禽流感核酸检测考核结果汇报.pptx

1核酸检测是禽流感检测的一种重要手段核酸检测是禽流感检测的一种重要手段 快速、灵敏、特异性高多种因素影响检测的结果多种因素影响检测的结果 标本的采集 核酸的提取 反应体系的优化，包括引物探针的设计，试剂的选择 熟练的操作 良好的实验室管理2 2005年以来中国大陆H5N1 人禽流感确诊病例实验室诊断 病例数病例数病毒分离病毒分离核酸检测核酸检测血清学检测血清学检测2222+3 3+2 2+1 1+1 1+32006年核酸考核：参考品制备和网络实验室评价检测。l 制备标准品包括：病毒裂解液、体外转录RNA、样品包括不同检测的灵敏度设灰色检测区、统一配发核酸提取试剂和引物。2007年核酸考核：了解各省禽流感核酸检测能力l 考核标本：病毒裂解液、不同时发放核酸提取试剂和引物 流感网络实验室核酸考核进程流感网络实验室核酸考核进程07年考核目的年考核目的l 深入了解各省份禽流感核酸检测能力的基本情况。l 了解各省禽流感核酸检测工作中可能存在的实际问题。l 了解核酸检测工作的不足并确定下一步的工作重点。4组织形式组织形式l 本次考核由中国CDC发文，国家流感中心执行。l 本次考核定位为基础水平考核，并附有情况调查表。l 本次考核标本发放全国31个省（自治区、直辖市）的流感网络实验室，考核时间为1个月。l 本次考核内容为鉴定10份盲样的型别及亚型。5考核标本的设计考核标本的设计l考核标本共考核标本共1010份盲样，均为病毒裂解液。分别为禽份盲样，均为病毒裂解液。分别为禽流感流感H5N1H5N1标本标本4 4份，份，H9N2H9N2标本标本1 1份，份，H3N2H3N2和和B B型混合标型混合标本本1 1份，份，H1N1H1N1标本标本1 1份，份，B B型标本型标本1 1份，阴性标本份，阴性标本2 2份，份，病毒浓度均控制在易检范围之内。病毒浓度均控制在易检范围之内。lH5N1H5N1标本为病毒原液标本为病毒原液1010-1-1-10-10-4-4的梯度稀释，以此结的梯度稀释，以此结果来判定核酸检测的灵敏度是否合格；果来判定核酸检测的灵敏度是否合格；H3N2H3N2标本混有标本混有B B型，此项内容考核结果判定；阴性标本考核是否有型，此项内容考核结果判定；阴性标本考核是否有交叉污染出现。交叉污染出现。6所用毒株名称：vH1N1:A/Jiangsuxinghua/33/2007vH3N2:A/Jiangsuguangling/316/2007vB:By/Fujianggulou/1774/2007vH5N1：A/Xinjiang/1/2006(H5N1)vH9N2:A/chicken/Foshan/48/98(H9N2)7标本亚型标本亚型AM CT 值值H5 Ct 值值N1 Ct 值值H5 10-117.3216.2719.24H5 10-222.0020.9722.46H5 10-324.9023.8527.46H5 10-427.9027.6930.59H5 10-530.7430.5533.15H118.17H316.68H920.868考核标本的定量结果9 考核标本的制备考核标本的制备1.稳定性检测：稳定性检测：冰盒内室温4天。冰盒内室温4天，后-20度2周。2.可重复性验证：可重复性验证：不同仪器 不同操作人 不同标本抽样 运输和结果提交情况运输和结果提交情况l 本次考核标本发放全国31个省（自治区、直辖市），到截止日期为止除西藏外所有被考核实验室均提交了结果。l 本次考核标本在运输过程中均未出现问题，接受标本时均有干冰存在并无液体漏出。国家流感中心10考核结果考核结果l 22个省份结果正确，l河北、辽宁、黑龙江、云南、贵州五省H3N2+B标本由于实验思路不同未检出B型，黑龙江未检测出H3,用AN2引物检测出N2亚型。