洗液（
　　BALF）细胞分类计数以 mL PBS进行肺泡灌洗，反复2次，1200 r/min离心5 min，上清保存在-20℃冰箱中待测定细胞因子. 沉淀细胞用 mLHanks液重悬，取 mL进行细胞计数，其余沉淀细胞经涂片，瑞氏吉姆莎染色，按细胞形态进行分类计数(至少计数200个细胞).
细胞因子测定将BALF上清放入真空冻干机内-70℃冻干后，加入200 μL生理盐水重融，按ELISA试剂说明书检测其中IFNγ, IL14, IL5含量.
三色光流式细胞分析取气管旁淋巴结(PBLN)3~4枚，眼科剪仔细剪碎，经300目尼龙膜过筛获单细胞悬液，1200 r/min离心5 min, 将沉淀细胞置于RPMI1640培养液中，调整细胞密度为×105/L，按参考文献［5］的方法进行流式细胞检测.
肺组织病理学变化取右肺中叶进行乙醇脱水，石蜡包埋连续切片，常规苏木素伊红染色观察大体组织病变和炎症细胞浸润情况.

统计学处理： 实验数据以x±s表示，用统计软件进行分析，气道反应性变化采用析因设计方差分析，其余指标组间比较采用单因素方差分析，相关性采用Spearman等级相关分析，以为差异有统计学意义.
2结果
2．1气道反应性变化当ACH分别按5， 15 和45 g/L浓度激发时，OVA组RL分别为，(±)和(±）cmH2o/(mL・s);与OVA/RSV模型组，(±)和(±）cmH2o/(mL・s)比较，两组差异具有统计学意义;与OVA/RSV模型组比较，应用CD8mAb后，(±) 和(±）cmH2o/(mL・s)，气道反应性明显下降.　vs OVA 组；　vs OVA/RSV模型组. OVA：卵白蛋白； RSV： 呼吸道合胞病毒； ACH: 乙酰胆碱.图1各组动物气道反应性变化细胞分类计数及上清细胞因子表达与OVA组比较，OVA/RSV模型组嗜酸性粒细胞及细胞因子IFNγ, IL4, IL5明显升高. 应用CD8mAb后嗜酸性粒细胞及细胞因子IFNγ, IL4, IL5明显下降. 表1各组BLAF中细胞分类计数
中CD4+, CD8+T细胞及胞内细胞因子表达与OVA组比较，OVA/RSV模型组CD8+T细胞百分比及Tc2/Tc1比值明显升高. 应用CD8mAb后CD8+T细胞百分比、Tc2/Tc1比值下降.表2各组PBLN中CD4+, CD8+T细胞及胞内细胞因子表达变化
肺组织病理学变化OVA/RSV模型组气道上皮增厚、破坏，管腔狭窄，有支气管收缩征象，管壁周围大量炎症细胞浸润. CD8mAb治疗后气道上皮增厚，管腔狭窄，管壁周围炎症细胞浸润较模型组减轻. 治疗对照组与模型组比较无明显变化. OVA组气道上皮增厚，管壁周围炎症细胞浸润程度亦较模型组减轻. PBS组未见明显病理变化.
相关性分析经Spearman 等级相关分析, PBLN中CD8+T细胞百分比与BALF中IFNγ, IL4, IL5细胞因子含量呈显着正相关(分别rs=, ; rs=, ; rs=, ).
3讨论
本研究观察到，与OVA组比较，OVA/RSV模型组小鼠气道炎症、肺阻力明显增加，提示OVA致敏后RSV感染可显着加重哮喘，这与大部分的研究结果相同［6］. 采用流式细胞分析进一步检测PBLN中CD4+,CD8+T细胞百分比发现，OVA/RSV模型组CD8+T细胞百分比及Tc2/Tc1比值较OVA组明显升高，且CD8+T细胞百分比与BALF中IFNγ, IL4, IL5细胞因子含量呈显着正相关，提示与OVA致敏性哮喘不同，OVA致敏条件下RSV感染后BALF中IFNγ, IL4, IL5细胞因子主要来源于CD8＋T细胞，即CD8＋T细胞，尤其Tc2在呼吸道病毒诱导的哮喘加重中起重要作用. 新近研究表明［7］，外源性IL4能体外诱导CD8＋T细胞分泌Th2型细胞因子如IL5, IL13，提示在哮喘患者IL4表达占优势的环境中，病毒感染可刺激CD8＋T细胞合成Th2型细胞因子，这可能是呼吸道病毒加重哮喘的原因.
应用CD8mAb后，OVA/RSV模型组小鼠气道反应性明显下降，BALF中IL4, IL5, IFNγ含量及嗜酸性粒细胞均显着下降，气道周围炎症细胞浸润亦明显减轻，提示CD8mAb可显着抑制RSV感染相关哮喘的气道炎症和AHR. 这可能与致敏条件下在Th2型细胞因子环境中，RSV感染引起细胞毒CD8+T细胞转化为产生IL5的非细胞毒T细胞，CD8mAb对其的抑制可使Th2型细胞因子和嗜酸性粒细胞气道分泌、趋化减少有关. 当然，CD8+T细胞对气道上皮产生直接破坏以及CD8+T细胞介导嗜酸性粒细胞脱颗粒，其中释放的主要碱性蛋白(MBP)能结合气道平滑肌M2受体导致M2受体功能下降，促进AHR［8］，CD8mAb对其的抑制效应可在保护气道上皮、减轻气道炎症和AHR中起一定作用.
综上所述，OVA致敏条件下RSV感染可明显增加气道炎症和气道反应性，其中CD8+T细胞表型的转化加重Th2型气道炎症并导致大量嗜酸性粒细胞气道募集可能起重要作用. 由于临床上病毒诱发的哮喘十分频繁，且与哮喘的急性加重密切相关，针对CD8+T细胞的单克隆抗体治疗有可能在减少哮喘的急性发作，减轻哮喘病情、降低死亡率探索一条新途径.
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