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1、培养基质量控制作业指导书 1、目标： 为加强我微生物试验室工作管理，确保试验室检测质量，特制订此作业指导书； 2、范围： 本规范适适用于试验室微生物检测中所使用培养基质量控制。 3、职责： 3.1 检验人员：根据本规程规对培养基使用前及使用过程中进行质量控制，确保培养基符合相关标准要求。 3.2 科室责任人：负责指导、监督检验人员对培养基进行质量控制。 4、控制方法： 4．1培养基购置和验收 4.1.1 培养基购置 试剂管理员在接到同意采购信息后，从合格供给商中选择厂商采购，同时要求厂商提供每批培养基批号、使用前pH值、储藏信息、使用期、性能评价统计（包含测试菌株、技术
2、数据清单、质控证书及必需安全危害数据）。 4.1.2 培养基验收 购置培养基到货后，由试剂管理员和微生物检测人员共同查对生产企业提供资料、培养基名称、规格数量、外观特征、批号、保质期是否符合要求。同时应填写“培养基验收检验统计单”验收符合要求后，交由检测人员接收保管，填写培养基入库统计和建立试剂台帐。 4． 2培养基储存 干粉培养基应保留在阴凉干燥处，要避免阳光直射；开瓶后干粉培养基易吸湿，应注意防潮并在使用期或6个月内用完。应每个月对储存中培养基进行常规检验，如容器密闭性复查、首次开封日期、内容物感官检验，假如培养基发生结块、颜色异常和其它变质迹象就不能再使用。开封脱水培养基，每次
3、使用前应对其质量进行检验，经过粉末流动性、均匀性、结块情况和色泽改变等判定培养基质量改变。若发觉培养基受潮或物理性状发生显著改变则不应再使用。即用性培养基根据产品标识要求进行储存。 4． 3培养基使用 4.3.1 配制培养基用水和玻璃器皿 培养基制备用水应使用电阻率大于30万Ωcm蒸馏水或和其同质水，每七天检测电阻率，每三个月检测一次重金属离子含量。制备培养基所用玻璃器皿（如吸管、试管、烧杯等）新玻璃器皿（首次使用）和再次使用玻璃器皿按要求方法洗涤、干燥 4.3.2 称量 称量时要用专用角匙，避免交叉污染而影响检验结果；干粉培养基易吸潮，如房间环境湿度较大时，应提升称量
4、速度，完成后立即盖紧瓶盖。 4.3.3 复水 复水时应注意以下事项： a）不得用铜锅或铁锅，以防有离子混入培养基中，影响微生物生长； b）容器大小需大于复水后培养基总体积2倍以上，避免在加热溶解过程中，培养基溢出； c）加热培养基时一定要进行搅拌，尤其是琼脂类培养基； d）为避免烧焦和沸腾溢出，对于少许培养基最好使用沸水浴进行加热； e）含有琼脂粉培养基，在加热溶解之前能够浸泡数分钟； f）对于琼脂类培养基进行再融化时应使用沸水浴或流动蒸汽进行加热，最多只能加热两次，第二次再融化后仍未用完培养基应弃去； g）烧糊培养基营养物质被破坏，并可产生有毒物质，如发觉焦化，或
5、未溶解均匀前培养基有溢出，该培养基即不能使用，应重新制备。 4.3.4 灭菌 培养基采取高压蒸汽灭菌（湿热灭菌），通常是121℃15min，含糖或特殊培养基，根据国家标准或生产商提供说明灭菌。已配制好培养基必需在15分钟内灭菌，避免微生物生长繁殖而消耗养分，改变培养基酸碱度。 为避免高温破坏培养基营养成份，降低琼脂凝胶强度，必需严格控制灭菌温度和时间，不可反复灭菌。 4.3.5 pH测定 在首次使用每批培养基时，均需随同检测配制一个测试培养基，在灭菌或消毒后应在25℃温度下采取精密PH 试纸测试PH值，并判定是否符合要求；使用过程中，假如需要调整培养基pH，应用1mo
