实用pcr流程表样本.doc

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临床PCR检验流程记录表
检验日期: 检验项目: HBV-DNA 扩增仪中保存文件名

使用说明: ①严格按单一流向进行实验, 即试剂准备区→标本制备区→扩增区, 严禁逆向移动。本记录表的流向亦遵循此流程; ②各项工作执行后在相应项当前的方框内打”√”; ③本记录表最后归档保存在PCR实验室扩增区的专用文件夹中, 以备查找。

实验前准备

□试剂在有效期内 □扩增仪、 加样器、 金属浴、 温湿度计等仪器在校准有效期内( 校准之日起1年)
□生物安全柜的滤膜在使用有效期内 □离心管、 带滤芯吸头已经过质检合格
□各区按消毒液配制SOP配制500mg/L含氯消毒液、 mg/L含氯消毒液和70%酒精, 即用即配。
□打开通风设备
操作者

试剂准备区

实验前: □更换专用工作服、 戴口罩、 帽子、 鞋套 □实验台面清洁( 500mg/L含氯消毒液、 70%酒精或水擦拭)
冰箱温度: 冷藏室( 2～8℃) ℃; 冷冻室( -20±2℃) ℃
实验室温度 ℃( 允许范围: 15～30℃) ; 相对湿度: ( 允许范围: 30%～70%)

PCR试剂来源: 试剂厂家: 口 深圳匹基生物工程有限公司 批号:
检验项目: HBV-DNA 本次实验用量: 人份; 剩余量: 人份

其它有关试剂配制:
仪器设备使用: 离心机: □正常 □不正常 ; 振荡器: □正常 □不正常;
生物安全柜: 口 正常 口 不正常
实验后: □ 按实验室清洁消毒SOP清洁实验室台面、 地面、 加样器和离心机, 并进行紫外线照射30分钟以上。
□ 按实验室废弃物处理SOP处理实验废弃物。
操作者

检验日期: 检验项目: HBV-DNA

样本处理区
实验前: □更换专用工作服、 戴口罩、 帽子、 鞋套 □实验台面清洁( 500mg/L含氯消毒液、 70%酒精或水擦拭)
冰箱温度: 冷藏室( 2～8℃) ℃; 冷冻室( -20±2℃) ℃
实验室温度 ℃( 允许范围: 15～30℃) ; 相对湿度: ( 允许范围: 30%～70%)
HBV-DNA阳性室内质控物来源: 浓度及批号: 扩增位置:
HBV-DNA阴性室内质控物来源: 批号: 扩增位置:
所处理的HBV-DNA标本( 对应标本接收的唯一编号) 及拟扩增位置:
1
9
17
25
33
41
49
57
65
73
81
89
2
10
18
26
34
42
50
58
66
74
82
90
3
11
19
27
35
43
51
59
67
75
83
91
4
12
20
28
36
44
52
60
68
76
84
92
5
13
21
29
37
45
53
61
69
77
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93
6
14
22
30
38
46
54
62
70
78
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7
15
23
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39
47
55
63
71
79
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95
8
16
24
32
40
48
56
64
72
80
88
96

核酸提取及加样过程: □按乙型肝炎病毒DNA荧光定量PCR操作程序SOP进行。

仪器设备使用: 生物安全柜: □正常 □不正常; 恒温金属浴: ℃;
离心机: □正常 □不正常; 振荡器: □正常 □不正常;
低温离心机: 制冷: □正常 □不正常; 离心: □正常 □不正常
实验后: □ 按实验室清洁消毒SOP清洁实验室台面、 地面、 加样器和离心机, 并进行紫外线照射30分钟以上。
□ 按实验室废弃物处理SOP处理实验废弃物。
口 使用后标本冷冻保存3个月, 以备复查。
操作者

