本科毕业论文---油茶叶多酚和黄酮综合提取工艺的优化.doc

JINGCHU UNIVERSITY OF TECHNOLOGY

本科毕业论文

油茶叶多酚和黄酮综合提取工艺的优化

学 院： 生物工程学院
专 业：
班 级： 2010级
学 号： 2010*********
学生姓名：
指导教师：

2014年4月

目录
中文摘要 1
英文摘要 2
1 实验材料与方法 5
1.1实验原料 5
1.2主要试剂 5
1.3主要仪器与设备 5
1.4实验方法 5
1.4.1 油茶叶多酚与黄酮的有机溶剂提取法 5
1.4.2 总酚含量的测定 5
1.4.3 黄酮含量的测定 6
1.4.4 正交实验设计 7
2 结果与讨论 8
2.1多酚标准曲线 8
2.2 黄酮标准曲线 8
2.3 实验结果 9
2.4 讨论各因素对提取量的影响 11
2.4.1 提取时间对油茶叶中多酚和黄酮提取效果的影响 11
2.4.2乙醇浓度对多酚和黄酮提取量的影响 11
2.4.3料液比对多酚和黄酮提取量的影响 11
2.4.4 提取温度对多酚和黄酮提取量的影响 12
3 总结 13

油茶叶多酚和黄酮综合提取工艺的优化

摘要：我国油茶资源十分丰富，利用潜力巨大，开发油茶叶黄酮及油茶叶多酚有着重要的现实意义和十分广阔的前景。油茶树是我国独有的一种木本油料资源，油茶中含有大量的黄酮类化合物和多酚类物质。油茶种植的发展必须重视油茶的综合开发利用，只有这样才能使得油茶种植的综合效益得到进一步体现。本文采用正交试验法对油茶叶中提取多酚和黄酮的最佳工艺条件进行研究，设计了以乙醇中作为溶剂从油茶叶中提取多酚和黄酮的实验，通过对溶剂浓度、提取温度、提取时间、料液比这4个单因素进行正交试验。用分光光度计法测定了不同实验条件下提取的油茶叶多酚和黄酮的含量。结果表明从油茶叶中综合提取黄酮和多酚的最佳工艺条件为：乙醇浓度60%，提取温度80℃，提取时间40min，料液比1:15.
关键词：油茶叶 ;多酚 ;黄酮 ; 综合提取 ;乙醇

Optimization of comprehensive extraction technology of camellia oleifera leaf polyphenol and flavonoids

Abstract： China has abundant Camellia oleifera resource. The utilization potential is very large. The development of camellia oleifera leaf flavonoids and leaf polyphenol has important realistic significance and also broad prospects. Camellia oleifera is a particular woody oil plant resource in our country, containing a large number of flavonoids and polyphenol. The development of planting camellia oleifera must pay much attention to the comprehensive development and utilization of camellia oleifera. Only by this can comprehensive benefits of camellia cultivation be realized. This article studies optimal technological condition of extracting flavonoids and polyphenol from camellia oleifera leaf by orthogonal test, and design a test of using ethyl alcohol as solvent to extracting flavonoids and polyphenol from camellia oleifera leaf. Orthogonal test was made on the base of 4 single factors: solvent concentration, extracting temperature, extracting time and ratio of material to solvent. The content of extracted flavonoids and polyphenol in different experiment conditions was detected by the spectrophotometer. The results showed that the optimal technological condition of extracting flavonoids and polyphenol from camellia oleifera leaf is 60% ethyl alcohol concentration, extracting temperature 80℃, extracting time 40 min and ratio of material to solvent 1:15.
Keywords: camellia oleifera leaf; polyphenol; flavonoids; comprehensive extraction; ethyl alcohol