6、l/LNaOH或lmol/LHCL调整，注意不可反复调pH，不然会影响培养基渗透压。 4.3.6 配制好培养基标识和保留 灭菌以后培养基应该快速冷却至所需温度，避免长时间保留在灭菌锅内，造成过分灭菌，影响培养基营养成份或选择性效果。同时填写配制统计。内容：名称、配制量、配方（比）、操作中关键参数（时间、压力、温度）、配制日期、配制者、截止使用日期。在每个已灭菌培养基容器外做好标识，注明名称、配制日期、使用期限和配制人。 培养基保留注意事项： 1）环境条件：多种培养基均应在洁净一般冰箱内保留，以2-8℃左右为宜，不得冻结。 2）保留时限: 基础培养基应在30天内用完。判别
7、培养基应在21天内用完。选择性分离判别培养基制成平板后当日用完,置保鲜膜(袋)密闭保留期限可延长至一周。从外单位购置培养基保留时限根据产品标注时限实施. 4．4培养基批号管理 培养基批号由6位阿拉伯数字组成，批号为年、月、日，各取2位，年份取后2位，月和日不足2位时，分别在数字前加0，表明是本日配制批号。如6月4日配制培养基，批号为040604。 4.5质量检验 购置同一批次培养基其质量检验应能经过无菌检验（制备好培养基经30～35℃培养48小时，真菌培养基经20～25℃培养72小时候后，应无菌生长）、新购不一样批次商品化培养基在使用前应进行培养基性能测试，经检验合格该批次培养基方准
8、许使用，不然不准使用，做好检验统计。。成品培养培养基质量控制应包含物理指标和微生物指标测试，依据测试结果立即填写“试验室培养基质量控制性能测试统计及评定汇报 4.5 培养基性能测试 新购不一样批次商品化培养基在使用前应进行培养基性能测试，包含物理指标和微生物指标测试，依据测试结果立即填写“试验室培养基质量控制性能测试统计及评定汇报，菌株选择参考SN/T 1538.2-《培养基制备指南 第2部分：培养基性能测试实用指南》。 4．5．1物理指标控制 1） 测试20℃～25℃pH值 2）琼脂层厚度；色泽；透明度和（或）是否存在肉眼可见杂质； 4．5．2微生物污染控制 从每
9、批制备好培养基中选择最少一个（或1%）平板或试管，置于35-37℃或按特定标准中要求温度培养48h应无菌生长，真菌培养基经20～25℃培养72小时候后，应无菌生长。 4．5．3微生物学指标控制 可依据要求选择定量方法、半定量方法或定性方法（详见表1-表）对培养基性能进行测试，具体操作方法以下： （1）生长率 将适量测试菌株工作培养物接种至固体、半固体和液体培养基中，每种培养基上菌株生长率应达要求最低限值。 1）定量方法 生长率PR计算： PR = NS/NO NS：从一个或多个待测培养基平板上得到菌落总数。 N0：从一个或多个要求参考培养基平板上取得
10、菌落总数（该菌落总数应≥100cfu ）。 要求：非选择性培养基上目标菌生长率最低应为0.7，该类培养基应易于目标菌生长；选择性培养基上目标菌生长率最低应为0.1；每平板（或每试管）接种水平为10CFU～100CFU。 2） 半定量方法 半定量方法采取生态测量技术在平板上划线，平板板连续划线区域得分总和即为生长指数G，G值不应超出标准要求许可范围。 3） 定性方法 定性方法采取划线法观察。 ①选择性 将浓度为104CFU/mL～106CFU/mL非目标菌工作菌株悬浮液接种至选择培养基和参考培养基中，培养基选择性应达成要求值。 ②定量方法 选择因子SF： SF
11、 = DO - DS DO：能在参考培养基上生长最少10个菌落最高稀释度 DS：能在测试培养基上显示生长最高稀释度 要求：非目标菌在选择性培养基上SF最少为2 ；半定量和定量法中，非目标菌应部分或全部被抑制。 ③生理生化特征（选择性和特异性） 要求培养基基础特征，使用一套合适测试菌株对培养基上目标菌生理生化特征（菌落形态、大小等）和非目标菌被抑制程度进行测试。 （2）性能评价和结果解释 根据要求得到全部测试菌株性能均符合要求，则该批培养基品质优良；若只有物理指标和微生物指标符合要求，则该批培养基可被接收。
