h蛋白质工程概述.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,自 我 介 绍,曲 萌,北华大学分子生物学教研室（,419,）,医学博士在读,电话：,6605155,邮箱：,dzhqmdzh,基因组学,蛋白质组学,基因工程,蛋白质工程,问题：,1.,基因组与蛋白质组有什么联系？,2.,蛋白质工程与基因工程的区别？,DNA,mRNA,复,制,转录,蛋白质,表,达,胞浆,核,遗 传 信 息 流 程 图,基因组与蛋白质组有什么联系,？,遗传信息从,DNA,到,mRNA,，然后合成各种结构蛋白质和功能蛋白质，构成有机体，完成生命的功能。,基因是遗传信息的源头，而蛋白质是基因功能的体现者和执行者。,HGP,完成了基因序列的确定，但它不能提供认识各种生命活动的直接分子基础，所以必须研究生命活动的执行者,蛋白质。蛋白质组学的研究宗旨就是解决这个问题。,蛋白质组的研究是对基因组研究的重要补充，也是后基因组时代研究基因功能的最重要途径。,蛋白质组学研究的特点,研究对象的,整体性,研究目标的,动态性,体现生命的,复杂性,研究对象的整体性,当前蛋白质组学的主要任务是,：,传统上，我们只是对某一发育阶段或特定位置上的单个基因进行研究，缺乏对蛋白质全面、整体的认识，而蛋白质组学是把基因组所表达的全部蛋白质作为研究对象，在建立和发展蛋白质组研究技术方法的同时，进行蛋白质组分析。,分析工作主要有两个方面：,一方面,建立正常生理条件下机体、组织、细胞的全部蛋白质的,图谱和数据库,，获得蛋白质组群的整体信息，为进一步的分析工作提供基础；,另一方面,比较分析非生理条件下蛋白质组所发生的变化。,研究目标的动态性,组成有机体的所有不同细胞都共享一个基因组，,即一个有机体只有一个确定的基因组。,但基因组内各个基因的表达条件、程度都要随时间、地点、环境的不同而不同。所以，,蛋白质组是一个动态的概念。,体现生命的复杂性,HGP,表明：,30,亿对碱基，仅编码,2.6-3.9,万个不同的基因。人类的复杂性体现在表达产物的复杂性，即蛋白质的复杂性。,证 明,一个基因并不只存在一个相应的蛋白质，可能有几个或几十个。,基因也不能直接决定一个功能蛋白。,很多疾病并不完全是因为基因改变所造成，基因的表达方式错综复杂。,同一个基因在不同的条件下，可能会起到完全不同的作用。,基因不能完全决定蛋白质后期加工、修饰及转运定位的全过程。,基因工程的基本步骤,目的基因的获取,DNA,导入受体菌,外源基因与载体的连接,克隆载体的选择和构建,重组体的筛选,克隆基因的表达,玫瑰的栽培历史可以追溯到,5000,年前，但通过色素呈现出蓝色的玫瑰却从来没有过,。,从蓝色三叶草中提取制造蓝色色素的基因，然后注入到玫瑰中，,并成功地让翠雀花素单独显色。,畜產系 鄭登貴 教授,抗虫基因转殖烟草,荧光基因转殖鱼,抗老化转殖兰花,基因转殖羊,目的基因,基因载体,重组体,分,切,接,转,筛,表,总体技术路线,目的基因的分离与合成,需要克隆的,DNA,片段：,化学合成法,cDNA,文库,基因组,DNA,文库,聚合酶链式反应,分,:,一、质粒载体,(plasmid,),质 粒,Plasmid,：,独立于细菌,染色体外能,自主复制的,小型双链环,状,DNA,分子。,噬菌体,(,phage),噬菌体载体,粘粒,单链丝状噬菌体,真核细胞的克隆载体,SV40(,猴肾病毒,),载体,穿梭载体,反转录病毒载体,人工染色体,酵母人工染色体,（,yeast artificial chromosome,YAC,）,细菌人工染色体（,BAC,）,噬菌体人,P1,衍生的人工染色体（,PAC,）,哺乳动物人工染色体（,MAC,）,限制性内切,酶酶切,酶切,切,:,目的基因,基因载体,重组体,(,复制子,),基因重组,接,:,连 接 方 法,1.,粘性末端的连接,(cohesive end ligation,),2.,同聚体加尾部连接,(homoploymeric tails ligation),3.,人工接头法,(artificial linker ligation),转化：,1)CaCl2,处理后的转化,2,）电击法,转染：,1)CaCl2,处理后的转染,2,）电击法,3),其他方法：（,1,）聚乙二醇介导的转染法,（,2,）磷酸钙,-DNA,共沉淀法,（,3,）二乙胺乙基,-,葡聚糖介导的转染,（,4,）原生质体融合,（,5,）脂质体法,（,6,）细胞核的显微注射法,转,:,一、根据载体的性状变化进行筛选,1.,抗药性标志筛选,2.,抗药性标志插入失活,3.,根据外源,DNA,片段性状筛选,4.