油茶，茶科，常绿小乔木。因其种子可榨茶油供食用，故名。茶油色清味香，营养丰富，耐贮藏，是优质食用油 ；也可作为润滑油、防锈油用于工业[1]。茶饼既是农药，又是肥料，可提高农田蓄水能力和防治稻田害虫。果皮是提制栲胶的原料。叶部含有花黄素、茶碱等，是医药工业的原料。木材可做小型农具。油茶树高达4～6米，一般2～3米。树皮淡褐色 ，光滑。单叶互生，革质，椭圆形或卵状椭圆形，边缘有细锯齿，长3-10厘米，宽1.5-4.5厘米，花顶生或腋生，两性花，白色，直径6-9厘米，花瓣倒卵形，顶端常二裂[2]。蒴果球形、扁圆形、橄榄形，直径3-4厘米，果瓣厚而木质化，内含种子。种子茶褐色或黑色，三角状，有光泽。
植物多酚是一类广泛存在于植物体内的大分子化合物,主要存在于植物的皮、根、木、叶、果中,植物多酚由于其羟基取代的高反应性和吞噬自由基的能力而有很好的抗氧化活性。研究发现:植物多酚不仅起着对油脂的抗氧化作用,而且还能延缓机体的衰老,抑制癌症、糖尿病、白内障、动脉粥样硬化、肾小球疾病、心肌梗塞、高血压等疾病的发生,而这些功能都与多酚的抗氧化性能有着密切的关系[3]。因此,国内外对多酚的研究和应用方兴未艾,对植物多酚研提取工艺报道的比较多是茶多酚、苹果多酚、葡萄籽多酚等。
黄酮类化合物泛指两个具有酚羟基的苯环（A-与B-环）通过中央三碳原子相互连结而成的一系列化合物，其基本母核为2-苯基色原酮。天然黄酮类化合物多以苷类形式存在 ，并且由于糖的种类、数量、联接位置及联接方式不同可以组成各种各样黄酮苷类[4]。组成黄酮苷的糖类包括单糖、双糖、三糖和酰化糖。黄酮苷固体为无定形粉末，其余黄酮类化合物多为结晶性固体。黄酮类化合物不同的颜色为天然色素家族添加了更多色彩。这是由于其母核内形成交叉共轭体系，并通过电子转移、重排，使共轭链延长，因而显现出颜色。黄酮苷一般易溶于水、乙醇、甲醇等极性强的溶剂中；但难溶于或不溶于苯、氯仿等有机溶剂中。糖链越长则水溶度越大。黄酮类化合物因分子中多具有酚羟基，故显酸性。酸性强弱因酚羟基数目、位置而异。
茶叶的提取是指将茶叶加入溶剂中，使茶叶中各种可溶性化学成分溶出，从而使茶叶中可溶物与不可溶物达到完全分离的过程。不论采用哪一种方法提取茶多酚，溶剂浸取是其必须采用的工艺步骤。茶叶具有不均匀性和多样性，因而，研究了解茶叶在浸提过程中内含成分的浸出过程，对浸提的工艺技术制订和品质控制，具有十分重要的意义。实验和分析研究表明，茶叶中内含物浸出一般可分为三个阶段。
黄酮类化合物不但分布范围广，种类多，而且生物活性广泛，它不仅可做功能性食品添加剂。如甜味剂、抗氧化剂风味增强剂等[5]。还可做一些功能食品，如防衰、防癌、提高免疫力、降脂、降压食品，产品外观覆盖到液体、固体和半流体等多种形式，目前应用最多的是它的抗氧化、抗衰老功能及其他新功能。
多酚类物质和黄酮类物质因为具有较高的经济价值，已吸引了很多学者的研究目光，越来越多的研究围绕着植物多酚和植物黄酮的提取[6]，但多数的研究只探讨单一物质的提取效果，而本研究通过正交试验摸索从油茶叶中同时提取多酚和黄酮的最佳工艺，期望通过一次提取能获到最优结果。
1 实验材料与方法
1.1实验原料
油茶叶采自湖北省京山县虎爪山森林公园。
1.2主要试剂
乙醇、鞣酸、酒石酸亚铁溶液、酒石酸钾钠、磷酸二氢钾、十二水磷酸二氢钠、芦丁、亚硝酸钠、硝酸铝（分析纯购自武汉科普化学试剂有限公司，标准品鞣酸购自荆州昌华科教仪器有限公司）
1.3主要仪器与设备
冷凝管、烧杯（500mL、250mL、100mL、50mL）、圆底烧瓶（500mL、250mL）、试管、量筒、可见分光光度计、JY20002电子分析天平（D3004564，MAX=2000g,e=0.1g,d=0.01g)、旋转蒸发仪(供应宏朗RE-5000)、电热恒温水浴锅（DK-98-11，天津市泰斯特仪器有限公司）、真空抽滤机（天津科诺仪器设备有限公司 ）、铁架台
1.4实验方法
1.4.1 油茶叶多酚与黄酮的有机溶剂提取法
在油茶叶的提取方法中，有离子沉淀法、微波浸取法、超声波萃取法和有机溶剂法等一系列方法[7]。在现有条件下，本实验采取有机溶剂提取法，主要因为此种方法在实验中已有成熟运用，在节约时间、成本的同时能熟练操作。以下为本实验操作流程：
干燥油茶叶并粉碎
5g每份
加入圆底烧瓶

