蛋白质免疫印迹技术专家讲座.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2012-3-26,河北大学生命科学学院,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2012-3-26,河北大学生命科学学院,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,试验二蛋白质免疫印迹技术,蛋白质免疫印迹技术专家讲座,第1页,一、免疫学,研究,抗原物质,结构和功效；,免疫应答产物,结构和功效；,抗原刺激机体产生免疫应答,规律,。,蛋白质免疫印迹技术专家讲座,第2页,免疫学研究范围很广，与很多相关学科交织在一起，而且发展成了很多学科，如免疫生物学、免疫遗传学、血液免疫学、肿瘤免疫学等。,伴随免疫生物学发展，人们发觉在,高等动物体内存在,着含有免疫功效组织结构（即,免疫系统,）。,蛋白质免疫印迹技术专家讲座,第3页,淋巴组织,免疫活性细胞,免疫活性介质,蛋白质免疫印迹技术专家讲座,第4页,免疫系统功效,生理和病理表现,功效名称 生理功效 病理表现,免疫防御 去除病原微生物及其它抗原性异物 超敏反应（强）,免疫缺点病（弱）,免疫自稳 去除损伤或衰老细胞 本身免疫性疾病,免疫监视 去除突变或畸变细胞,预防肿瘤发生 肿瘤或病毒连续性,杀伤病毒感染细胞 感染,蛋白质免疫印迹技术专家讲座,第5页,当,外源异体物质,，如细菌、病毒、蛋白质、多糖等进入动物机体后，能够激活机体免疫系统，产生对外源物质排除作用，从而保护机体免受外源物质侵害。,机体这一特异,免疫应答,功效细胞基础是淋巴细胞。,蛋白质免疫印迹技术专家讲座,第6页,免疫应答类型,（一）,固有性免疫应答,（,innate immune response),又称先天性免疫应答，非特异性免疫应答：是机体在种系发育和进化过程中形成免疫防御功效。,（二）,适应性免疫应答,（,adaptive immune response,）,又称,取得性免疫应答,，特异性免疫应答，是机体出生后经过与抗原物质接触后所产生一系列防御功效。（含有特异性、多样性、记忆性、耐受性、自限性）,蛋白质免疫印迹技术专家讲座,第7页,抗原和免疫原性,抗原（,antigens,，,Ag,）,是指能够刺激机体免疫活性细胞产生抗体或致敏淋巴细胞，并在体内或体外发生特异性反应物质。,常见抗原,有蛋白质、多糖、磷脂、脂多糖、结合蛋白质、核酸、激素等有机物。,抗原含有两方面特征：,免疫原性（,immunogenicity,）和免疫反应性（,immunoreactivity,）。,免疫原性（,immunogenicity,）,是指抗原刺激机体引发免疫应答能力。,免疫反应性（,immunoreactivity,）,是指抗原与对应免疫应答产物,(,即抗体,),在体内或体外发生特异性结合反应能力,。,蛋白质免疫印迹技术专家讲座,第8页,抗原分类,抗原能够分为,完全抗原和半抗原,。,完全抗原,：含有免疫原性和免疫反应性抗原称为完全抗原（,complete antigen,）,半抗原：,只含有免疫反应性而无免疫原性抗原称为半抗原（,hapten,），也称为不完全抗原,(incomplete antigen),。与蛋白质结合后成为完全抗原。半抗原能与对应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合反应。绝大多数多糖和全部类脂都属于半抗原。,蛋白质免疫印迹技术专家讲座,第9页,抗体种类,抗体（,antibodies,，,Ab),是专门反抗抗原特异结构球蛋白，故也称为免疫球蛋白（,immunoglobulins,Ig),。