细胞实验室规章制度-SCUT.docx

细胞实验室规章制度

一、细胞生物实验室准入细则
1. 细胞生物学实验需由申请人提交书面报告 (附件 1)， 经导师同意、 签字后递交到细胞生物实 验室管理人员方可进行；每次可申请实验的有效期为一个学期及其后的一个假期，有效期结 束，如需继续实验，需要再次提交书面报告；
2. 没有经过实验室内细胞培养培训的学生，需接受培训并考核通过后才能正式开始实验; 有细 胞培养基础则可选择是否参加，但必须参加考核(需填写递交附件 2)；培训由实验室统一进 行，每学期一次，时间约 1 个月，培训结束后统一组织考核，考核不合格者可在两周后重新 约时间进行考核，若三次考核不通过，需重新进行培训直到考核通过为止；培训申请需提交 申请表格(附件 3)；
3. 以上表格需要在新学期的第一周内提交， 错过时间的学生， 需要等待下一次申请或培训时间；
4. 实验室统一分配物品柜、培养箱、冰箱等资源的使用位置，安排值日，实验人员应服从统一 安排(有特殊情况者可进行协调)，并遵循实验室规章制度；自备实验服和拖鞋；
5. 每次实验结束(附件 1 中申请的结束时间)，收到管理人员通知三天内，需自觉办理出细胞 房手续，归还柜钥匙，清理培养箱及冰箱内物品，然后由管理人员作相关检查。未经上述程 序， 直接离开的， 则该学生导师所带的其它学生 (或该生所在的课题组) 暂停所有细胞实验。

二、常规操作
1. 穿着细胞房专用实验服。自己的白大衣，可挂在门外的衣柜上；
2. 穿着专用拖鞋。进入细胞房前需先脱鞋置于鞋架上，摆放整齐，更换各自在细胞培养室内的 专用拖鞋，尽量避免在缓冲间走动、停留，细胞房专用工作拖鞋不得穿出细胞房，细胞房专 用拖鞋每个月组织清洗一次；
3. 进入细胞房后请随手关门， 禁止把门栓拧出阻止门自动锁上， 缓冲间的两扇门不可同时开启。
4. 不得在细胞房内喧哗、打闹、饮食，不得随便乱动他人物品。公用物品使用完毕后，必须清 洁后放回原处。
5. 不得随意使用他人物品(包括试剂、耗材、器械等)，如需使用须征得对方同意。
6. 每张超净台最多可 2 个人同时使用。尽量避免在内长时间逗留、交谈；
7. 细胞房公用实验耗材、仪器、试剂等均不可随意带出(包括移液器)。严禁将与细胞操作无 关的试剂、耗材带入细胞房内，必要物品带入后需用75%酒精棉擦拭，进行表面消毒；使用 完毕后需要及时带离细胞房；
8. 放置于冰箱、培养箱等实验室公共场所的个人实验用品(如试剂、细胞等)，必须注明所有 者姓名、物品名称、配制时间、有效时间等；若发现标注不规范，群上公示 24 小时后未做 出处理则丢弃处置。
9. 实验完毕后，立即清理实验垃圾：废液倒入废液收集瓶，其余的全部置于垃圾箱。计数板和 盖玻片冲洗干净，用纸巾吸干后放回原处。

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10. 实验室提供的实验细胞株不能带离本实验室， 如确有需要，由课题负责人或导师向实验室管 理人员提出要求。
11. 为维护良好的实验环境，严禁带无关人员及未经培训的人员进入，如确实需要，必须经实验 室负责人同意；严禁携带非实验用品和危险物品入内，如确实需要，必须经实验室负责人同 意。
12. 每周组织一次实验室大扫除，所有进入细胞实验室实验的学生分组，按照值日表进行。
三、仪器的使用
1. 首次使用仪器时，必须征得实验室管理人员同意后，在其指导下熟练掌握并通过考核后，方 可进行独立操作；仪器使用时严格按照操作规程进行。
2. 每次使用仪器后，都要做好仪器使用情况记录。开始使用时或使用过程中出现故障，应及时 向管理人员报告，不能自行拆卸修理。如果不报告，将取消其仪器使用资格。
3. 要爱护仪器，使用中细心操作，防止溶液污染仪器，一旦污染，应及时通知负责老师并及时 处理；同时要作好自身防护工作，以免中毒、受伤。

