引物设计保护碱基列表.doc

在分子克隆实验中,有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开,因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。
添加保护碱基,需要考虑两个因素:一是碱基数目,一是碱基种类。
添加保护碱基时,最关心的应该是保护碱基的数目,而不是种类。什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的，见附表。
添加什么保护碱基,如果严格点,是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量.如果某条引物Tm值偏小,GC％较低，添加时多加G或C，反之亦反。
保护碱基列表
Enzyme
Oligo Sequence
ChainLength
％ Cleavage
2 hr
20 hr
AccI
GGTCGACC
CGGTCGACCG
CCGGTCGACCGG
8
10
12
0
0
0
0
0
0
AflIII
CACATGTG
CCACATGTGG
CCCACATGTGGG
8
10
12
0
>90
〉90
0
〉90
>90
AscI
GGCGCGCC
AGGCGCGCCT
TTGGCGCGCCAA
8
10
12
>90
>90
>90
>90
>90
〉90
AvaI
CCCCGGGG
CCCCCGGGGG
TCCCCCGGGGGA
8
10
12
50
〉90
〉90
>90
〉90
>90
BamHI
CGGATCCG
CGGGATCCCG
CGCGGATCCGCG
8
10
12
10
〉90
〉90
25
>90
〉90
BglII
CAGATCTG
GAAGATCTTC
GGAAGATCTTCC
8
10
12
0
75
25
0
〉90
〉90
BssHII
GGCGCGCC
AGGCGCGCCT
TTGGCGCGCCAA
8
10
12
0
0
50
0
0
>90
BstEII
GGGT（A/T)ACCC
9
0
10
BstXI
AACTGCAGAACCAATGCATTGG
AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA
CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT
22
24
27
0
25
25
0
50
〉90
ClaI
CATCGATG
GATCGATC
CCATCGATGG
CCCATCGATGGG
8
8
10
12
0
0
〉90
50
0
0
〉90
50
EcoRI
GGAATTCC
CGGAATTCCG
CCGGAATTCCGG
8
10
12
〉90
〉90
〉90
>90
〉90
〉90
HaeIII
GGGGCCCC
AGCGGCCGCT
TTGCGGCCGCAA
8
10
12
>90
>90
>90
〉90
>90
〉90
HindIII
CAAGCTTG
CCAAGCTTGG
CCCAAGCTTGGG
8
10
12
0
0
10
0
0
75
KpnI
GGGTACCC
GGGGTACCCC
CGGGGTACCCCG
8
10
12
0
〉90
〉90
0
〉90
〉90
MluI
GACGCGTC
CGACGCGTCG
8
10
0
25
0
50
NcoI
CCCATGGG
CATGCCATGGCATG
8
14
0
50
0
75
NdeI
CCATATGG
CCCATATGGG
CGCCATATGGCG
GGGTTTCATATGAAACCC
GGAATTCCATATGGAATTCC
GGGAATTCCATATGGAATTCCC
8
10
12
18
20
22
0
0
0
0
75
75
0
0
0
0
>90
〉90
NheI
GGCTAGCC
CGGCTAGCCG
CTAGCTAGCTAG
8
10
12
0
10
10
0
25
50
NotI
TTGCGGCCGCAA
ATTTGCGGCCGCTTTA
AAATATGCGGCCGCTATAAA
ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTAT
AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA
12
16
20
24
28
0
10
10
25
25
0
10
10
90
〉90
NsiI
TGCATGCATGCA
CCAATGCATTGGTTCTGCAGTT
12
22
10
>90
>90
〉90
PacI
TTAATTAA
GTTAATTAAC
CCTTAATTAAGG
8
10
12
0
0
0
0
25
〉90
PmeI
GTTTAAAC
GGTTTAAACC
GGGTTTAAACCC
AGCTTTGTTTAAACGGCGCGCCGG
8
10
12
24
0
0
0
75
0
25
50
>90
PstI
GCTGCAGC
TGCACTGCAGTGCA
AACTGCAGAACCAATGCATTGG
AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA
CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT
8
14
22
24
26
0
10
〉90
〉90
0
0
10
〉90
〉90
0
PvuI
CCGATCGG
ATCGATCGAT
TCGCGATCGCGA
8
10
12
0
10
0
0
25
10
SacI
CGAGCTCG
8
10
10
SacII
GCCGCGGC
TCCCCGCGGGGA
8
12
0
50
0
〉90
SalI
GTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC
GCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG
ACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA
28
30
32
0
10
10
0
50
75
ScaI
GAGTACTC
AAAAGTACTTTT
8
12
10
75
25
75
SmaI
CCCGGG
CCCCGGGG
CCCCCGGGGG
TCCCCCGGGGGA
6
8
10
12
0
0
10
〉90
10
10
50
>90
SpeI
GACTAGTC
GGACTAGTCC
CGGACTAGTCCG
CTAGACTAGTCTAG
8
10
12
14
10
10
0
0
〉90
〉90
50
50
SphI
GGCATGCC
CATGCATGCATG
ACATGCATGCATGT
8
12
14
0
0
10
0
25
50
StuI
AAGGCCTT
GAAGGCCTTC
AAAAGGCCTTTT
8
10
12
〉90
>90
〉90
>90
〉90
>90
XbaI
CTCTAGAG
GCTCTAGAGC
TGCTCTAGAGCA
CTAGTCTAGACTAG
8
10
12
14
0
>90
75
75
0
>90
>90
>90
XhoI
CCTCGAGG
CCCTCGAGGG
CCGCTCGAGCGG
8
10
12
0
10
10
0
25
75
XmaI
CCCCGGGG
CCCCCGGGGG
CCCCCCGGGGGG
TCCCCCCGGGGGGA
8
10
12
14
0
25
50
〉90
0
75
〉90
〉90