12、 表1 计数用选择性培养基 培养基 用途 培养条件 测试菌株 参考培 养基 控制方法 判定标准 特征反应 Baird- Parker [S] 生长率 37℃24-48h 金黄色葡萄球菌ATCC6538/25923 TSA 定量 PR≥0.5 黑色/灰色菌落，周围为一混浊带，其外有透明带 选择性 37℃48h 大肠杆菌ATCC25922/8739 —— 定性 全部抑制 —— 特异性 37℃24-48h 表皮葡萄球菌ATCC12228 —— 定性 —— 黑色/灰色菌落，周围为一混浊带，其外无透明带 MYP
13、[S] 生长率 30℃24-48h 腊样芽胞杆菌ATCC11778 TSA 定量 PR≥0.7 具沉淀带粉色菌落 选择性 37℃48h 大肠杆菌ATCC25922 —— 定性 全部抑制 —— 特异性 37℃48h 枯草芽胞杆菌ATCC6633 —— 定性 —— 不具沉淀带粉色菌落 培养基 用途 培养条件 测试菌株 参考培 养基 控制方法 判定标准 特征反应 VRBG（结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂） [S] 生长率 37℃24h 大肠杆菌ATCC25922/8739 TSA 定量 PR≥0.5 带有或不带沉淀带粉红
14、色或红色菌落 鼠伤寒沙门菌ATCC14028 选择性 37℃20h 粪链球菌ATCC29212/19433 —— 定性 全部抑制 —— VRBL（紫红胆汁乳糖） [S] 生长率 30℃20h 大肠杆菌ATCC25922/8739 TSA 定量 PR≥0.5 带有或不带沉淀带淡紫色菌落 选择性 30℃20h 粪链球菌ATCC29212/19433 —— 定性 全部抑制 —— 特异性 30℃20h 铜绿假单胞菌ATCC27853 —— 定性 -- 无色至浅棕色菌落 CT-SMAC（改良山梨醇麦康凯琼脂） [S] 生长率 37℃2
15、4h 大肠杆菌O157：H7 ATCC43894/43895 TSA 定量 PR≥0.5 透明菌落，表面淡黄棕色，菌落直径约1mm 选择性 37℃24h 金黄色葡萄球菌ATCC6538/25923 定性 全部抑制 —— 特异性 37℃24h 大肠杆菌ATCC11775/25922 —— 定性 —— 粉色菌落 BGBLB（煌绿乳糖胆盐肉汤） [L] 生长率 30℃24-48h 大肠杆菌ATCC25922/8739 TSA 半定量 浊度2+，导管1/3产气 产气并浑浊 弗氏柠檬酸杆菌 ATCC25922/8739 选择性 粪链球菌
16、ATCC29212/19433 定性 不生长 —— EC [L] 生长率 44℃24～48h 大肠杆菌ATCC25922 —— 半定量 浊度2+，导气管1/3产气 产气并浑浊 选择性 44℃24～48h 铜绿假单胞菌ATCC27853b —— 定性 不生长 —— EC-MUG/ LS-MUG [L] 生长率 44℃24～48h 大肠杆菌ATCC25922 —— 半定量 浊度2+，导气管1/3产气 产气并浑浊，产生荧光 选择性 44℃24～48h 铜绿假单胞菌ATCC27853b —— 定性 不生长 —— 乳糖胆盐发酵培养
17、 [L] 生长率 37℃24h 大肠杆菌ATCC25922 —— 半定量 导气管1/3产气 产气并变黄色 选择性 37℃24h 鼠伤寒沙门菌ATCC14028 —— 定性 —— 不产气、仍为紫色 LST（月桂酸肉汤） [L] 生长率 37℃24h 大肠杆菌ATCC25922 —— 半定量 导气管1/3产气 —— 选择性 37℃24h 福氏志贺氏菌CMCC51572 —— 定性 —— —— 表2 计数用非选择性培养基 培养基 用途 培养条件 测试菌株 参考培 养基 控制方法 判定标准 特征反应 PCA（平