陕西没有检出H9只检出了N2。l宁夏、贵州两省H5N1 的10-4稀释度标本未检出。l广西首次H5N1与H9N2均未检出，第二次提交全部正确。l阴性标本均无问题，没有污染情况发生。国家流感中心11考核结果分析考核结果分析完整的标注应当有样品名，引物名，片断大小，Marker梯度等等。12考核结果分析：实验结果标注不清考核结果分析：实验结果标注不清l 很多省份标注不够规范。国家流感中心13考核结果分析考核结果分析国家流感中心14考核结果分析考核结果分析Realtime结果应该有两个图，一个应包含阳性曲线和域值线的情况并标明所用引物和样品名称，另一个应包含机器显示的CT值。15我们发放的禽流感引物和人季节性流感引物在同种亚型之间是可能存在交叉的，7号其实是H3N2标本。考核结果分析：引物交叉情况说明考核结果分析：引物交叉情况说明H9N2的N2引物与H3N2的交叉情况16考核结果分析：引物交叉情况说明考核结果分析：引物交叉情况说明甲型鉴定引物的交叉情况17考核结果分析：鉴定的思路考核结果分析：鉴定的思路国家流感中心18考核结果分析：鉴定的思路考核结果分析：鉴定的思路国家流感中心19考核结果分析：鉴定的思路考核结果分析：鉴定的思路20考核结果分析：考核结果分析：RT-PCR国家流感中心21考核结果分析：考核结果分析：RT-PCR22考核结果分析：考核结果分析：Realtime结果结果l 所提交的结果当中25个省份做了realtime，其中18个省份结果较好主要存在的问题：1.实验体系没有对照。2.对仪器操作不够熟悉。23考核结果分析：考核结果分析：Realtime结果结果24考核结果分析：考核结果分析：Realtime结果结果25下一步工作方向下一步工作方向l 进一步完善和优化鉴定引物。l 进一步优化反应体系。l 优化实验和结果判定方案。26实验室管理实验室管理PCR仪器仪器配置情况配置情况常用试剂及耗材常用试剂及耗材供应商情况供应商情况 个人防护设备个人防护设备检测标本的内容检测标本的内容及检测方法的应用及检测方法的应用调查结果调查结果问卷调查情况问卷调查情况1.各省级各省级CDC PCR仪器配置情况仪器配置情况v仪器设备非常好仪器设备非常好上海市、浙江省、广东省（PCR仪三台，Real-time PCR仪两台）v仪器设备较好仪器设备较好黑龙江、安徽、江西、甘肃、宁夏回族自治区（两种类型的PCR仪各有两台)v仪器设备充足仪器设备充足具备PCR仪、Real-time PCR各一台仪器名称仪器名称N0台台1台台2台台3台台nnnn常规常规PCR仪仪Realtime PCR仪仪3030103.30101733.356.7161353.343.330100表1 各省级CDC PCR仪配置情况2.各省级各省级CDC常用试剂及耗材供应商情况常用试剂及耗材供应商情况v流感中心推荐使用的试剂和耗材流感中心推荐使用的试剂和耗材v常用试剂（常用试剂（TakaraTakara）vPromegaPromega、QiagenQiagen（常用）（常用）vRocheRoche、SigmaSigma的试剂（发达省份）的试剂（发达省份）供应商名称供应商名称Nn%RocheQiagenSigmaInvitrogenPromega其它其它30303030303063064148201006013.346.726.7表2各省级CDC常用试剂及耗材供应商情况供应商名称供应商名称NnAxygenGrienerCostar其它其它303030302869493.3203013.3表3各省级CDC常用耗材供应商情况3.个人防护设备个人防护设备v各省级各省级CDCCDC个人防护设备基本齐全个人防护设备基本齐全v个别省级个别省级CDCCDC缺少个别防护设备缺少个别防护设备如 有的CDC缺少N95口罩，有些省缺少面罩。