微生物工程样本.doc

资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。
绪论:
1. 微生物工程: 微生物工程是渗透有工程学的微生物学, 是发酵技术工程化的发展。
2. 微生物反应过程的特点:
优点: ( 与化学工程相比)
1、 生产过程一般在常温常压下进行, 操作条件温和, 不需考虑防爆问题, 一种设备具有多种用途。2、 原料以碳水化合物为主, 不含有毒物质。3、 生产过程是以生命体的自动调节方式进行的, 因此多个反应就象一个反应一样, 可在单一设备( 发酵罐) 中进行。4、 能容易地生产复杂的高分子化合物, 如酶、 光学活性体等。5、 能高度选择性地进行复杂化合物在特定部位反应, 如氧化、 还原、 官能团导入等。6、 生产产品的生物体本身也是发酵产物, 富含维生素、 蛋白质、 酶等有用物质; 除特殊情况外, 培养液一般不会对人和动物造成危害。7、 经过微生物菌种改良, 能够利用原有设备使生产飞跃上升。
缺点: 1、 底物不能完全转化成目的产物, 副产物的产生不可避免, 因而造成提取和精制困难, 这是当前发酵行业下游操作落后的原因之一。
2、 微生物反应是活细胞的反应, 产物的获得除受环境因素影响外, 也受细胞内因素的影响, 且菌体易发生变异。
3、 原料是农副产品, 虽然价廉, 但质量波动较大。
4、 生产前准备工作量大, 花费高, 相对化学反应而言, 反应器效率低。
5、 一般底物浓度不能过高, 且要在无杂菌污染情况下进行。
6、 发酵废水常具有较高的BOD 和COD, 需处理后排放。
3.微生物工程发展简史
传统的微生物发酵技术——天然发酵
第二代( 近代) 微生物发酵技术——深层培养技术
第三代发酵技术——微生物工程
红细胞生成素(治疗贫血)生长激素( 促进生长)胰岛素(治疗糖尿病)干扰素(抗病毒、 抗肿瘤)
单细胞蛋白SCP( 酵母、 真菌等)
4.微生物工程产品类型
1、 微生物菌体的发酵:SCP、 药用真菌( 冬虫夏草、 茯苓等) 生物防治制剂( 如苏云金杆菌)
活性乳制剂
2.微生物酶发酵:各种酶制剂(糖化酶、 氨基酰化酶( DL氨基酸光学拆分) 、 蛋白酶、 脂肪酶等)
3、 微生物代谢产物发酵:
初级代谢产物:与菌体生长相伴随的产物。F 氨基酸、 核苷酸、 维生素、 有机酸、 溶剂
菌体对其合成反馈控制严密, 一般不过量积累
次级代谢产物: 与菌体生长不相伴随, 以初级代谢产物为原料而合成。
抗生素、 生物碱、 毒素、 胞外多糖等 结构常较复杂对环境条件敏感
4、 微生物的生物转化 5、 微生物特殊机能的利用
5.微生物工程的内容: 微生物工程基本上可分为发酵和提取两部分。
发酵部分也称发酵工程, 是微生物反应过程;
提取部分也称后处理, 或下游加工技术。
第一章 微生物工程菌种
1.发酵工业对微生物菌种的要求: 1、 能在廉价原料制成的培养基上迅速生长, 并形成所需的代谢产物, 产量高。2、 能够在易于控制的培养条件下迅速生长和发酵, 且所需酶活力高。3、 根据代谢控制的要求, 选择单产高的营养缺陷型突变株或调节突变株或野生菌株。
4、 选育抗噬菌体能力强的菌株, 使其不易感染噬菌体。
5、 菌种纯粹, 不易变异退化, 以保证发酵生产和产品质量的稳定性。
6、 菌种不是病原菌, 不产生有害的生物活性物质和毒素, 以保证安全。
2.发酵工业中常见微生物菌种
细菌: 枯草芽孢杆菌: 能产生大量淀粉酶和蛋白酶。
大肠杆菌( Escherichia coli): 制取天冬氨酸、 苏氨酸、 缬氨酸等。
乳酸杆菌 (Lactobacillus sp.): 革兰氏阳性, 无芽孢, 厌氧或兼性厌氧。
丙酮丁醇梭菌: 专性厌氧 发酵生产丙酮丁醇。
肠膜状明串珠菌: 糖厂有害菌
棒状杆菌 : 生产谷氨酸等
放线菌: 因其菌落呈放射状而得名。 酵母菌: 单细胞真核 霉菌
3.凡能引起生物体遗传物质发生变异的因素, 统称诱变剂。
4.菌种保藏:
保藏方法:1、 斜面冰箱保藏法 2、 沙土管保藏法
3、 菌丝速冻法 4、 石蜡油封存法
5、 真空冷冻干燥保藏法 6、 液氮超低温保藏法
第二章 微生物的代谢调控与代谢工程
1. 微生物自我调节的部位: 1、 养分吸收分泌的通道。2、 限制基质与酶的接近。
3、 代谢途径通量的控制。
微生物控制代谢物流的方法有两种: 调节现有酶的量、 改变已有酶分子的活性
微生物自我调节的三个部位实际上也就是三个类型, 但都涉及到酶促反应调节。
酶促调节的方式包括酶活性调节和酶合成调节两大类。
2.酶活性调节: 酶活性的调节方式: 共价修饰, 变(别)构效应, 缔合与解离, 竞争性抑制
共价修饰: 指蛋白质分子中的一个或多个氨基酸残基与一化学基团共价连接或解开, 使其活性改变的作用。 共价修饰分可逆和不可逆两种
蛋白质的共价结合部位一般为丝氨酸残基的-CH2OH
变构控制: 是指一种小分子物质与一种蛋白质分子发生可逆的相互作用, 导致这种蛋白质的构象发生改变, 从而改变这种蛋白质与第三种分子的相互作用。
变构蛋白是表现变构效应的蛋白, 如阻遏蛋白
具有变构作用的酶称作变构酶
激活、 抑制两个矛盾的过程; 普遍存在于微生物代谢中。
