1、单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,实验五,细胞染色体分析,(,秋水仙素裂解法,),一、原理,细胞处于分裂中期时染色体的长短和大小恰到好处，是研究染色体最好时期。,秋水仙素能破坏细胞纺锤体,并阻止其形成,使分裂的细胞停留在分裂中期。,秋水仙素使染色体收缩，形成清晰的轮廓。,低渗液处理可使细胞肿胀，染色体分散,空气干燥使细胞和染色体展平。,二、实验材料,1,、有丝分裂抑制剂,50,浓缩的秋水仙素（,20g/ml,）：将,0.1mg,秋水仙素溶于,5ml,重蒸水中，分装后冰冻保存。,2,、细胞消化液：,0.25%,胰蛋白酶溶液,3,、低渗溶液：,
2、0.075mol/L,KCl,4,、固定液：,甲醇,冰乙酸（,31,混合）,5,、染液,(,Giemsa,吉姆萨染液,),Giemsa,染色液原液：,姬姆萨染料,0.6g,加于,50mL,甘油中，置,55,60,水浴,1.5h,2h,后，加甲醇,50mL,，静置,24h,以上，过滤即成,姬姆萨染色液原液,，装于棕色瓶内保存备用。,10%,Giemsa,染液：,取原液,1,份加入,9,份,0.01mol/L pH7.2 PBS,中混匀。,6,、细胞：,PK-15,细胞,7,、载玻片：,4,预冷,三、操作方法,秋水仙素处理，使细胞停止分裂,收集处理的细胞,取对数生长期的,PK-15,细胞一瓶，加入
3、秋水仙素到培养液内使终浓度为,0.4g/ml,。,37,温箱中继续培养,2.5-3h,。,倾出秋水仙素处理液，用,0.25%,胰酶溶液消化细胞，细胞消化好后加入,DMEM,培养液将细胞吹下。,1600r/min,离心,10min,收集细胞。,低渗处理，使细胞肿胀,将细胞沉淀用,1ml 37,预温的,0.075mol/L,的,KCl,低渗溶液悬浮，混匀后置,37,温育,20-35min,。,加入新配制的固定液（甲醇,冰乙酸）,1ml,，混匀，,1600r/min,离心,10min,，弃上清液。,再次加入固定液,1ml,，轻轻混匀，静置,20-30min,或,4,过夜，,1600r/min,离心,
4、10min,，弃上清液。,固定,细胞重悬与浓度检测,每管加入,200,l,固定液，混匀。,吸取,50,l,细胞悬液于,4,预冷的干净载玻片上，轻吹液滴，使细胞悬液铺展于玻片上，室温下自然干燥。（在显微镜下观察，如果细胞均匀地铺开，细胞不重叠，则用同样细胞浓度制备细胞样品。否则要进一步稀释细胞悬液，以达到满意的铺片效果。）,染色,C,D,用,10%,Giemsa,染液染,10-15min,。流水冲洗，自然干燥。,观察与计数,将载玻片置显微镜油镜下观察计数。,观察细胞的标准：,细胞完整，轮廓清晰，染色体分布在同一水平面上。,染色体形态和分布良好。,最好无重叠，即使有个别重叠，也要能明确辩认，以免差错。,所观察的细胞处于同一有丝分裂阶段，即染色体螺旋化程度或染色体长短大致一样。,在所观察的细胞周围，没有离散的单个或多个染色体存在，以免影响计数。,
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