四、培养箱使用规范
1. 恒温培养箱的电源永远保持接通显示状态，正常显示为： 37℃ 5% CO2；
2. 从培养箱取放物品前，需用酒精清洁双手(或手套)，尽量缩短开门时间和减少开门次数。 ※培养箱中的空气是经过过滤的洁净空气。长时间敞开或频繁开关培养箱，容易造成污染。
3. 培养瓶、皿放入培养箱前，先用酒精消毒表面，并稍等至酒精挥发后再放入，以免培养箱内 滞留过多乙醇蒸气。
4. 2-3 人共用一层培养箱，按预定位置摆放培养器皿，方便查找，以免长时间敞开培养箱。
5. 普通培养中的细胞，若非实验特别需要，通常每瓶 /板细胞每天只需要观察生长状态一次， 故 2 人以上共用的细胞，建议约好时间一起观察。
※频繁将细胞拿出观察，容易给培养箱造成污染，同时也会影响细胞生长条件的恒定。
6. 培养箱内所养的细胞须清楚注明细胞名称、培养人姓名和培养日期， 禁止将细胞置于细胞培 养箱内不管；若发现未标注或标注不清的，群上通告一次后仍未作处理的，隔日将作丢弃处 理；
7. 未经许可，不得随便使用和丢弃他人细胞、其他实验室的试剂、耗材，如需使用，务必得到 持有人许可；否则，取消该生细胞实验资格，并在中心通报批评。

五、显微镜使用规范
1. 显微镜使用前，可用酒精棉从中间至周围擦拭载物台。
2. 显微镜的使用：调节光亮度的旋钮调到最小(防止瞬间电流过大导致灯泡烧毁) →打开开关 →使用 →调节光亮度的旋钮调到最小 →关闭开关；注意事项： A：要注意不要划伤镜头； B： 如果有液体等东西弄污了镜头或其他部位，要立即用擦镜纸或棉球擦干，用无水乙醇清洁。
3. 离开细胞房时或较长时间不需使用时，及时关上电源，延长灯泡寿命；较短时间不用时，可

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调节光亮度的旋钮调到最小，尽量避免频繁开关显微镜电源。
4. 每次实验完毕后，必须确保显微镜已关闭后，方可离开细胞房。对于两台大型荧光显微镜， 使用完毕后必须进行使用登记。
六、超净台相关操作规范
1. 为避免使用时间冲突，超净台使用遵循预约原则。使用前需提前在细胞房门前的预约本上依 次申请预约，注明使用人、使用时长等。超过预约时间 30 分钟仍未使用者视为放弃本次预 约，需重新预约；
※无预约者若有必要在他人预约时段内使用， 需先征得预约者的同意，否则应无条件让出工 作台，以免耽误他人实验。
2. 实验开始前 30 分钟，将实验所需的器械、耗材、消毒棉球、试管架等物品放入台内，超净 台内不得放置与本次实验无关物品，关上玻璃门打开紫外线照射半小时后，关闭紫外灯，打 开工作台风机和日光灯开始工作。紫外灯照射时间不得超过 30 分钟；为延长紫外灯管的使 用寿命和加快超净台使用的轮转速度，紫外灭菌时间超过 45 分钟仍未使用者(从预约时间 开始计算)，除特殊情况外，视为放弃超净台的使用，需重新预约，后面预约的人员可优先 使用该超净台。
3. 实验顺序：先做绝对无菌的实验，再做可疑污染的实验，最后做污染的实验；其次考虑先做 生长状态差的细胞，再做生长好的细胞，最后做永生株细胞；
4. 点燃酒精灯前需检查瓶中酒精是否足够，液面应占瓶高 1/3-2/3。
※消毒用 75%的酒精，分析纯无水乙醇或分析纯 95%乙醇配制；酒精灯用 95%的工业酒精。 向喷壶或灯内添加酒精时请留意。
※酒精和酒精棉球由值日生负责补给，发现细胞房内存放量不足时请及时通知值日生。
5. 超净台中应摆放废液杯和废品杯各一只，分别存放废液和固体废物； 实验结束后将杯内垃圾 分别倒入水池(液)或垃圾桶(固)中，并冲洗晾干备用。
※请将废弃的枪头、管子内的残留液体打(倒)入废液杯后再弃入废品杯中，以免垃圾桶内 留有大量培养液滋生细菌。
七、实验完毕后的相关操作规范
1. 实验完毕后，立即清理实验垃圾：废液倒入废液收集瓶，其余的全部置于垃圾箱。计数板和 盖玻片冲洗干净，用纸巾吸干后放回原处。
2. 可回收的移液管、离心管、培养瓶皿等，放入装有清水的塑料箱中浸泡，箱内需有足量的清 水以没过浸泡物品。
※可回收器皿尽可能先取出棉花、撕掉标签纸，并经过初步涮洗后再放入箱内，尤其是培养 瓶或血清管中有大量高营养的液体残留时，容易使箱内的清水长菌。
※保证浸泡的瓶、管内完全被清水充满，避免在存在大量空气的情况下被压到箱底。
3. 装培养液的瓶子、 配培养液的器皿勿放入塑料桶内浸泡！ 应由使用者本人及时清洗晾干后放

