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16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程

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2020年4月19日
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16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程
1. 适用范围
本标准规定了经过特定引物对细菌的16SrDNA片段进行PCR扩增，然后对扩增片段进行序列分析比对，快速获得细菌种属信息的操作规程。
本标准适用于未知细菌的快速种属分析，以及为细菌的生化鉴定提供指导信息。
2. 方法和原理
16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。是一种快速获得细菌种属信息的方法。
细菌rRNA（核糖体RNA）按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA。16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列。16S rDNA由于大小适中，约1.5Kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。
在 16S rRNA 分子中，可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，因此可利用恒定区序列设计引物，将16S rDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。
16SrDNA序列的前500bp序列变化较大，包含有丰富的细菌种属的特异性信息，因此对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前500bp序列即可鉴别出细菌的菌属。针对科学论文发表或是前500bp无法鉴别的情况，需要进行16SrDNA的全序列扩增和测序，得到较为全面的16SrDNA的序列信息。
由于测序仪一次反应最多只能测出700bp的有效序列，为了结果的可靠性，一般将16SrDNA全长序列分成3部分进行测序。
16SrDNA

27F

519R

357F

1115R

926F

1492R

3对引物正反向测通后，拼接成1500bp左右的16SrDNA序列。
3. 设备和材料
1
2
3
3.1 器材
移液器（1000μL、200μL 、100μL、10μL）；涡旋振荡器；Eppendorf MixMate；离心机；水浴锅；电泳仪；制冰机；低温冰箱；PCR仪：Veriti 96 Well Thermal Cycler； 凝胶成像仪：VersaDoc MP 4000；基因分析仪：AB3500、AB3130
3.2 试剂
DNA快速提取试剂：PrepMan Ultra；琼脂糖；PCR试剂：Taq酶，10×Taq Buffer(Mg2+)，dNTPs，ddH2O等； ExoSAP-IT；测序试剂：BigDye Terminator，5×Sequencing Buffer；BigDye XTerminator Purification Kit；
3.3 耗材
移液器吸头：1000μL、200μL、10μL；离心管：1.5mL、200μL；Micro AmpTM Optical 96-Well Reaction Plate；Micro AmpTM Optical Adhesive Film；
3.4 引物
16SrDNA
名称
序列
扩增长度
第1部分
正向引物27F
5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'
500 bp左右
反向引物519R
5'- GWA TTA CCG CGG CKG CTG -3'
第2部分
正向引物357F
5'- CTC CTA CGG GAG GCA GCA G-3'
750bp左右
反向引物1115R
5'-AGG GTT GCG CTC GTT GC-3'
第3部分
正向引物926F
5'- AAA CTY AAA KGA ATT GAC GG-3'
560 bp左右
反向引物1492R
5'-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3'
其中M=C:A, Y=C:T. K=G:T, R=A:G, S=G:C. W=A:T; all 1:1
序列比对
测序反应
产物纯化
基因扩增
核酸提取
4. 操作流程