存在于血清、体液中，是组成机体免疫作用主要物质。,免疫球蛋白依据其理化性质及生化性质不一样，分为五种类型：,IgG,、,IgA,、,IgM,、,IgD,和,IgE,。,人体血清中,IgG,含量最多，,IgA,次之，,IgM,较少，,IgD,和,IgE,微量。,蛋白质免疫印迹技术专家讲座,第10页,蛋白质免疫印迹技术专家讲座,第11页,抗原抗体反应（,antigen-antibody reaction,）,是指抗原与对应抗体之间所发生特异性结合反应。可发生于,体内,（,in vivo,），也可发生于,体外,（,in vitro,）。,体内反应可介导吞噬、溶菌、杀菌、中和毒素等作用；,体外反应：可出现,凝集反应、沉淀反应、补体参加反应及中和反应,等各种不一样反应类型。,因抗体主要存在于血清中，在抗原或抗体检测中多采取血清作试验，所以,体外抗原抗体反应亦称为血清学反应,（,serologic reaction,）。,蛋白质免疫印迹技术专家讲座,第12页,二、印迹法（,blotting,）,印迹法是指将样品转移到,固相载体,上，而后利用对应探测反应来检测样品一个方法。,1975,年，,Southern,建立了将,DNA,转移到硝酸纤维素膜（,NC,膜）上，并利用,DNA,RNA,杂交检测特定,DNA,片段方法，称为,Southern,印迹法,。,人们用类似方法，对,RNA,和蛋白质进行印迹分析，对,RNA,印迹分析称为,Northern,印迹法,，对单向电泳后蛋白质分子印迹分析称为,Western,印迹法,，对双向电泳后蛋白质分子印迹分析称为,Eastern,印迹法,蛋白质免疫印迹技术专家讲座,第13页,三、蛋白免疫印,迹,应用,免疫印迹法,(immunoblotting test,IBT),，亦称酶联免疫电转移印斑法,(enzyme linked immunoelectrotransfer blot,EITB,是一个将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合杂交技术。,含有分析容量大、敏感度高、特异性强等优点。,是,检测蛋白质特征、表示与分布,一个最惯用方法。,蛋白质免疫印迹技术专家讲座,第14页,蛋白质免疫印迹检测技术,一、试验目标,二、试验原理,三、试验仪器,四、操作步骤,五、试验结果与分析,六、思索题,蛋白质免疫印迹技术专家讲座,第15页,一、试验目标,学习掌握动物抗血清制备原理及技术,经过实际操作学会动物抗血清制备,掌握,Western,blotting,基本原理,熟悉,Western,blotting,试验操作,蛋白质免疫印迹技术专家讲座,第16页,二、试验原理,第一部分 动物常规免疫及抗血清制,备,第二部分,Western,blotting,检测抗血清,蛋白质免疫印迹技术专家讲座,第17页,将适当,抗原,物质注入动物体内，经过一定时间，动物血清中可出现大量特异性抗体，这种含抗体血清称为,免疫血清,。,优质免疫血清产生，主要取决于,抗原纯度,和,免疫原性,，以及,动物应答能力,。另外，尚需考虑免疫路径、抗原剂量、注射次数、时间间隔、有没有佐剂等原因。,第一部分 动物常规免疫及抗血清制备,蛋白质免疫印迹技术专家讲座,第18页,（一）多克隆抗体概念,抗原通常是由多个抗原决定簇组成。,由一个抗原决定簇刺激机体，由一个,B,淋巴细胞接收该抗原所产生抗体称之为单克隆抗体（,Monoclone antibody,）。,由多个抗原决定簇刺激机体，对应地就产生各种各样单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是,多克隆抗体,。