细胞培养及材料细胞毒性检测-PPT课件.ppt

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culture),：,把提取的组织用机械或消化的方法分散成单个细胞悬液，后进行培养，增殖。,2.,基本概念,肿瘤,胚胎,成体,粗切,消化,细切,修切,细胞培养,组织培养,器官培养,5,细胞培养的优点,活细胞,便于观察检测,条件可控,均一性,便于人工筛选,6,培养细胞与体内细胞的差异,失去原有组织结构和形态，趋向单一性,分化减弱,可能获得不死性,7,体外培养细胞的生长类型,贴壁型：动物的正常细胞,悬浮型：血液淋巴细胞、肿瘤细胞、植物细胞,固定化培养,8,来源：由,中胚层间充质组织起源,的组织,如：真正的成纤维细胞,心肌，平滑肌，成骨细胞，内皮细胞,形态：,似体内成纤维细胞,的形态,胞体梭形,或不规则三角形,胞质向外伸出,2,3,个,长短不等的突起,中有卵圆形核,成纤维细胞样细胞,9,生长特点：,排列成,放射状,，漩涡状,并不紧靠连成片,，,细胞,细胞接触易断开而,单独行动,10,培养细胞的生长和增殖过程,原代细胞：从机体取出后立即培养的细胞,原代培养：将从体内取出的细胞进行培养,传代培养：从原代培养细胞继续转接培养,传代细胞：在体外培养条件下持续传代培养的细胞,11,细胞培养的工作原则,无菌,无毒、生物相容性,清洁的环境,品质良好的细胞来源，培养基配制使用高纯度药品和去离子水,有标准化的工作方法,培养用的液体极多，应由专人负责，配制浓度准确，所有配好的溶液瓶上都要标明名称、浓度、消毒与否和制备日期等,一切培养用品都要有固定的存放点，避免杂乱无章，其中尤其重要的是：培养用品与非培养用品应严格分开，已消毒品与未消毒品应分别存放,12,3.,细胞培养的基本条件,无菌条件,：净化工作室，风淋室，传递窗，高效过滤器，洁净层流罩，生物安全柜，,超净工作台,，紫外灯，电热干燥箱，滤器，高压灭菌器，抗生素,细胞生长条件,：培养板，培养瓶，,CO,2,培养箱,，培养基，血清,细胞检测条件,：,倒置显微镜,，酶标仪，微孔板震荡器，高速离心机，移液器,细胞保存条件,：液氮罐，超低温冰箱,13,常用仪器与设备,超净工作台,高压蒸汽灭菌器,过滤除菌装置,倒置显微镜,水纯化装置,恒温培养箱,电热干燥箱,离心机、天平、水浴、摇床,液氮罐,冰箱：,4,、,-20,、,-80,14,细胞培养器材,移液器,移液管,吸管,培养瓶：,25cm,2,、,75cm,2,、,150cm,2,培养皿：,30,、,60,、,120,毫米,多孔培养板：,4,、,6,、,24,、,96,孔,离心管,冻存管,15,16,基础培养基,80,95,血清,5,20,青、链霉素 各,100U,ml,完全培养基的组成,17,天然培养基：,血清,血浆,组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）,培养基,合成培养基：,根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。,包括四大类物质：无机盐、氨基酸、维生素、碳水化合物,目前常用培养基：,RPMI-1640,、,DMEM,、,M199,、,MEM,、,人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。,18,常用血清,胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、,马血清等,优质血清的标准,透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、,病毒污染。,血清的灭活（消除补体活性）,56,，,30,分钟。,血清的消毒：过滤除菌,血清的使用,19,其他细胞培养用液,水：新鲜的三蒸水或去离子水,平衡盐溶液,主要由无机盐和葡萄糖配制而成,作用：维持渗透压、缓冲和调节酸碱度,常用的缓冲液：,生理盐水,PBS,Hanks,液,（,D-Hanks,常用于配制胰酶溶液）,20,抗生素溶液,通常是青霉素和链霉素联合使用，俗称,“,双抗溶液,”,。,配制,具体操作均在超净台内完成。青霉素是,80,万,U,/,瓶，用注射器加,4ml,灭菌双蒸水。