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回柜中备用。
※因桶内物品通常要浸泡几小时以上才送去清洗，此时细菌可能已在桶中生长并释放内毒 素。细菌内毒素很难通过常规湿热灭菌步骤去除干净，即使干烤也不能保证其完全失活。内 毒素对细胞生长及多种实验均有较大影响。
4. 实验室内不得存放个人物品、耗材，实验完毕后应及时转移至个人储物柜中。

八、值日生工作职责
1. 每周值日生值日时间从周六开始，至下周五结束, 每天早上 8:30 至下午 6:00。
2. 值日周开始时需做的事情：在周六、日或之前，配制消毒用的 75%的酒精，制作酒精棉球， 给细胞房内添加足够的 95%乙醇供酒精灯使用，供未来一周的使用。
※75%的酒精可用750ml 95%的酒精加去离子水 200ml 或 750ml 无水乙醇加去离子水 250ml 配制而成。
3. 值日周内每天需做的事情：
a) 值日生每天负责洁净室(309-2)、洗刷间(309- 1)和生化检测室(311- 1 和 311-2)的检 查和锁门工作。 若当天有事或有人需实验至较晚的时间， 值日生需要交接好， 做到人离门 锁钥匙次日交还值日生保管；锁门前，填写“值日工作登记本”，值日生本人或吩咐最后 离开细胞房的人在确保室内无人后开启臭氧发生器，对细胞房进行消毒，并锁好大门。
b) 每天早上把适量次氯酸钠加入废液收集瓶，晚上清空。
c) 每天早上，更换垃圾袋；检查培养箱内水量是否足够(切记给培养箱换 MilliQ 水，保证 水质清洁)；补充酒精棉球；给酒精灯补充酒精；检查液氮罐液氮存量，存量不足 1/2 时 应及时通知负责人；早上 11:00 时进行高温高压消毒灭菌，完毕后转移到烘箱；检查细胞 房内酒精等公用试剂、耗材的储备情况。
4. 值日周结束前需完成的事情：星期一和星期四清洗浸泡在洗涤液中的玻璃器皿、离心管。星 期五或前后一天内打扫细胞房。包括拖地，擦桌子、清洁和整理抽屉，擦超净台、冰箱及桌 上的仪器，给水浴锅加水或换水，洗细胞房专用的实验服和拖鞋。
5. 每 2 周清洁一次培养箱：先将培养箱中的物品取出暂存于超净台内， 将培养箱内的不锈钢板 取出，用酒精棉球清洁钢板和培养箱内壁，利用超净台紫外灯照射横板；打开培养箱清洁内 壁时动作要迅速，避免长时间敞开门使得大量不洁净空气进入，缩短过滤器的寿命；用紫外
灯照射培养箱内部 15min，手提紫外灯放入培养箱前要用酒精棉擦拭干净。
九、罚则
1. 违反以上细则 1 次，给予提醒和口头警告；
2. 违反以上细则 2 次，实验室通报批评及通知导师；
3. 违反以上细则 3 次，暂停细胞实验、并取消细胞实验设备预约资格一周；
4. 违反以上细则 4 次或以上，取消其细胞实验资格，需要重新进行培训，重新了解实验室相关 规范细则，在重新取得合格认证前不得进入实验室进行细胞实验。