18、板计数琼脂） [S] 生长率 30℃72h 大肠杆菌ATCC25922/8739 TSA 定量 PR≥0.7 —— 金黄色葡萄球菌ATCC6538 枯草芽孢杆菌ATCC6633 表3 选择性增菌培养基 培养基 用途 培养条件 测试菌株 控制方法 判定标准 特征反应 EE [L] 生长率 37℃24h 大肠杆菌ATCC25922/8739 半定量 VRBG上＞10CFU 粉红至红色菌落，有或没有沉淀带 鼠伤寒沙门菌ATCC14028 选择性 粪肠球菌ATCC29212 全部抑制 RVS [L] 生长率 41.5℃24h
19、 鼠伤寒沙门菌ATCC14028 半定量 XLD或其它选择性培养基上＞10CFU —— 肠炎沙门氏菌ATCC13076 铜绿假单胞菌ATCC27853 选择性 41.5℃24h 大肠杆菌ATCC25922 半定量 TSA上全抑制 —— 粪链球菌 ATCC29212 TSA上＜10CFU SC(亚硒酸盐胱氨酸) [L] 生长率 37℃24h 鼠伤寒沙门菌ATCC14028 半定量 XLD或其它选择性培养基上＞10CFU 不一样培养基上菌落特征不一样（见标准） +大肠杆菌ATCC25922 +铜绿假单胞菌ATCC27853b 选择性 37℃24h
20、 大肠杆菌ATCC25922 半定量 TSA上＜10CFU —— 粪链球菌 ATCC29212 TTB(四硫磺酸钠煌绿增菌液) [L] 生长率 37℃24h 鼠伤寒沙门菌ATCC14028 半定量 XLD或其它选择性培养基上＞10CFU 不一样培养基上菌落特征不一样（见标准） 伤寒沙门菌CMCC50071 选择性 37℃24h 大肠杆菌ATCC25922 TSA上＜10CFU —— 碱性蛋白胨水 [L] 生长率 37℃24h 霍乱弧菌CMCC16109 半定量 TCBS或其它选择性培养基上＞10CFU 不一样培养基上菌落特征不一样（见标准
21、 副溶血性弧菌CMCC1 选择性 37℃24h 大肠杆菌ATCC25922/8739 TSA上＜10CFU —— 福氏志贺氏菌CMCC51572 7.5%氯化钠肉汤[L] 生长率 37℃24h 金黄色葡萄球菌ATCC6538 半定量 B-P平板或其它培养基上＞10CFU 不一样培养基上菌落特征不一样（见标准） 表4 非选择性增菌培养基 培养基 用途 培养条件 测试菌株 控制方法 判定标准 特征反应 BHI 生长率 37℃24h 金黄色葡萄球菌ATCC6538 定性 浊度1～2 —— 蛋白胨盐 [L] 稀释 20～2
22、5℃45min 大肠杆菌ATCC25922 定量 +/-50%菌落数/至（+/-50%原始菌落数 —— 金黄色葡萄球菌ATCC25923 表4 非选择性增菌培养基（续） 培养基 用途 培养条件 测试菌株 控制方法 判定标准 特征反应 乳糖蛋白胨肉汤 [L] 生长率 37℃24h 大肠杆菌ATCC25922 —— 定性 导气管1/3产气 选择性 37℃24h 鼠伤寒沙门菌ATCC14028 —— 定性 —— SCDLP液体培养基 [L] 生长率 37℃24h 铜绿假单胞菌ATCC27853 定性 浊度1～2 ——
23、 大肠杆菌ATCC25922 金黄色葡萄球菌ATCC6538 液体沙氏培养基[L] 生长率 26℃5天 白色念珠菌CMCC98001 定性 浊度1～2 —— 真菌培养基[L] 生长率 26℃5天 白色念珠菌CMCC98001 定性 浊度1～2 —— 表5 选择性分离培养基 培养基 用途 培养条件 测试菌株 控制方法 判定标准 特征反应 亚硫酸酸铋琼脂（BS） [S] 生长率 37℃48h 鼠伤寒沙门菌ATCC14028 定性 良好生长(2) 菌落呈黑色，有金属光泽 福氏志贺氏菌CMCC51572 菌落呈棕色