链霉素是,100,万,U,/,瓶，加,5,ml,灭菌双蒸水，即每毫升各为,20,万,U,。,使用时溶入培养液中，使青、链霉素的浓度最终为,100,U/ml,。,庆大霉素：使用终浓度为,100,U/ml,，广谱、稳定。,21,主要作用：,水解与赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，使贴壁细胞从瓶壁上脱落并使细胞分离。,常用浓度：,0.25%,用无,Ca2+,、,Mg2+,的,PBS,缓冲液或,D-Hanks,配制，用滤器过滤除菌。,消化时间：,用含血清培养液终止其对细胞的消化作用,。,胰蛋白酶溶液,消化液：胰蛋白酶溶液、,EDTA,溶液、胶原酶溶液,22,物 品,湿 热,干 热,过 滤,紫 外,化学,气体,消毒剂,电离,辐射,培养室,工作台,玻璃,制品,金属,器械,塑料,制品,橡胶,制品,培养,用液,布类,棉类,23,贴附生长型细胞,必须贴附于底物才能生长的细胞。从形态上大体分为上皮细胞型及成纤维细胞型，还有一些难以确定其稳定形态的细胞。,4.,细胞培养的基本方法,粘着、粘附,（,attachment,）,铺展,（,spreading),24,得到细胞,1,）取材 切割,组织块培养法,消化培养法,2,）直接购买 培养,（原代培养）,传代,体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。,培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2,或,l:3,以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。,弃去旧培养液 清洗 加入消化液 吸弃消化液 加入培养液 吹打分散细胞 分装稀释细胞,补加培养液 继续培养,25,接种数量为,510,4,810,5,个,/ml,。,传代密度太低，细胞容易死亡，表现出细胞在达到增长前有较长的滞留期。,培养液由于,pH,下降而呈现黄色，表明细胞已经达到最大密度需要换液或进行传代培养。,如果是单层贴壁的细胞，等长满培养瓶表面，即可进行传代。,传代注意事项,26,游离期,悬浮，胞质回缩，全部细胞变为圆球形。,吸附期,贴附底物，一般,24,小时内贴壁。,潜伏期,此时细胞有生长活动，基本无增殖。,细胞株潜伏期一般为,6,24,小时。,对数生长期,细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。,停止期（平台期）,细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂。,机制：接触抑制、密度依赖性,细胞传代的增殖生长过程,27,细胞观察,肉眼观察：培养液的颜色和透明度,显微镜观察,生长良好的细胞：细胞透明度大，折光性强，轮廓不清,生长状态不良的细胞：细胞轮廓增强，细胞折光性变弱；胞质中出现空泡、脂滴和其他颗粒状物质；细胞之间空隙增大；细胞形态不规则，甚至失去原有细胞的特点，产生圆缩脱落；有时细胞表面及周围出现丝絮状物,28,细胞计数,每毫升细胞数,血细胞计数板,29,细胞生长的指标,细胞生长曲线,贴壁率,有丝分裂指数,(MI),：分裂相数量占全部细胞数量的百分比,细胞群体倍增时间,四唑盐,(MTT),比色法,标记胸腺嘧啶脱氧核苷,(,3,H-TdR),掺入量,30,细胞活力测定,细胞活力：总细胞中活细胞所占的百分比,台盼蓝法,四唑盐,(MTT),比色法,荧光素双乙酸酯法,(FDA),31,四唑盐（,MTT,）比色法,MTT,比色法的原理：,活细胞,中琥珀脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的,蓝紫色,产物甲臢（,forma,za,n),，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。,二甲亚砜（,DMSO,）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的,formazan,量成正比。,甲臢染料在,A570nm,处产生吸收值，用酶标仪测定,A,值。