5. 实验方法
4
5
5.1 核酸提取：
挑取单菌落，然后置于装有100μLPrepMan Ultra的离心管中，涡旋震荡混匀30s左右，然后100℃水浴10min后，以离心机最大转速离心3min，取10μL上清液与490μL ddH2O（即稀释50倍），混匀作为下步PCR的模板DNA。提取的DNA于-20℃保存。
5.2 基因扩增
5.2.1 PCR反应体系
试剂
使用量（25μL体系）
模板DNA
2μL（10ng~100ng）
Taq酶(5U/μL)
0.2μL
10×Taq Buffer(Mg2+)
2.5μL
dNTPs(各2.5mM)
2μL
引物F(1μM)
5μL
引物R(1μM)
5μL
ddH2O
8.3μL
备注：DNA模板量一般在100 ng以下，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的DNA模板使用量。PCR反应体系应在冰中配置，然后置于冰箱中冷却3~5min，最后放于PCR仪上进行反应，这种冷启动法可增强PCR扩增的特异性。
5.2.2 PCR反应条件
94℃：10min
94℃：30s
30Cyc
58℃：30s
72℃：45s
72℃：5min
4℃：∞
5.2.3 电泳
称取1g琼脂糖置于100mL TAE电泳缓冲液中，加热融化，待温度降至60℃左右时，均匀铺板，制成1%的琼脂糖凝胶。PCR反应结束后，加样，以100V电压进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结束后，染色，用凝胶成像仪观察，拍照，记录实验结果。
5.3 产物纯化
5.3.1 每5μLPCR产物加入2μL ExoSAP-IT试剂，混匀。
5.3.2 放入PCR仪中，37℃温育15min, 80℃温育15min。
5.3.3 纯化后的PCR产物做为下一步测序反应的模板。
5.4 测序反应
5.4.1 测序反应体系
试剂
使用量（10μL体系）
模板DNA
1μL
引物 (1μM)
1.6μL
BigDye Terminator
1μL
5×Sequencing Buffer
1μL
ddH2O
5.4μL
5.4.2 测序反应条件
96℃：2min
96℃：30s
30Cyc
55℃：15s
60℃：4min
4℃：∞
5.4.3 测序反应纯化(BigDye XTerminator Purification Kit)
5.4.3.1每管加入27μL SAM Solution和6μL BigDye XTerminator Solution。
5.4.3.2放在Eppendorf MixMate 上 rpm震荡30min。
5.4.3.3在离心机上以1000×g离心2min。
5.4.3.4每管吸取10μL上清液于96孔板中，放入测序仪中测序
5.5 序列比对
基因测序仪得到的测序结果，在MicroSEQ微生物鉴定系统中进行比对，得到菌种的种属信息。
6. 关键说明
1
2
3
4
5
6
6.1 提取细菌基因组DNA时，对于细胞壁比较薄的革兰氏阴性细菌，可挑取一菌环菌株，置于100μL ddH2O 中，混匀，沸水热变性10min后，离心3min分离，稀释50倍后做为PCR模板。必要时做梯度PCR确认最佳的模板量。
6.2 PCR及测序反应时，为了保证酶的活性，整个体系应在冰中配置；然后置于低温冰箱中冷却3~5min，最后放于PCR仪上进行反应，这种冷启动法可增强PCR扩增的特异性。
6.3 16SrDNA序列的前500bp序列变化较大，包含有丰富的细菌种属的特异性信息，因此对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前500bp序列即可鉴别出细菌的菌属。针对科学论文发表或是前500bp无法鉴别的情况，需要进行16SrDNA的全序列扩增和测序，得到较为全面的16SrDNA的序列信息。具体参照附录。

PCR出现非特异性条带的原因：一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引 物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次 数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量 差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓 度。增加模板量，减少循环次数。
用RT阴性对照检测是否被基因组DNA污染。
模板浓度过高
10ul体系100ngDNA

附录
（资料性附录）
1. 细菌16SrDNA 三部分的PCR结果电泳图
3
2
1
M

bp
1000bp
750bp
500bp
250bp
100bp

M：DL ；
1：引物27F和519R的PCR产物（第1部分500bp）
2：引物357F和1115R的PCR产物（第2部分750bp）
3：引物926F和1492R的PCR产物（第3部分560bp）

2. 细菌16SrDNA鉴定结果
1
2
2.1 16SrDNA前500bp即可反映细菌的种属信息：
菌株TL140924的鉴定结果

2.2 16SrDNA前500bp不足以反映细菌的种属信息：
菌株70528的鉴定结果

2.3 16SrDNA的全序列信息：
菌株70528的鉴定结果

如附录2.2、2.3所示，当待测菌株的16SrDNA前500bp序列不足以将待测菌株与库中菌株区分时，则需要测其16SrDNA全长序列以将其区分。