24、选择性 大肠杆菌ATCC25922/8739 全部或部分抑制（0～1） 无经典菌落 粪链球菌ATCC29212/19433 全部抑制（0） -- XLD [S] 生长率 37℃24h 鼠伤寒沙门菌ATCC14028 定性 良好生长(2) 菌落呈黑色 福氏志贺氏菌CMCC51573 菌落呈无色 选择性 大肠杆菌ATCC25922/8739 全部或部分抑制（0～1） 无经典菌落 粪链球菌ATCC29212/19433 全部抑制（0） -- 血琼脂平板 [S] 生长率 37℃24～48h 金黄色葡萄球菌ATCC6538/25923 定性
25、 良好生长 β溶血，透明溶血环 粪链球菌ATCC29212 定性 良好生长 α溶血,草绿色溶血环 TCBS [S] 生长率 37℃24～48h 霍乱弧菌CMCC16109 定性 良好生长 菌落较大，呈黄色 副溶血性弧菌CMCC1 定性 良好生长 菌落较大，呈绿色 4号琼脂 [S] 生长率 37℃24～48h 霍乱弧菌CMCC16109 定性 良好生长 菌落较大、扁平透明、湿润、中心带有黑色 非O1群霍乱弧菌CMCC17045 定性 良好生长 菌落较大、扁平透明、湿润、中心带有黑色 选择性 37℃24h 大肠杆菌ATCC25922/
26、8739 定性 全部或部分抑制（0～1） —— 表5 选择性分离培养基（续） 培养基 用途 培养条件 测试菌株 控制方法 判定标准 特征反应 伊红美兰琼脂 [S] 生长率 37℃24h 大肠杆菌ATCC25922/8739 定性 良好生长 菌落紫黑色带金属光泽 鼠伤寒沙门菌ATCC14028 定性 良好生长 菌落灰白色半透明 福氏志贺氏菌CMCC51573 定性 良好生长 菌落灰白色半透明 TSI(三糖铁琼脂) [S] 生长率 37℃24-48h 大肠杆菌ATCC25922/8739 定性 良好生长 斜面及底层均变
27、黄，产气，硫化氢阳性 一般变形杆菌 CMCC49001 定性 良好生长 斜面及底层均变黄，产气，硫化氢阳性 福氏志贺氏菌CMCC51573 定性 良好生长 底层变黄，斜面变红，不产气，硫化氢阴性 鼠伤寒沙门菌ATCC14028 定性 良好生长 底层变黄，斜面变红，产气，硫化氢阳性 表6 非选择性分离培养基 培养基 用途 培养条件 测试菌株 控制方法 判定标准 特征反应 营养琼脂 [S] 生长率 37℃24h 大肠杆菌ATCC25922 定性 良好生长(2) -- 鼠伤寒沙门菌ATCC14028c 小肠耶尔森氏菌ATCC23
28、715 8.管理 8.1.贮存培养基冰箱（或冰柜）内不得存放食品、饮料等无关物品。 8.2.使用前，须仔细检验培养基外观和效期，管理员应按要求时间检验制备好培养基外观：如失水、沉淀、过期、棉花塞松弛或脱落等异常情况， 如发觉失水、沉淀等异常情况，则同一批号剩下全部培养基立即全部弃去，不得再用 8.3.对于过了效期、瓶塞松驰或脱落培养基一旦发觉立即弃去。 9、统计 商品化培养基/成品培养基目录清单 培养基试剂入库记录表 培养基配制统计 培养基质量控制性能测试统计及评定汇报 培养基标签 培养基制备用水检测统计 10引用标准 10.1 GB/T27405-.试验室质量控制规范 食品微生物检测[S]. 10.2 SN/T1538.1-.培养基制备指南 第1部分：试验室培养基制备质量确保通则[S]. 10.3 SN/T1538.2-.培养基制备指南 第2部分：培养基性能测实用指南[S].
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