-,半乳糖苷酶系统,二、根据重组,DNA,的结构特征进行筛选,1.,重组,DNA,的快速裂解与鉴定,2.,限制性内切酶图谱分析法,3.,核酸分子杂交方法进行鉴定,4.PCR,扩增方法进行鉴定,筛,:,一、原核表达体系,二、真核表达体系,1酵母表达体系,2.,昆虫表达体系,3.,哺乳类动物细胞,表,:,概 论,1.,蛋白质工程,:,崛起的缘由、概念,2.,常用技术：,定点诱变（概念、意义,）,3.,蛋白质改造范围,4.,改造类型,基因工程在原则上只能生产自然界已存,在的蛋白质，这些天然蛋白质是生物在,长期进化过程中形成的，它们的结构和,功能符合特定物种生存的需要，却不一,定完全符合人类生产和生活的需要。,蛋白质工程崛起的缘由,由于蛋白质是由许多氨基酸按一定顺序连接而成的，每一种蛋白质有自己独特的氨基酸顺序，所以改变其中关键的氨基酸就能改变蛋白质的性质。而氨基酸是由三联体密码决定的，只要改变构成遗传密码的一个或两个碱基就能达到改造蛋白质的目的。蛋白质工程的一个重要途径就是根据人们的需要，对负责编码某种蛋白质的基因重新进行设计，使合成的蛋白质变得更符合人类的需要。这种通过造成一个或几个碱基定点突变，以达到修饰蛋白质分子结构目的的技术，称为基因定点突变技术。,蛋白质工程概念,通过,蛋白质化学、蛋白质晶体学和动力学,的研究获取关于蛋白质,物理、化学,等各方面的信息，在此基础上对编码该蛋白质的基因进行,有目的设计、改造,，并通过,基因工程,等手段将其进行,表达和分离纯化,，最终将其投入实际应用。,一般认为蛋白质工程就是通过基因重组技术改变或设计合成具有特定生物功能的蛋白质。实际上蛋白质工程包括蛋白质的分离纯化，蛋白质结构和功能的分析、设计和预测，通过基因重组或其它手段改造或创造蛋白质。从广义上来说，蛋白质工程是通过物理、化学、生物和基因重组等技术改造蛋白质或设计合成具有特定功能的新蛋白质。,蛋白质工程是在基因重组技术、生物化学、分子生物学、分子遗传学等学科的基础之上，融合了蛋白质晶体学、蛋白质动力学、蛋白质化学和计算机辅助设计等多学科而发展起来的新兴研究领域。,其,内容主要为,：根据需要合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质；确定蛋白质化学组成、空间结构与生物功能之间的关系。在此基础之上，实现从氨基酸序列预测蛋白质的空间结构和生物功能，设计合成具有特定生物功能的全新的蛋白质，这也是蛋白质工程最根本的目标之一。蛋白质工程与基因工程的区别,北京大学生命科学学院 顾孝诚,简单地讲，蛋白质工程就是根据蛋白质的精细结构和生物活力的作用机制之间的关系，利用基因工程的手段，按照人类自身的需要，定向地改造天然的蛋白质，甚至于创造新的、自然界本不存在的、具有优良特性的蛋白质分子。蛋白质工程在诞生之日起就与基因工程密不可分。基因工程是通过基因操作把外源基因转入适当的生物体内，并在其中进行表达，它的产品还是该基因编码的天然存在的蛋白质。蛋白质工程则更进一步根据分子设计的方案，通过对天然蛋白质的基因进行改造，来实现对其所编码的蛋白质的改造，它的产品已不再是天然的蛋白质，而是经过改造的，具有了人类所需要的优点的蛋白质。天然蛋白质都是通过漫长的进化过程自然选择而来的，而蛋白质工程对天然蛋白质的改造，好比是在实验室里加快了的进化过程，期望能更快、更有效地为人类的需要服务。,摘自,科技日报,蛋白质工程的一个重要途径就是根据人们的需要，对负责编码某种蛋白质的基因重新进行设计，使合成的蛋白质变得更符合人类的需要。这种通过造成一个或几个碱基定点突变，以达到修饰蛋白质分子结构目的的技术，称为基因定点突变技术。,定点诱变,概念：专一的改变基因中某个或某些特定氨基酸的技术。,意义：可以产生具有工业上和医学上所需性状,的蛋白质。,为什么定点诱变是蛋白质工程的常用技术？,为什么定点诱变是蛋白质工程的常用技术？,虽然常规的突变、选择的方法也可用于设计所需的蛋白质，但用常规突变方法无法预先确知哪个核苷酸发生了变化，因而可能产生的突变蛋白数目很多，由于绝大多数氨基酸的替换会降低酶的活性，因此常规的突变方法一般很少使目的蛋白向好的方面改变。