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1、在分子克隆实验中,有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开,因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。 添加保护碱基,需要考虑两个因素:一是碱基数目,一是碱基种类。 添加保护碱基时,最关心的应该是保护碱基的数目,而不是种类。什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的，见附表。 添加什么保护碱基,如果严格点,是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量.如果某条引物Tm值偏小,GC％较低，添加时多加G
2、或C，反之亦反。 保护碱基列表 Enzyme Oligo Sequence ChainLength ％ Cleavage 2 hr 20 hr AccI GGTCGACC CGGTCGACCG CCGGTCGACCGG 8 10 12 0 0 0 0 0 0 AflIII CACATGTG CCACATGTGG CCCACATGTGGG 8 10 12 0 >90 〉90 0 〉90 >90 AscI GGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA
3、 8 10 12 >90 >90 >90 >90 >90 〉90 AvaI CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA 8 10 12 50 〉90 〉90 >90 〉90 >90 BamHI CGGATCCG CGGGATCCCG CGCGGATCCGCG 8 10 12 10 〉90 〉90 25 >90 〉90 BglII CAGATCTG GAAGATCTTC GGAAGATCTTCC 8 10 12 0
4、 75 25 0 〉90 〉90 BssHII GGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA 8 10 12 0 0 50 0 0 >90 BstEII GGGT（A/T)ACCC 9 0 10 BstXI AACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT 22 24 27 0 25 25 0 50 〉90 ClaI CATCGATG
5、 GATCGATC CCATCGATGG CCCATCGATGGG 8 8 10 12 0 0 〉90 50 0 0 〉90 50 EcoRI GGAATTCC CGGAATTCCG CCGGAATTCCGG 8 10 12 〉90 〉90 〉90 >90 〉90 〉90 HaeIII GGGGCCCC AGCGGCCGCT TTGCGGCCGCAA 8 10 12 >90 >90 >90 〉90 >90 〉90 HindIII
6、CAAGCTTG CCAAGCTTGG CCCAAGCTTGGG 8 10 12 0 0 10 0 0 75 KpnI GGGTACCC GGGGTACCCC CGGGGTACCCCG 8 10 12 0 〉90 〉90 0 〉90 〉90 MluI GACGCGTC CGACGCGTCG 8 10 0 25 0 50 NcoI CCCATGGG CATGCCATGGCATG 8 14 0 50 0 75 NdeI CCATAT
7、GG CCCATATGGG CGCCATATGGCG GGGTTTCATATGAAACCC GGAATTCCATATGGAATTCC GGGAATTCCATATGGAATTCCC 8 10 12 18 20 22 0 0 0 0 75 75 0 0 0 0 >90 〉90 NheI GGCTAGCC CGGCTAGCCG CTAGCTAGCTAG 8 10 12 0 10 10 0 25 50 NotI TTGCGGCCGCAA ATTTGCG
8、GCCGCTTTA AAATATGCGGCCGCTATAAA ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTAT AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA 12 16 20 24 28 0 10 10 25 25 0 10 10 90 〉90 NsiI TGCATGCATGCA CCAATGCATTGGTTCTGCAGTT 12 22 10 >90 >90 〉90 PacI TTAATTAA GTTAATTAAC CCTTAATTAAGG 8 10
9、12 0 0 0 0 25 〉90 PmeI GTTTAAAC GGTTTAAACC GGGTTTAAACCC AGCTTTGTTTAAACGGCGCGCCGG 8 10 12 24 0 0 0 75 0 25 50 >90 PstI GCTGCAGC TGCACTGCAGTGCA AACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT 8 14 22 24 26 0
10、 10 〉90 〉90 0 0 10 〉90 〉90 0 PvuI CCGATCGG ATCGATCGAT TCGCGATCGCGA 8 10 12 0 10 0 0 25 10 SacI CGAGCTCG 8 10 10 SacII GCCGCGGC TCCCCGCGGGGA 8 12 0 50 0 〉90 SalI GTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC GCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG ACG
11、CGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA 28 30 32 0 10 10 0 50 75 ScaI GAGTACTC AAAAGTACTTTT 8 12 10 75 25 75 SmaI CCCGGG CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA 6 8 10 12 0 0 10 〉90 10 10 50 >90 SpeI GACTAGTC GGACTAGTCC CGGACTAGTCCG CTAGACT
12、AGTCTAG 8 10 12 14 10 10 0 0 〉90 〉90 50 50 SphI GGCATGCC CATGCATGCATG ACATGCATGCATGT 8 12 14 0 0 10 0 25 50 StuI AAGGCCTT GAAGGCCTTC AAAAGGCCTTTT 8 10 12 〉90 >90 〉90 >90 〉90 >90 XbaI CTCTAGAG GCTCTAGAGC TGCTCTAGAGCA CTAGTCTAGACTAG 8 10 12 14 0 >90 75 75 0 >90 >90 >90 XhoI CCTCGAGG CCCTCGAGGG CCGCTCGAGCGG 8 10 12 0 10 10 0 25 75 XmaI CCCCGGGG CCCCCGGGGG CCCCCCGGGGGG TCCCCCCGGGGGGA 8 10 12 14 0 25 50 〉90 0 75 〉90 〉90
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