,机体内所产生抗体就是,多克隆抗体,。,蛋白质免疫印迹技术专家讲座,第19页,抗体结构,蛋白质免疫印迹技术专家讲座,第20页,（二）用于免疫动物,因为动物遗传性不一样，同一抗原对不一样动物或同种不一样品系动物、或不一样个体，产生特异免疫应答强弱是不一样。所以，进行动物免疫时，必须选择对该抗原敏感、年轻健康动物。,惯用试验动物为羊、家兔、豚鼠和鼠等。普通为,6,个月大小动物。,蛋白质免疫印迹技术专家讲座,第21页,动物种类选择主要依据抗原生物学特征和所要取得抗血清数量。,如要取得大量抗体，多采取大动物；,如要是取得直接标识诊疗抗体，则直接采取本动物；,如要取得间接标识诊疗用抗体，则必须用异源动物制备抗体；,假如难以取得抗原，且抗体需要量少，则能够采取纯系小鼠制备。,普通试验室采取抗体，多用兔和羊制备，因动物反应良好，而且能够提供足够数量血清。,蛋白质免疫印迹技术专家讲座,第22页,蛋白质免疫印迹技术专家讲座,第23页,（三）抗原,抗原是各种多样，就其化学成份而言，有蛋白质抗原、类脂抗原、多糖类抗原和核酸抗原等。,为了取得很好抗血清，,最好是选取蛋白质抗原,。,不一样抗原，其免疫原性强弱均不相同，这种免疫原性强弱取决于抗原分子量、化学活性基团、立体结构等。,蛋白质免疫印迹技术专家讲座,第24页,（四）免疫路径,免疫路径有各种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、,皮下,、淋巴结内注射等。,普通惯用,皮下或背部多点皮内注射,，每点注射,0.1mL,左右。,试验中,0.2mL,，,3,4,点注射。,蛋白质免疫印迹技术专家讲座,第25页,皮下注射,蛋白质免疫印迹技术专家讲座,第26页,（五）佐剂,应用佐剂目标,是为了提升抗原对机体免疫原性，从而提升抗体效价。,蛋白质免疫印迹技术专家讲座,第27页,佐剂主要可分为两种：一个本身含有免疫原性，如百日咳杆菌、抗酸杆菌（结核分枝杆菌）以及革兰阴性杆菌等；另一个本身无免疫原性，如氢氧化铝、磷酸钙、矿物油乳剂、表面活性剂等。,当前实践中常应用佐剂,福氏佐剂,。,蛋白质免疫印迹技术专家讲座,第28页,福氏佐剂,（,Freundadjuvant,）,通常是由羊毛脂,1,份、石腊油,5,份。这是,不完全福氏佐剂,。,在每毫升不完全佐剂加入,1,20mg,卡介苗就成为,完全佐剂,。,蛋白质免疫印迹技术专家讲座,第29页,（六）免疫方法,抗原剂量，首次剂量为,10,50g,，加强免疫剂量约为首次剂量,1/4,。,首次免疫时抗原与完全佐剂等体积混合。加强免疫时用不完全佐剂。,每,2,3,周加强免疫一次。,在第,2,次加强免疫后,2,周，从耳缘静脉取,2,3mL,血，制备血清，检测抗体效价。如未到达预期效价，需再进行加强免疫，直到满意时为止。当抗体效价到达预期水平时，即可放血制备抗血清。,蛋白质免疫印迹技术专家讲座,第30页,抗体产生次序与丰度,蛋白质免疫印迹技术专家讲座,第31页,（七）抗血清采集与保留,取兔血有两种方法，一是耳缘静脉或耳动脉放血，一是颈动脉放血，也可心脏采血。,小鼠取血。,搜集血液置于室温下,1h,左右，凝固后，置,4,下，过夜（切勿冰冻）析出血清，离心，,4000rpm,10min,。在无菌条件，吸出血清，分装（,0.05,0.2mL,），贮于,-80,以下冰箱，或冻干后贮存于,4,冰箱保留。,蛋白质免疫印迹技术专家讲座,第32页,（八）抗血清质量评价,在免疫期间，不但各个不一样动物，而且同一动物在不一样时间内抗血清效价、特异性、亲协力等都可能发生改变，因而必须经常地采血测试。