检验日期: 检验项目: HBV-DNA

扩增及产物分析区

实验前: □更换专用工作服、 戴口罩、 帽子、 鞋套 □实验台面清洁( 500mg/L含氯消毒液、 70%酒精或水擦拭)
实验室温度 ℃( 允许范围: 15～30℃) ; 相对湿度: ( 允许范围: 30%～70%)
LightCycler扩增仪操作: □开机自检及运行正常; □ 按LightCycler操作使用SOP进行编程、 参数设定
HBV-DNA 标准曲线计算值: Slope 值: Intercept值: r2值:
室内质控结果: 阴性质控物结果: ; 阳性质控物结果:
口填写室内质控记录、 质控图; 　 是否失控: 口否 　口是
　室内质控结果: 阴性质控物结果: ; 阳性质控物结果:
口填写室内质控记录、 质控图; 　 是否失控: 口否 　口是
失控原因及分析: 　( 失控判断标准及原因分析按室内质控SOP进行)

实验结果: 见所附扩增仪打印结果
实验结果有效性判断: □有效 □无效( 依据实验结果有效性判断SOP进行)
实验后: □ 按实验室清洁消毒SOP清洁实验室台面、 地面、 加样器和离心机, 并进行紫外线照射30分钟以上。
□ 按实验室废弃物处理SOP处理实验废弃物。
操作者

1. 操作步骤:
1.2.1 取n个1.5ml的灭菌离心管, 作好标记。( n=样本数+1管HCV阴性对照+1管HCV强阳性对照+1管HCV临界阳性对照)
1.2.2 向上述离心管中分别加入25ul蛋白酶溶液。
1.2.3 分别加入待测样本、 HCV阴性对照、 HCV临界阳性对照和HCV强阳性对照各200ul.
1.2.4 加入200ul新鲜配制的裂解液工作液, 盖上盖子, 振荡15秒, 充分混匀。( 注意: 不要把蛋白酶溶液直接加入裂解液工作液中) 。
1.2.5 56摄氏度温浴15分钟。瞬时离心, 以去除管盖上的滴液。
1.2.6 加入250ul无水乙醇, 盖上盖子, 彻底混匀( 振荡15秒) 。在室温下静置5分钟( 15-25摄氏度) 。注意: 如果环境温度超过25摄氏度, 无水乙醇需预冷。瞬时离心, 以去除管盖上的滴液。
1.2.7 将n个核酸提取柱放入收集管中, 小心地将步骤1.2.6中的液体移入核酸提取柱中。盖上盖子, 6000*g离心1分钟。倒掉收集管中的废液, 将提取柱重新放入收集管中。( 如果离心后核酸提取柱中仍有部分液体, 以更高的速度再次离心, 确保提取柱中无残余的液体)
1.2.8 小心的打开核酸提取柱的盖子, 加入500ul洗液1, 盖上盖子, 6000*g离心1分钟, 倒掉收集管中的废液, 将提取柱重新放入收集管中。
1.2.9 小心的打开核酸提取柱的盖子, 加入500ul洗液2, 盖上盖子, 6000*g离心1分钟, 倒掉收集管中的废液, 将提取柱重新放入收集管中。
1.2.10 小心的打开核酸提取柱的盖子, 加入500ul无水乙醇, 盖上盖子, 6000*g离心1分钟, 丢弃收集管, 将提取柱放入新的收集管中。
1.2.11 0*g高速离心3分钟, 彻底去除乙醇。
1.2.12 丢弃收集管, 将核酸提取柱放入干净的1.5ml离心管中, 打开提取柱的盖子,
56摄氏度温浴3分钟, 以彻底去除残余的液体。
1.213 将核酸提取柱放入另一干净的1.5ml离心管中, 小心打开提取柱的盖子, 加入60ul洗脱液( 请将洗脱液加到膜的中央) , 盖上盖子, 室温静置5分钟。 0*g高速离心1分钟收集滤出液, 做好标记, 4摄氏度保存备用。提取的病毒核酸应在2小时内用于PCR扩增, 或在-70摄氏度下能够保存一个月。
2. 扩增试剂准备( PCR前准备区)
从试剂盒中取出HCV RT-PCR反应液、 Enzyme Mix , 在室温下融化后, *g离心5秒。设所需要的PCR反应管数( 玻璃毛细管) 为n( n=样本数+1管空白对照+1管HCV阴性对照+1管HCV强阳性对照+1管HCV临界阳性对照+4管HCV定量标准品) , 每个测试反应体系配制如下表:
试剂
HCV RT-PCR反应液
Enzyme Mix
用量
n*13ul
n*2ul
计算好各试剂的使用量, 加入到一适当体积试管中, 充分混匀均匀后 *g离心10秒, 向各玻璃毛细管中分装15ul, 转移至样本处理区。
3. 加样( 样本处理区)
吸取10ul样本处理步骤1.2.13中收集得到的RNA溶液及HCV定量标准品分别加入到上述反应管中( 空白对照直接加入10ul洗脱液) , 盖紧反应管管盖, 连同Roche专用金属反应管套放在离心机中, 于 *g离心10秒, 将毛细管转移到检测区。将毛细管排放好放入荧光PCR检测仪内, 记录样本摆放顺序。
4. RT-PCR反应( 检测区)
4.1 循环条件设置
Program
Cycles
Temperature摄氏度
Incubation Time(min:sec)
Temperature
Transition
Rate( 摄氏度/sec)
Acquisition
Mode
Analysis
Mode
1
1
50
30:00
20
None
None
2
1
95
15:00
20
None
None