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细胞培养室设备操作规范

1 ．无菌观念和无菌操作原则：
无菌观念 无菌的： A：培养瓶、皿、离心管的内部；
B：巴氏吸管的里面和尖端 2/3，一次性吸管；
C：手术器械的头部；
D：培养液、试剂；
E：超净工作台内吹出的空气已过滤无菌。
有菌的： 瓶、 皿的外面， 器械的手持部分， 手、 台面、 吸管上部外面手持部分等。 无菌操作原则：
① 无菌部分接触有菌部位，即刻丢弃；
② 培养瓶在离开超净台前要拧紧， 再放入培养箱。 无滤膜的培养瓶， 则放入前要旋松 1/4 圈， (以便透气)再放入；
③ 所有试剂分装时要注意无菌操作；
④ 标本不一定无菌，做之前要用含抗生素，抗霉菌药的液体冲洗，一般原代培养污染的 可能性最大；
⑤ 培养箱内的空气接近无菌，但不是绝对无菌。

2．移液枪： 使用前要先熟悉枪的性能及不同电量和不同吸力档的吸液力度。一般一把电力充足的 枪，在最低吸力档的位置就有很强的吸力， 在使用时要轻扣吸液按扭，缓慢地吸取液体，严禁 液体超过吸管的禁止标志。特别是使用小吸管如 1ml 吸管时更要小心(不能将吸管插到液体 的底部，而是要在液面稍下方缓慢的吸液)。插着吸管的移液枪严禁倒置，应侧放或将吸管拔 下后放回台面。平时要注意移液枪的电量，当工作时移液枪的手持部位的指示灯(红)闪烁， 表示电池低电量，要注意充电。充电原则：深放深充，最好是过夜充。每个工作室内的移液枪 不能相互混用。

3．计数板：血球计数板在使用前先用擦镜纸擦干净，动作要轻柔，避免出现划痕。方法：先将 75% 的乙醇湿润，用擦镜纸轻擦计数板的网格面，直到镜下观察干净为止。之后再擦盖玻片， 盖上，镜下观察，干净为止。使用完毕要立刻冲洗干净，晾干，备用。在任何时候都严禁将计 数板重叠放置。

4 ．普通冰箱： 普通冰箱的电源永远保持接通显示状态。 在放入或取出物品后要立即迅速关上。 严 禁长时间开启冰箱门， 严禁将冰箱中保存的物品长时间取出， 以免影响试剂效价， 从而影响实 验结果。每半年检测冰箱内温度。

10．离心机：开机→平衡 →放入离心管 →调节转速 →调节离心时间，开始离心。注意：离心管一 定要配平； 离心时一定要关盖； 如有液体等物质污染离心机要立即吸干， 并用 80%~90%的乙 醇清洁。定期清洁(每 15 天一次)。

11． 水浴箱： 水浴箱只能使用去离子水， 箱内的水面一定要高过加热管， 定期换水 (30 天换一次)， 换水时要清洗水浴箱，洗时注意一定要保持控制面板干燥，以免短路损坏水浴箱。

12 ．橡皮吸头的保养：不宜在紫外线下照射，禁用乙醇等有机溶剂擦，在阴凉干燥处保存。

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13 ．配液和分装： A：严格无菌操作； B：同一根吸管不能用于两种不同的液体； C：准确吸出液 体，避免吸出后又打回去。

14 ．如何避免细胞间的交叉污染：
传播途径：空气、吸管、培养液。
操作注意事项：
⑴同一个吸管，不能连续用于 2 种不同细胞的培养瓶/皿。
⑵接触过有细胞的瓶/皿的吸管，不能再接触其他培养液。
⑶在超净台内，最好同一时间只操作一种细胞的培养瓶。
⑷吸管尾部一定要塞有棉花。
操作顺序：先：生长慢的细胞； 再：生长快的细胞； 后：永生株细胞

15． 超低温冰箱： 超低温冰箱的电源永远保持接通显示状态， 正常显示为-75℃~ -85℃； 高于-70℃ 则自动报警。使用原则：打开 →取出或放入物品 →立即迅速关闭，开启箱门时间一定不能超 过 20 秒(除霜时不能超过 2 分钟)，尽量减少开门次数。

16． CO2 压力流量表：压力表表示CO2 瓶里的气体量，压力范围为0~25；一瓶满的气体其压力为 5~12 左右，当压力表显示小于2 时就要注意要更换气瓶。流量表的范围为： 0~1 是气流量的 指示标志，我们要求的气体流量为 0~0.2 之间，不能超过此范围。调节方法见实际操作。

17 ．液氮：应根据实际细胞贮量，确保液氮将细胞完全淹没。操作时一定要注意安全，避免冻伤， 防止爆炸。
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