,32,细胞培养的其他指标,细胞大小：显微测微计法,细胞重量：称重法,鲜重,干重,33,细胞固定与染色,细胞固定,苏木精,-,伊红染色,Giemsa,染色,Feulgen,染色,考马斯蓝染色,免疫法,细胞核染色：,Hoechst,、,DAPI,34,细胞污染,混浊、,pH,异常改变、细胞外形模糊、漂浮的集落,细胞出现增殖缓慢或死亡,化学物质的污染,非同种细胞污染,微生物污染：细菌、真菌、支原体、病毒,5.,细胞培养的污染和检测,35,细菌污染,培养液变黄，出现浑浊,镜下可见圆球状颗粒漂浮,预防和处理：青霉素、链霉素,36,真菌污染,培养液一般不浑浊,白色或黄色小点漂浮于培养基表面,光镜观察到菌丝,预防和处理：抗真菌剂,37,支原体污染,可透过滤膜,无细胞壁,细胞营养液仍清亮但变黄，细胞生长变缓，部分细胞发生脱落，细胞间隙可见铺满,细沙样小点,。,38,污染的控制,预防,重新培养,鉴别,清除：抗生素、加温、支原体特异性血清、共培养法、重新克隆法、动物体内接种除菌法,防止交叉污染,39,6.,细胞冻存与复苏,慢冻快融,低温保护剂：,10%,的甘油或二甲亚砜,DMSO,细胞深低温保存的基本原理：,-80,以下时，细胞内的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。,40,慢冻快融,当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。,如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反，冰晶很大，大冰晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。,41,7.,细胞的管理及保藏,对已建成的各种细胞系或细胞株习惯上都给以名称；细胞的命名无严格统一规定，大多采用有一定意义缩写字母或代号表示。但不论什么形式，均不宜太长，以便记忆和了解。,HeLa,：为供体患者的姓名,(Henrietta Lacks,，来源于宫颈癌,),CHO,：中国仓鼠卵巢细胞,(Chinese Hamster Ovary),NIH/3T3,：美国国立卫生研究所,(National Institute of Health),建立,每,3,天传代一次，每次接种,310,6,细胞毫升。,42,细胞库的建立,主细胞库,生产用细胞库,原始细胞库,主细胞库,生产细胞库,43,细胞保存机构,ATCC(American Type Culture Collection)www.atcc.org,ECACC(European Collection of Cell Cultures),www.hpacultures.org.uk,中国科学院典型培养物保藏,委员会细胞库,44,8.,细胞毒性检测,参照,GB/T16886.5-2003,（或,ISO10993-5,）,，医疗器械生物学评价,-,第,5,部分：细胞毒性试验体外法规定的方法进行检测。,45,样品准备 辐照灭菌,将待检材料,在相应条件下浸提（不含血清的培养基中在,37,环境下浸提,24h,）,细胞计数,接种于,96,孔培养板，置,CO,2,培养箱,37,培养,24h,后，弃去原培养液。空白对照组加入新鲜细胞培养液，供试品加入样品浸提液（加血清），置,CO2,培养箱继续培养（至少,24h,）,于设定培养时间后置显微镜下观察细胞形态，每孔加入,20L,质量浓度为,5g/L,的,MTT,溶液，继续培养,4h,后弃去孔内液体，加入,200L DMSO,，在酶标仪,570 nm,波长下测定吸光度，计算相对增值率（,RGR,）。,细胞毒性评价,:,根据下式计算相对增殖率,(Relative growth rate,RGR),。,RGR=,实验组,OD,均值,/,阴性对照组,OD,均值,100%,级别,相对增值率,/%,0,100,1,80-99,2,50-79,3,30-49,4,0-29,浸提液细胞毒性,46,直接接触细胞毒性,将样品放入培养器皿内,从细胞悬浮液中吸取等量的悬浮液，注入与试验样品直接接触的每只器皿里,合适条件培养（最少,24h),如有需要可换液,固定细胞（戊二醛稀释液）,梯度脱水,临界点干燥,扫描电镜观察,47,谢谢！,48,