圆底烧瓶中加入有机溶剂
水浴加热
检测
浓缩

1.4.2 总酚含量的测定
1.4.2.1 标准溶液配置
称取鞣酸0.25g，加蒸馏水定容至250mL，得到浓度为1mg/mL的标准溶液
1.4.2.2 标准曲线绘制
分别吸取茶多酚标准液0、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL，分别加蒸馏水至1mL，再加酒石酸亚铁溶液1mL，加入pH为7.5的磷酸缓冲液至5mL，用第一管做空白对照，于540nm处测定吸光值[8]，绘出标准曲线。
酒石酸亚铁溶液：0.25g（准确到0.0001）FeSO4•7H2O，1.25g酒石酸钾钠，用蒸馏水水溶解并定容至250mL（低温保存有效期为10天）。
pH 7.5的磷酸缓冲液配置：A液为1/15mol/L磷酸氢二钠溶液：2.39g十二水磷酸二氢钠，加水定容至100mL。B液为1/15mol/L的磷酸二氢钾溶液：称取经100℃烘干2h的磷酸二氢钾0.908g，加水后定容至100mL。取A液85mL和B液15mL混合备用[9]。
1.4.2.3 多酚含量的测定
将样品浓缩得到浸膏后，加蒸馏水5mL。吸取0.1mL，加蒸馏水至1mL，再加酒石酸亚铁溶液1mL，加入pH为7.5的磷酸缓冲液至5mL，放置于540nm处测定吸光值，在标准曲线中找到对应的浓度，计算样品液中的多酚含量[10]。
1.4.3 黄酮含量的测定
1.4.3.1 芦丁标准溶液的配制 
称量13.2mg芦丁，用60%乙醇定容到25ml容量瓶作为标准溶液。 
1.4.3.2 标准曲线的制作 
准确吸取0mL， 1mL， 2mL， 3mL， 4mL，5 mL芦丁标准溶液，放入10毫升容量瓶内（写明标记），分别加入5 mL、4mL、3mL、2mL、1mL、0 mL的60%乙醇溶液；再加入5%亚硝酸钠溶液0.5ml摇匀，放置6min；加入10%硝酸铝溶液0.5ml，放置6min后；加入4%氢氧化钠溶液4.0mL，加60%乙醇定容，摇匀后，放置15min；用第一管作为空白对照管，在510nm处测定吸光度。用0.0ml作为空白，用芦丁含量的浓度作为横坐标，纵坐标作为一定浓度下所对应的吸光度，作标准曲线[11]。

1.4.3.3 黄酮含量的计算[12]

式中：X —样品中总黄酮含量 g/5g或g/25mL
m1—根据标准曲线计算出待测液中黄酮的量 μg
m —样品质量或样品体积 g或mL
V1—样品提取液测定用体积 mL
V2—样品提取液总体积 mL
1.4.4 正交实验设计
对从油茶叶中提取多酚和黄酮的影响因素有很多，通过对各种文献的总结发现，公认的影响大的因素有乙醇浓度、水浴加热温度、水浴加热时间和料液比等四因素，所以本实验只对这四因素的改变来确定最佳提取工艺，通过正交试验法，可以实现通过少数的实验次数找到较好的生产条件，以达到最高生产工艺效果[]。
正交实验中乙醇浓度、水浴加热温度、水浴加热时间和料液比这四个因素各取三个水平，见表1。正交试验具体方案套用正交试验表安排，见表2.
表1 正交实验因素水平
水平
乙醇浓度%
温度℃
时间min
料液比g/mL