,思考：基因定点诱变技术与基因突变的比较,比较,基因定点诱变,基因突变,相同点,发生的过程,结果,不同点,场所,手段,方向,DNA,复制过程中,产生新基因，从而产生新性状,生物体外,生物体内,定向改造,不定向性,PCR,技术,物理化学方法,改造范围,1.,改变酶促反应的,K,m,与,V,am,可改变反应的催比效率,2.,改变蛋白质的,PH,或温度稳定范围，可改变蛋白质的作用条件,3.,改变酶在非水溶剂中的反应性，以便在非生理条件下产生作用,4.,改变某种酶，使其不再需要加入辅助因子，简化持续生产过程,5.,提高酶对底物的亲和力，以增强酶的专一性，减少副反应,6.,增强蛋白质对胞内蛋白酶的抗性，可简化纯化过程，提高产率,7.,改变酶的别构调节部位，减少反馈抑制，使产物的产率提高,8,提高蛋白质的抗氧化能力,9.,根据需要改变酶的底物专一性,10.,改变蛋白质发生作用的种属特异性,改造类型,蛋白质水平上,基因水平,那个类型的改造更简便,?,为什么？,蛋白质水平上,翻译后的加工,高级结构的修饰：,亚基聚合,辅基连接：,磷酸化、糖基化,一级结构的修饰,蛋白质合成后的靶向运送,肽链从核蛋白体释放后，不一定具备生物活性，,需经过细胞内各种修饰处理过程，成为有活性的,成熟蛋白质。,亚基聚合,具有四级结构的蛋白质由两条以上的肽链,通过非共价聚合，形成寡聚体。,血红蛋白分子,2,2,的聚合，各亚基虽具有独立功能，但又必须相互依存，才能得以发挥作用。,视网膜母细胞瘤（,retinoblastoma,，,Rb,）,儿童期就发病的眼科恶性肿瘤，猫眼。,遗传型多为双侧发病，发病早，有家族史。,非遗传型多为单侧发病，且在,2,岁以后才发病。,Rb,基因表达产物为,p105-Rb,有,2,种形式,：,磷酸化型（肿瘤细胞中存在）,非磷酸化型,（是活化型，抑制细胞增殖）,p53,基因,“,基因卫士”,人类,p53,基因位于,17p13,，全长,16-20kb,，含,11,个外显子，转录,2.8kb,的,mRNA,，编码蛋白质为,p53,。,p53,蛋白分布于细胞核中，以四聚体形式与,DNA,结合，,磷酸化的,p53,蛋白是活性形式,。,p53,蛋白属于核转录因子。,野生型,p53,是一种抑癌基因，而突变的,p53,有癌基因作用。,p53,基因是迄今为止发现与人类肿瘤,相关性最高,的基因。,糖蛋白的糖基化是目前基因工程中一个未解决的关键问题。不少生物活性物质，当用基因工程方法表达出其肽链后，还不具备活性。因此如何使该蛋白质实现糖基化是正在大力研究中的问题之一。,基因水平,对编码蛋白质的基因进行改造,小改,中改,大改,小改,改变一个或几个核苷酸。,通过基因突变技术，可有目的的改造蛋白质分子中的一,/,几个氨基酸残基,(aminoacidresidual),，借以研究和改善蛋白质的性质和功能。,改造有两种方法：,一、在蛋白质分子中导入二硫键,二、改变蛋白质分子的氨基酸序列,即在蛋白质中替换一个肽段或者一个特定的结构域。,蛋白质的立体结构可以看作是由结构元件组装而成的，可以在不同的蛋白质之间成段地替换结构元件，期望能够使相应的功能也有所转移。,这一方面经常利用的是缺失诱变技术和结构域互换技术。,中改,即所谓从头设计蛋白质分子。从头设计是从氨基酸残基出发，即从一级序列出发，设计制造自然界中 不存在的全新蛋白质，使之具有特定的空间结构和预期功能。,必须指出的是现在对蛋白质分子的从头设计的例子尚不多，只限于几个较小的多肽，其结构完全由,螺旋或,折叠组成，只有当人们完全掌握了一级结构决定高级结构的规律，明白了高级结构与生物功能的关系，才能真正从头设计蛋白质分子。,但用蛋白质工程对限制性内切核酸酶的改造的实例说明，通过蛋白质工程人们完全有可能创造出自然界根本不存在的酶类。,大改,哪个类型的改造更简便,?,为什么？,蛋白质的化学修饰,1.,条件剧烈,2.,无专一性，,3.,对每批蛋白质都要操作,基因操作,必须预先知道是哪个氨基酸或哪几个氨基酸影响了蛋白质的物理、化学或动力学性质。,尽管在基因 中加入新的编码信息较容易，但需检测大量的新蛋白质，从而确定改变的蛋白质是否,具有预期的性状,-,思考题,1.,蛋白质工程概念,2.,定点诱变,3.,为什么定点诱变是蛋白质工程的常用技术？,4.,蛋白质工程与基因工程的区别是什么？,