只有在反抗血清效价、特异性、亲协力等方面作彻底评价后，才可使用所取得抗血清。,蛋白质免疫印迹技术专家讲座,第33页,效价抗血清效价，就是指血清中所含抗体浓度或含量。效价测定方法惯用是,单向扩散免疫法,，此法对全部抗体均适用。,一些由大分子（如蛋白类）抗原所产生抗体，可用,双扩散,等方法测定。,蛋白质免疫印迹技术专家讲座,第34页,单向扩射免疫法,：以不一样稀释度抗血清与优质标识抗原混合，孵育,24h,后，测定其结合率。通常以结合率为,50%,血清稀度和,为效价。,如某抗血清结合率为,50%,时稀释度为,1,：,15000,则该血清效价就是,1,：,15000,制备含有一定浓度抗血清琼脂凝胶板（抗体固定不变）。打孔，加入不一样稀释度抗原量，进行免疫扩散。抗原与对应抗体在浓度适当时，则形成清楚沉淀环，其直径大小与所加抗原量成正比。将已知,参考抗原形成沉淀环绘成曲线，然后以待测标本沉淀环直径查标准曲线，计算出待测抗原含量。,蛋白质免疫印迹技术专家讲座,第35页,蛋白质免疫印迹技术专家讲座,第36页,双向扩散法：利用大分子抗原和抗体在琼脂平板上扩散，二者在相交处产生沉淀线，以观察和判断抗血清中是否有抗体及其浓度。,双向免疫扩散,蛋白质免疫印迹技术专家讲座,第37页,免疫扩散试验,1,抗原；,2,7,为不一样稀释倍数抗体,蛋白质免疫印迹技术专家讲座,第38页,分 子 杂 交 原 理 及 流 程 图,样 品 制 备,电 泳,杂 交,转 膜,结果显示,探 针 制 备,第二部分,Western,blotting,检测抗血清,蛋白质免疫印迹技术专家讲座,第39页,Western Blot,原理,将经过,PAGE,分离蛋白质转移到,NC,膜或,PVDF,膜上；,然后与能特异性识别待检蛋白抗体进行反应；,洗涤去除没有结合特异性抗体后；,加入标识、能识别特异性抗体种属特异性抗体，反应一段时间后再次洗涤去除非特异性结合标识抗体；,加入适合标识物检测试剂进行显色或发光等，观察有没有特异性蛋白条带出现。,蛋白质免疫印迹技术专家讲座,第40页,蛋白质免疫印迹技术专家讲座,第41页,免疫印迹试验包含五个步骤：,固定：蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（,PAGE,）并从胶上转移到硝酸纤维素膜上。,封闭：保持膜上没有,抗体,结合场所，使场所处于饱和状态，用以防止特殊性抗体单独结合到膜上。,蛋白质免疫印迹技术专家讲座,第42页,一抗杂交：初级抗体（第一抗体）是,特异性,。,二抗杂交：第二抗体或配体试剂对于初级抗体是特异性结合并作为指示物。,底物显色：被适当保温后酶标识蛋白质区带，产生可见、不溶解状态颜色反应。,蛋白质免疫印迹技术专家讲座,第43页,三、试验仪器,动物常规免疫,Western,blotting,检测抗血清,蛋白质免疫印迹技术专家讲座,第44页,动物常规免疫,注射器,蜗旋混合器,蛋白质免疫印迹技术专家讲座,第45页,四、操作步骤,动物常规免疫,Western,blotting,检测抗血清,蛋白质免疫印迹技术专家讲座,第46页,抗原提取与制备,1,）,0.5mg/mL,菠萝蛋白酶以,0.9%,生理盐水溶解,配置（加少许,NaOH,促溶,）（周二上、周五上）。,2,）,纯化鸡卵类粘蛋白（周四早晨）,。,3,）,1mg/mL,酪蛋白以,0.9%,生理盐水溶解,配置（加少许,NaOH,促溶）,（周四下午）,。