1
45
50
40
1:10

2
60
65
60
1:15

3
80
80
80
1:20

表2 正交试验组数确定
因素
乙醇浓度%
温度℃
时间min
料液比g/ml
实验一
45
50
40
1:10
实验二
45
65
60
1:15
实验三
45
80
80
1:20
实验四
60
50
60
1:20
实验五
60
65
80
1:10
实验六
60
80
40
1:15
实验七
75
50
80
1:15
实验八
75
65
40
1:20
实验九
75
80
60
1:10
2 结果与讨论
2.1多酚标准曲线
按照1.4.2的方法，将茶多酚标准溶液在540nm处测定吸光值，以吸光值为纵坐标，多酚含量为横坐标，得出标准曲线的回归方法。线性回归方程为：Y=0.012X+0.008，相关系数为：R2=0.999，多酚标准曲线见图1.

图1 多酚标准曲线
2.2 黄酮标准曲线
按照1.4.3的方法，将黄酮标准溶液在510nm处测定吸光值，以吸光值为纵坐标，黄酮含量为横坐标，得出标准曲线的回归方法。线性回归方程为：Y=9.5659X+0.0025，相关系数为：R2=0.9996，黄酮标准曲线见图2。

图2 黄酮标准曲线
2.3 正交试验结果
从表3可知，多酚的最佳提取工艺为A2B1C1D2，根据极差值的大小，得出影响多酚得率的因素依次为A>D>B>C。
表3 多酚正交试验提取效果
因素
A：乙醇浓度%
B：提取温度℃
C：提取时间min
D：料液比g/ml
实验结果mg/g
实验一
45
50
40
1:10
16.722
实验二
45
65
60
1:15
18.344
实验三
45
80
80
1:20
15.921
实验四
60
50
60
1:20
18.074
实验五
60
65
80
1:10
17.263
实验六
60
80
40
1:15
18.873
实验七
75
50
80
1:15
17.271
实验八
75
65
40
1:20
16.091
实验九
75
80
60
1:10
13.827
均值一
16.996
17.322
17.229
15.937

均值二
18.07
17.233
16.748
18.129

均值三
15.696
16.207
16.785
16.695

极差
2.374
1.115
0.481
2.192

从表4可知，黄酮的最佳提取工艺为A2B1C1D2，根据极差值的大小，得出影响黄酮得率的因素依次为A>B>D>C。
表4 黄酮正交试验提取效果
因素
A：乙醇浓度%
B：提取温度℃
C：提取时间min
D：料液比g/ml
实验结果mg/g
实验一
45
50
40
1:10
69.825
实验二
45
65
60
1:15
69.173
实验三
45
80
80
1:20
78.256
实验四
60
50
60
1:20
75.477
实验五
60
65
80
1:10
80.052
实验六
60
80
40
1:15
82.928
实验七
75
50
80
1:15
83.651
实验八
75
65
40
1:20
88.271
实验九
75
80
60
1:10
92.302
均值一
72.418
76.318
80.341
80.726

