NK细胞对人鼻咽癌细胞CNE2裸鼠皮下移植瘤的抑制作用.docx

NK细胞对人鼻咽癌细胞CNE2裸鼠皮下移植瘤的抑制作用
【摘要】 目的 研究同种异体NK细胞对人鼻咽癌细胞裸鼠皮下移植瘤的抑制作用。方法 PCRSSP法检测CNE2细胞HLAA、B、Cw表型、NK细胞KIR表型，磁珠分离法分离NK细胞并进行体外培养扩增，LDH释放法测定NK细胞对CNE2细胞的体外杀伤活性。12只BALB/c裸鼠分为两组，每组6只，对照组裸鼠每只皮下接种1×106CNE2细胞，治疗组裸鼠每只皮下接种1×106CNE2细胞，同时每只经尾静脉注入3×107NK细胞，观察两组裸鼠成瘤时间、成瘤率、肿瘤体积变化、计算抑瘤率。结果 CNE2细胞表面HLAA、B、Cw 表型为A2,24；B18,35；Cw4,7，3例健康者均表达KIR2DL1、KIR2DL3、KIR3DL1、KIR3DL2。效靶比5∶1、10∶1、20∶1、30∶1时，NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性分别为(±)%、(±)%、(±)% and (±)%。对照组和NK细胞治疗组肿瘤出现时间分别为(±)d、(±)d，(Ｐ),成瘤率分别为100％、%，对照组和NK细胞治疗组裸鼠的瘤重分别为(±)g、(±)g，(Ｐ)，NK治疗组的抑瘤率为%。肿瘤组织石蜡切片病理学鉴定为低分化鳞状上皮细胞癌，NK细胞治疗组可见角化肿瘤细胞，较多的淋巴细胞浸润和大量细胞坏死区。结论 NK细胞对鼻咽癌裸鼠皮下移植瘤有明显的抑制作用，有希望成为治疗鼻咽癌的新方法。
【关键词】 鼻咽癌；自然杀伤细胞；裸鼠；移植瘤；杀伤细胞免疫球蛋白样受体；细胞治疗
鼻咽癌是我国南方常见的恶性肿瘤，早期患者采用放射治疗常能取得较好的治疗效果，晚期患者放射治疗联合化学治疗虽能提高局部控制率，但未能提高总体生存率[1]。异基因骨髓移植中供受者之间杀伤细胞免疫球蛋白样受体配体错配(KIR配体错配)引发的同种异体反应性NK细胞活性可以防止白血病细胞复发，使NK细胞的抗肿瘤治疗作用日益得到医学研究者的重视。此前我们的体外实验表明同种异体NK细胞对CNE2细胞具有较强的杀伤活性。本研究以同种异体NK细胞为效应细胞，观察其对人鼻咽癌细胞裸鼠皮下移植瘤生长的影响，为鼻咽癌的治疗探索一种新的方法。
1 材料和方法
　材料
分离NK细胞用的缓冲液(磷酸盐缓冲液，，加入%BSA，2mmol/lEDTA，Miltenyi Biotec公司产品)，CD56 MicroBeads (Miltenyi Biotec公司产品)，RPMI 1640(Gibco公司产品)，淋巴细胞分离液(上海试剂二厂产品)，rhIL2、PHA (Sigma公司产品)，人鼻咽癌细胞株CNE2购于军事医学科学院。
　方法
　NK细胞的分离纯化 采用常规密度梯度离心法分离3例健康人外周血单个核细胞，PBS洗涤2次，计数细胞，CD56 MicroBeads作MACS细胞阳性分选，获得CD3－CD56+细胞即为NK细胞。
　细胞培养 细胞培养基为含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI 1640。培养NK细胞时加入1 000U/ml rhIL2，PHA 10μg/ml。
　CNE2细胞表面HLAA、B、Cw基因分型 采用PCRSSP法，按PCRSSPA、B、Cw特异性引物试剂盒说明操作。
　KIR基因分型 采用PCRSSP法，按KIR基因分型试剂盒说明操作。
　动物实验
　裸鼠 选取体重15～20g的4～6周BALB/c裸鼠12只，分2组，每组6只，雌雄各半，在第一军医大学SPF动物实验中心饲养。
　裸鼠接种 对数生长期的CNE2细胞经胰酶消化、离心收集、计数后重悬于无血清RPMI 1640培养基中，配制成每含1×106个肿瘤细胞的悬液，用1ml注射器将细胞悬液注射于BALB/c裸鼠背部皮下，NK细胞治疗组，NK细胞悬于无血清RPMI1640培养基中计数，配制成每含3×107个细胞的悬液，用1ml注射器将细胞悬液经尾静脉注射于BALB/c裸鼠体内(每例健康者的NK细胞分别注射2只BALB/c裸鼠)，尾静脉注射NK细胞与皮下注射CNE2细胞同一天进行。