个人防护设备个人防护设备Nn连体防护服连体防护服护目镜护目镜面罩面罩防护鞋套防护鞋套N95口罩口罩3030303030302925302910096.783.310096.7表4 各省级CDC个人防护设备4.检测标本的内容及检测方法的应用检测标本的内容及检测方法的应用v辽宁、上海、山东、湖南辽宁、上海、山东、湖南4 4个省级个省级CDCCDC除了对人类标本样品除了对人类标本样品进行流感病毒检测之外，还对动物来源的样品进行检测。进行流感病毒检测之外，还对动物来源的样品进行检测。v通过对各省级通过对各省级CDCCDC禽流感检测方法应用的调查可以反映出禽流感检测方法应用的调查可以反映出各省级各省级CDCCDC日常检测工作的内容。广西壮族自治区日常检测工作的内容。广西壮族自治区CDCCDC日常日常工作的内容仅为快速流感检测，而河北、上海、浙江、河工作的内容仅为快速流感检测，而河北、上海、浙江、河南、广东南、广东5 5个省级个省级CDCCDC除了调查表中提到的除了调查表中提到的4 4个检测方法的个检测方法的应用外，还分别进行不同类别的检测，如爆发疫情的检测、应用外，还分别进行不同类别的检测，如爆发疫情的检测、人流感病毒亚型的鉴别、呼吸道病毒鉴别诊断、不明原因人流感病毒亚型的鉴别、呼吸道病毒鉴别诊断、不明原因肺炎病例检测、环境标本检测。肺炎病例检测、环境标本检测。检测内容检测内容/检测方法的应用检测方法的应用Nn检测内容检测内容 -检测人类标本检测人类标本 -检测动物标本检测动物标本检测方法应用检测方法应用 -禽流感疑似病例标本检测禽流感疑似病例标本检测 -有病禽接触史病人的监测有病禽接触史病人的监测 -快速流感检测快速流感检测 -流感病毒亚型检测流感病毒亚型检测 -其它类别的检测其它类别的检测3030303030303030429192826510013.396.763.393.386.716.7表5 各省CDC检测标本内容和检测方法应用5.实验室的管理实验室的管理v通过对生物安全工作、实验分区、标准操作规程以及通过对生物安全工作、实验分区、标准操作规程以及实验相关信息记录等实验相关信息记录等4 4个方面考察各省个方面考察各省CDCCDC实验室管理实验室管理的情况。的情况。调查方面调查方面Nn生物安全工作生物安全工作 -生物安全水平生物安全水平 BSL-2 BSL-3 -生物安全说明或生物安全说明或SOP -实验人员定期培训实验人员定期培训 -员工上岗资格认证员工上岗资格认证 -指定人员负责生物安全指定人员负责生物安全3030303030302553030303083.316.7100100100100表6 各省CDC实验室管理情况调查方面调查方面Nn实验分区实验分区 -样品处理和检测有独立实验室样品处理和检测有独立实验室 -样品接收有独立房间或指定区域样品接收有独立房间或指定区域 -体系配制有独立房间或指定区域体系配制有独立房间或指定区域 -核酸提取有独立房间或指定区域核酸提取有独立房间或指定区域 -PCR产物检测有独立房间或指定区域产物检测有独立房间或指定区域有如下操作规程有如下操作规程 -病毒病毒RNA提取提取 -RT-PCR检测检测-核酸电泳检测核酸电泳检测 -核酸电泳核酸电泳 -污染控制污染控制303030303030303030301429303030303030302983.316.710010010010010010010096.7调查方面调查方面Nn实验相关信息记录实验相关信息记录 -检测日期检测日期 -样品编号样品编号 -试剂货号试剂货号 -试剂保质日期试剂保质日期 -实验操作人员签名实验操作人员签名 -共同检测人员签名共同检测人员签名不同标本保存温度得当不同标本保存温度得当 -原始样品原始样品 -病毒核酸病毒核酸 -cDNA -PCR产物产物 303030303030303030303030302930303030302910010010096.7100100100100100100存在个别的问题存在个别的问题1 1PCR仪器设备不全仪器设备不全2 2检测方法应用内容少检测方法应用内容少3 3实验室分区不明确实验室分区不明确从这次问卷调查的结果看，各个省级CDC网络实验室的总体水平良好，但是仍有一些问题存在。