均值二
79.486
79.165
78.984
78.584

均值三
88.075
84.495
80.653
80.668

极差
15.657
8.177
1.669
2.142

2.4 讨论
2.4.1 提取时间对油茶叶中多酚和黄酮提取效果的影响
从表3可看出,提取时间对多酚的提取量多少的影响最小，极差只有0.481。当然，随着时间的增加，多酚的提取也有相当的时间呈稍微的上升趋势，主要原因可能是时间越长,多酚物质的溶解越充分。在60min达到峰值后,细胞内的有效成分基本析出,再增加时间,析出的多酚由于受光、热、多酚氧化酶PPO的影响,极易被氧化,因此,应选择40min为最佳提取条件。
从表4可以看出，提取时间对在油茶叶中提取黄酮的影响最小，不论时间是40min、60min、80min时，对提取量来说，不会改变其太大，但也可以看出当时间从60min到80min过程中，提取量在细微的增加。
总的来说，提取时间对多酚和黄酮的提取都是最小的影响因素，对多酚的最优提取时间为40,min，对于黄酮的最优提取时间为40min或80min，考虑到节约成本等因素，我们选取40min作为最优提取时间。
2.4.2乙醇浓度对多酚和黄酮提取量的影响
从表3可看出,乙醇浓度对多酚的提取量影响最大，在45%～60%之间时,多酚的提取量迅速增加,在60%～75%之间呈缓慢下降趋势。原因可能是随着乙醇浓度的增大,多酚-蛋白质等的连接键被逐步破坏,多酚在乙醇水溶液中的溶解度增大,在乙醇浓度60%达到峰值,之后溶剂中的水分越来越少,所以通透性越来越差,细胞内的多酚物质向外扩散的难度大,所以提取率低,另外一个原因也许是高浓度的甲醇易于挥发,间接降低了料液比,使多酚溶解度降低,所以选择60%左右的乙醇浓度比较合适。
同时，从表4来看，乙醇浓度对油茶叶中黄酮的提取影响也是最大的，影响原因与多酚相似。当乙醇浓度为75%时黄酮的提取量最大，但当乙醇浓度为75%时多酚提取量是三个水平中最低的，所以综合考虑确定乙醇浓度最适值为60%。
2.4.3料液比对多酚和黄酮提取量的影响
从表3可看出,多酚的提取量随着料液比的增加呈上升趋势,这是由于油茶叶组织内部与外周的多酚的浓度差异随之增大,提高了提取率,但料液比达到1∶15(W∶V)时,内部与外部之间的浓度已趋于平稳。
从表4看出料液比对黄酮的提取的影响还是比较小的，且无规律可循，这可能是由于对于5g的油茶叶，1:10的料液比已经足够用了，或者已经达到了最大值。因此，料液比的最佳值取1:15。
2.4.4 提取温度对多酚和黄酮提取量的影响
从表3可看出,油茶叶中多酚的提取量在80℃是存在两个极端，最小和最大，但根据我们前面对提取时间、因此浓度和料液比的确定最佳值，带入到表3中可见当温度去80℃刚好为多酚提取的最大值，所以对多酚来说最佳温度为80℃。
从表4可看出，温度对黄酮的提取有一定影响，但没因此浓度强，所以重要性在因此浓度之后，前面我们确定乙醇浓度最佳值为60%，在这个基础上，可由表4看出最佳温度为40℃和80℃。
因此，从综合提取的角度来说，选择最佳温度为80℃。
3 总结
根据表3和表4，同时结合以上分析，我们可以得出。在对油茶叶中提取多酚和黄酮的影响因素中，乙醇浓度起着决定性因素，他对两者的影响都很大，水浴加热温度对提取量有一定影响，时间对两者的影响都不大，可忽略不计。
最终得出，在油茶叶中综合提取黄酮和多酚的最佳工艺为乙醇浓度60%、水浴加热温度80℃、水浴加热时间40min、料液比1:15。按照这个实验方案进行了三组平行实验取平均值，结果如表5：多酚的平均提取量为19.407mg，黄酮得率为94.509mg，均高于正交试验中的任何一组，这表明该综合提取工艺条件稳定可行。
表5 平行实验结果
实验号
1
2
3
平均值
多酚提取量
19.726
18.413
20.087
19.407
黄酮提取量
97.204
93.494
92.836
94.509
本实验为油茶叶的资源开发和综合利用提供了实验依据，对于拓展油茶产业链、增加油茶产品的附加值具有重要意义。

参考文献：
[1] 朱彬.油茶活性成分研究进展与展望.经济林研究.2010（9）.(140-141)
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致谢
本论文是在张婷老师的精心指导下完成的。借此机会感谢老师在这一年来来对我的细心指导，张婷老师在实验选题、实验方案、实验过程和论文撰写等方面对我进行了全面的辅导。在论文写作与试验过程中，教育我以严谨的实验态度、求实的科研作风和对科学未知领域执着的探索精神来对待此次毕业论文。张婷老师渊博的知识、严谨的治学态度和高尚的品格使我终身受益。
本次论文的研究工作主要是在山上实验室完成，在此过程中，实验室的老师给与了我许多的帮助与方便，不管遇到多难找的实验器材，实验室全体老师总是不辞辛苦的耐心帮助我寻找，借此机会，我要感谢实验室的全体老师，正是他们的无私帮助，为我创造了良好的实验环境，才使本论文的研究得以顺利进行。同时，也要感谢我的同学，在我遇到问题的时候尽其所能的帮助我，让我始终对实验的成功充满信心。
最后，再次感谢所有关心、帮助和支持过我的老师和同学！同时向参加论文评阅和答辩的老师致以衷心的感谢和崇高的敬意！

刘阳

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