,动物常规免疫,蛋白质免疫印迹技术专家讲座,第47页,苦味酸（以,75%,乙醇配置）标识小鼠,标识部位,组号,头,1,左前肢,2,左后肢,3,背,4,右前肢,5,右后肢,6,左耳朵,7,右耳朵,8,蛋白质免疫印迹技术专家讲座,第48页,初级免疫,：小鼠背部多点皮下注射，,0.2mL/,只小鼠,（,1,）抗原与佐剂混合：取,1.5mL,蛋白与,1.5mL,完全佐剂,混合，震荡混匀，制成,油包水,形态,（,2,）用酒精棉球消毒待注射部位,（,3,）皮下多点注射，每点注射量应小于,0.1mL,初级免疫后仔细观察小鼠对外源抗原反应，两周后进行加强免疫,蛋白质免疫印迹技术专家讲座,第49页,加强免疫：初级免疫后两周进行。,取,1.5mL,蛋白与,1.5mL,不完全佐剂,混合震荡混匀，制成油包水形态。,加强免疫,：小鼠背部多点皮下注射，,0.15mL/,只小鼠,（,1,）用酒精棉球消毒待注射部位,（,2,）皮下多点注射，每点注射量应小于,0.1mL,。,第二次加强免疫,：加强免疫一周后进行。操作相同。,第二次加强免疫后一周，即可采血，搜集抗血清。,小鼠取血。搜集血液置于室温下,1h,左右，凝固后，置,4,下，析出血清，离心，,3000rpm,10min,。吸出血清，分装（,0.05,0.2mL,），贮于,-20,以下冰箱保留。,蛋白质免疫印迹技术专家讲座,第50页,Western Blot,普通流程,蛋白样品制备,SDS,PAGE,转膜,封闭,一抗杂交,二抗杂交,底物显色,蛋白质免疫印迹技术专家讲座,第51页,转移电泳设备,Western,blotting,检测抗血清,蛋白质免疫印迹技术专家讲座,第52页,蛋白质免疫印迹技术专家讲座,第53页,转膜,膜选择,尼龙膜,硝酸纤,维素膜,封闭非特异性抗体结合麻烦,简单快速封闭非特异性抗体结合,价格昂贵,价格廉价,特殊要求下选择,需要更高蛋白结合率,（尼龙膜：,480g/cm,2,；硝酸纤维素膜：,80g/cm,2,）,目标蛋白与硝酸纤维膜结合能力弱,需要更大机械强度,蛋白质免疫印迹技术专家讲座,第54页,转膜,半干法,将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿,润滤纸之间，电转,10,30min,。,湿法,将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装,置缓冲液中，电转,45min,或过夜。,蛋白质免疫印迹技术专家讲座,第55页,封闭,脱脂奶粉（,5,）,BSA,Western Blot,膜封闭液（生物试剂企业提供）,蛋白质免疫印迹技术专家讲座,第56页,一抗、二抗孵育,把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，依据滤膜面积以,0.1ml/cm2,量加入加入一抗溶液与滤膜温育。,37,一小时，,4,过夜。,倒掉一抗溶液，用,PBS,漂洗液滤膜,3,次，每次,10min,。,加入用封闭液配制二抗，摇床上迟缓摇动，,37,一小时，,4,过夜。,倒掉一抗溶液，用,PBS,漂洗液滤膜,3,次，每次,10min,。,蛋白质免疫印迹技术专家讲座,第57页,二抗与底物反应显色,辣根过氧化物酶法,（,HRP,）,碱性磷酸酶法（,AP,）,化学发光显色法,蛋白质免疫印迹技术专家讲座,第58页,辣根过氧化物酶,EC 1.11.1.7,。一个糖蛋白，因为在辣根中该酶含量很高，故名。,它以铁卟啉为辅基，在过氧化氢存在时能催化苯酚、苯胺及其取代物聚合。,蛋白质免疫印迹技术专家讲座,第59页,HRP,惯用生色底物有：,DAB,二氨基联苯胺,TMB,四甲基联苯胺,OPD,邻苯二胺,普通免疫印迹中，显色反应采取生成不溶性产物底物,DAB,。,蛋白质免疫印迹技术专家讲座,第60页,五、试验结果与分析,酶标法显色,化学发光法显色,蛋白质免疫印迹技术专家讲座,第61页,