调调 查查 总总 结结v本次问卷的调查的目的在于对各省级本次问卷的调查的目的在于对各省级CDC流感流感/禽流感检禽流感检测网络实验室的仪器配置，试剂和耗材的使用、个人防护测网络实验室的仪器配置，试剂和耗材的使用、个人防护设备、检测工作内容及应用，以及实验室的管理等方面进设备、检测工作内容及应用，以及实验室的管理等方面进行了解和促进。行了解和促进。v作为流感作为流感/禽流感检测的网络实验不仅需要良好的是实验仪禽流感检测的网络实验不仅需要良好的是实验仪器及防护设备的配置，来保证日常工作快速、安全的运转，器及防护设备的配置，来保证日常工作快速、安全的运转，同时也需要在实验室的管理上进行提高，从而使得检测结同时也需要在实验室的管理上进行提高，从而使得检测结果的高标准和可重复性。果的高标准和可重复性。NIC 推荐推荐one-step PCR引物更新引物更新目的基目的基因因原使用引物原使用引物新推荐引物新推荐引物引物序列引物序列甲型AmFluA-M-F65 FluA-M-R400 M 336bpFluA-M-F173 FluA-M-R382 AM 209bpFluA-M-F30FluA-M-R2645-TTC TAA CCG AGG TCG AAA CG-35-ACA AAG CGT CTA CGC TGC AG-3H5H5HA-F920H5HA-R1138 H5HA-F248H5-R6475-GTG ACG AAT TCA TCA ATG TRC CG-3 5-CTC TGG TTT AGT GTT GAT GTY CCA A-3N1AN1-F550AN1-R1164AN1-F580AN1-R9185-TGA AGT ACA ATG GCA TAA TAA CWG ACA C-35-CCA CTG CAT ATA TAT CCT ATT TGA TAC TCC-3注：原推荐引物仍可使用内参内参RNP（ribonuclease P：核糖核酸酶）序列：核糖核酸酶）序列43基因引物和探针序列RNPRNP-Forward RNP-Reverse5-AGA TTT GGA CCT GCG AGC G-35-GAG CGG CTG TCT CCA CAA GT-3RNP-probe5-TTC TGA CCT GAA GGC TCT GCG CG-3sampleNCPCRNPAmsampleNCPCRNPH5sampleNCPCRNPN1Realtime PCR 检测的内参检测的内参44v标本接收分装、核酸操作、标本接收分装、核酸操作、PCR反应体系配制、反应体系配制、电泳操作应当在不同房间进行。不同房间使用的电泳操作应当在不同房间进行。不同房间使用的防护服、移液器和枪头不应混用，标本分装和防护服、移液器和枪头不应混用，标本分装和PCR反应体系配制的区域不应接触到核酸，并有反应体系配制的区域不应接触到核酸，并有单独的实验防护用品。单独的实验防护用品。v一次实验过程中按从清洁区到核酸区的顺序进行，一次实验过程中按从清洁区到核酸区的顺序进行，从污染区去清洁区应更换外防护服。从污染区去清洁区应更换外防护服。v怀疑有核酸污染的区域需要用水大量擦洗台面地怀疑有核酸污染的区域需要用水大量擦洗台面地面及仪器表面，保持通风。面及仪器表面，保持通风。v怀疑有核酸污染的试剂耗材不应继续使用。怀疑有核酸污染的试剂耗材不应继续使用。45核酸检测防污染几点建议核酸检测防污染几点建议