　肿瘤生长情况监测及肿瘤的病理变化观察 自细胞注射之日起，观察两组裸鼠成瘤时间、成瘤率，待肿瘤出现后用游标卡尺测量肿瘤块2个方向的直径,分别记为ａ、ｂ，肿瘤体积计算公式：V=1/2ab2。肿瘤出现后3周处死裸鼠，测肿瘤重量,计算肿瘤生长抑制率：肿瘤生长抑制率＝(1-处理组肿瘤重量/ 对照组肿瘤重量)×100％ 。肿瘤标本称重后,常规福尔马林固定,石蜡包埋,5μm连续切片,分别行HE染色，观察病理变化。
　统计学方法
应用软件进行数据处理，数据以±s表示，采用独立样本t检验。
　　2 结果
　NK细胞的纯度 流式细胞仪检测CD3－CD16+CD56+细胞的纯度为(±)%。
　CNE2细胞表面HLAA、B、Cw基因分型结果 CNE2细胞表面HLAA、B、Cw表型为A2, 24；B18,35；Cw4, 7。

　KIR基因分型 3例健康人均表达KIR2DL1、KIR2DL3、KIR3DL1、KIR3DL2。
　NK细胞对CNE2细胞的体外杀伤活性 效靶比5∶1、10∶1、20∶1、30∶1时，NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性分虽为%。
　肿瘤的生长情况 单纯接种CNE2细胞组和CNE2+NK细胞治疗组，肿瘤出现时间分别为(±)d、(±)d，(Ｐ)，NK细胞治疗组成瘤时间较CNE2细胞组明显延长。
　NK 细胞抑制CNE2移植瘤的生长 实验结果表明NK细胞能有效抑制肿瘤细胞生长， 生长曲线显示NK细胞能明显减缓CNE2细胞BALB/c裸鼠体内移植肿瘤的生长速度，见图1。
图1 NK细胞对CNE2移植肿瘤生长的影响
　各组裸鼠瘤重、抑瘤率 CNE2细胞组和CNE2+NK治疗组裸鼠的肿瘤重量分别为(±)g、(±)g ，(Ｐ)。NK细胞治疗组肿瘤抑制率为％。
　肿瘤组织病理改变 成瘤组织经HE病理切片鉴定为低分化鳞状上皮细胞癌，细胞呈多边形，细胞核卵圆形或不规则形，核仁较明显，核分离相多见。NK细胞治疗组可见角化肿瘤细胞，较多的炎性细胞浸润和大量细胞坏死区，见图2。
3 讨 论
NK细胞是机体内重要的淋巴细胞亚群, 在肿瘤免疫中NK细胞构成了第一道杀伤防线。NK细胞表面的抑制性杀伤细胞免疫球蛋白样受体(iKIR）与靶细胞表面特定的HLA I 类分子结合抑制NK细胞的活性，靶细胞缺乏iKIR特定的配体(KIR配体错配)将激发NK细胞对靶细胞的杀伤活性。不同的iKIR分子识别并结合不同的HLA I 类分子。KIR2DL1识别HLACw2、Cw4、Cw5、Cw6；KIR2DL2/2DL3识别HLACw1、Cw3、Cw7、Cw8；KIR3DL1识别HLABw4；KIR3DL2识别HLAA3，A11；其余的KIR配体尚未明确。KIR2DL1、KIR2DL2/2DL3、KIR3DL1、KIR3DL2是目前已知的影响NK细胞同种异体反应性的主要抑制性受体。
本研究表明CNE2细胞表面HLAA、B、Cw表型为A2，24、B18，35、Cw4，7，不表达Bw4、A3、A11分子，因此3例健康个体体内表达KIR3DL1、KIR3DL2的NK细胞与CNE2细胞之间存在KIR配体错配现象。KIR3DL2为NK细胞的框架基因，任意个体的NK细胞均表达KIR3DL2，因此任意个体的NK细胞均与CNE2细胞之间存在着KIR配体错配现象。
NKG2D是介导NK细胞杀伤活性的主要活化性受体，表达在所有NK细胞上，靶细胞表面的MICA/MICB分子是NKG2D的主要活化性配体，MICA/ MICB与受体NKG2D结合后可以激活NK细胞对表达MICA/MICB分子的肿瘤细胞的杀伤。
我们的研究表明，CNE2细胞表面表达NK细胞活化性受体NK2D的配体MICA/MICB等，结合KIR检测结果表明，任意个体的NK细胞均存在杀伤CNE2细胞的分子基础，体外杀伤实验显示NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性在效靶比30∶1时为(±)%。
本研究中动物实验表明, NK细胞治疗组成瘤时间较CNE2细胞组明显延长，治疗组肿瘤体积较对照组明显减小，NK细胞治疗组肿瘤抑制率为％，成瘤组织病理学证实两组均为低分化鳞状上皮细胞癌，NK细胞治疗组较对照组可见角化肿瘤细胞,有明显的淋巴细胞浸润和肿瘤坏死区，表明NK细胞能有效抑制CNE2移植瘤的生长。
本研究提示NK细胞能有效抑制CNE2裸鼠移植瘤的生长,为鼻咽癌的治疗提供了另一种方法，但尚需大规模的体内实验，为临床应用提供充分的依据。
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