3

45
95
00:05
20
None
Quantification
50
00:30
20
Single
72
00:20
10
None
反应体系为25ul.具体设置方法请参照各仪器使用说明书。
4.2 仪器检测通道选择
选择F1检测通道: HCV内对照( IC) 选择F2检测通道。
4.3 样本的设定
在扩增开始前条件设定时, 将HCV定量标准品设为”Standard”并输入试剂盒内给定浓度值, 待检样本和对照品设定为”Unknown”。
结果分析条件设定
1. 对HCV的曲线和HCV内对照( IC) 的曲线进行分别分析。
2. 分析方式选择Fit Points, 基线调整选择Arithmetic,阈值( threshold) 设定原则以阈值线刚好超过正常HCV阴性对照曲线的最高点, 且正常HCV阴性对照病毒滴度为0.0IU/ml为准。具体设置方法请参照各仪器使用说明书。
质控标准
1. 将HCV定量标准品1-4的浓度值输入, 仪器将自动以HCV定量标准品的浓度值为横坐标, 以其实际测得的外标Ct值为纵坐标给出标准曲线, 标准曲线的拟和度绝对值应大于等于0.980, 四个HCV定量标准品的Ct值都应<38.0, 否则视为定量结果无效。
2. HCV阴性对照、 空白对照HCV RNA应为0.0IU/ml; HCV强阳性对照HCV RNA应为5.0E+05-1.0E+07IU/ml; HCV临界阳性对照应为1.0E+03-1.0E+05 IU/ml; 且HCV阴性对照、 HCV临界阳性对照中HCV内对照( IC) 的Ct值都应小于等于33, 否则此次实验视为无效。所有实验从样本处理开始重做。
结果判断
1. 检测样本中1.0E+03 IU/ml小于等于HCV RNA小于等于5.0E+07 IU/ml, 测定结果有效, 可直接报告相应的浓度值。
2. 检测样本中HCV RNA大于5.0E+07 IU/ml, 可按实际测得值报告相应的病毒滴度, 亦可将该样本用正常人血浆按10倍梯度稀释到本试剂盒定量检测线性范围内后重新测定, 测定结果应以稀释倍数进行校正。
3. 检测样本中0.0IU/ml小于HCV RNA小于1.0E+03 IU/ml, 且HCV内对照( IC) 的Ct值都应小于等于33, 表明病毒载量较低, 可直接报告浓度值, 但注明该病毒滴度量仅供参考。
4. 检测样本中HCV RNA等于0.0IU/ml, 且HCV内对照( IC) 的Ct值都应小于等于33, 应报告为小于试剂盒最低检测限。
5. 检测样本中HCV内对照( IC) 的Ct值大于33或Ct值为无数值, 且HCV RNA小于等于1.0E+03 IU/ml( 包含0.0IU/ml或无数值) 时, 则此样本的定量结果视为无效, 应查找并排除原因, 并对此样本进行重复实验。