缔合与解离: 能进行这种转变的蛋白质由多个亚基组成; 蛋白质活化与钝化是经过亚基缔合与解离实现的;
竞争性抑制: 一些蛋白质的生物活性受代谢物的竞争性抑制
有些酶受反应过程产物的竞争性抑制
3. 酶合成的调节: 凡是能促进酶合成的调节称为诱导; 而能阻碍酶合成的调节称为阻遏。
同调节酶的活性的反馈抑制等相比, 经过调节酶的合成而实现代谢调节的方式是一类较间接而缓慢的调节方式; 其优点是经过阻止酶的过量合成, 有利于节约生物合成的原料和能量。
4.酶合成调节的类型: 诱导 阻遏( 末端产物阻遏, 分解代谢产物阻遏)
5.酶合成的诱导: 组成酶: 不依赖于酶底物或类似物的存在而合成( 如葡萄糖转化为丙酮酸过程中的各种酶)
诱导酶: 依赖于某种底物或底物的结构类似物的存在而合成( 如大肠杆菌乳糖利用酶)
诱导剂能够是诱导酶的底物, 也可是底物的结构类似物。
诱导剂也能够不是该酶的作用底物。
酶的作用底物不一定有诱导作用。
酶的诱导可分两种: 1) 同时诱导
当诱导物加入后, 同时或几乎同时诱导几种酶的合成; 主要存在于短的代谢途径中。
2） 顺序诱导 先合成能分解底物的酶, 再依次合成分解各中间代谢物的酶, 以达到对较复杂代谢途径的分段调节。
6. 酶合成的阻遏(repression):
末端产物阻遏 (end-product repression): 指由某代谢途径末端产物过量积累而引起的阻遏。
普遍存在于氨基酸核苷酸生物合成途径中。
分解代谢物阻遏 (catabolite repression): 是指两种碳源( 或氮源) 分解底物同时存在时, 细胞利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关分解酶合成的现象。
这种抑制青霉素合成及乳糖利用的现象, 起初认为只有葡萄糖才会产生, 故称为葡萄糖效应。所有能够迅速利用或代谢的能源, 都能阻遏异化另一种被缓慢利用能源所需酶的合成。
阻遏作用并非快速利用的碳源( 或氮源) 本身作用的结果; 而是其分解代谢过程中所产生的中间代谢物引起;
7. 酶合成调节的分子机制: 当前认为, 由Monod和Jacob提出的操纵子假说能较好地解释酶合成的诱导和阻遏。
操纵子: 启动基因(promoter) 操纵基因(operator) 结构基因(structural gene)
诱导型操纵子( inducible operon) 阻遏型操纵子( repressible operon)
调节基因(regulator gene): 一般位于相应操纵子的附近, 也可远离操纵子; 编码组成型调节蛋白。
调节蛋白(regulatory protein)是一类变构蛋白, 有两个特殊位点, 其一可与操纵基因结合, 另一位点可与效应物结合。
调节蛋白有两种: 阻遏物(repressor):能在没有诱导物时与操纵基因结合。
阻遏物蛋白( aporepressor) : 只能在辅阻遏物存在时才能与操纵基因结合。
效应物(effector): 指一类低分子质量的信号物质( 如糖类及其衍生物、 氨基酸、 核苷酸等) 。
诱导物(inducer) 辅阻遏物(corepressor)
酶的诱导机制: (以E.coli乳糖操纵子为例)
乳糖操纵子是负调节的代表, 在缺乏乳糖等诱导物时, 由调节基因(lacI)编码的调节蛋白( 即lac阻遏物) 一直结合在操纵基因上, 抑制着结构基因转录的进行。
末端产物(反馈)阻遏机制:(以色氨酸操纵子为例)
色氨酸操纵子的阻遏是对合成代谢酶类进行正调节的典例。
分解代谢阻遏机制: (以葡萄糖分解代谢物对乳糖分解酶的阻遏为例) 双重调控
RNA水平的调节机制: 弱化子的弱化调节
不是使正在转录的过程全部在中途停止, 故称弱化作用(attenuation)。
色氨酸合成代谢调节中存在反馈抑制, 反馈阻遏, 弱化调节, 表明了微生物代谢调节的复杂性。
8. 二元调节系统: 近年来越来越多的二元调节系统在原核微生物中被发现
含有两种蛋白: 传感器( 或发射器) 跨膜蛋白
调节器( 或接受器) 可溶性蛋白
9.分支生物合成途径的调节
同工酶( isoenzyme) 调节: 某一分支途径中的第一步反应可由多种酶催化, 但这些酶受不同的终产物的反馈调节. (酶的分子结构不同)。

协同反馈调节(concerted feedback regulation)
需有一种以上终产物的过量存在方有明显的效果; 单个终产物过量, 不产生或只产生很小的影响。
累加反馈调节 (cumulative feedback regulation): 每一种末端产物过量只能部分抑制或阻遏, 总的效果是累加的。
增效反馈调节 (cooperative feedback regulation): 代谢途径中任一末端产物过量时, 仅部分抑制共同反应中第一个酶的活性, 但两个末端产物同时过量时, 其抑制作用可超过各末端产物产生的抑制作用的总和。
顺序反馈调节 (sequential feedback regulation): 分支途径中几个末端产物抑制分支点后面第一个酶, 使分支点产物积累, 结果分支点产物又反馈抑制共同途径中的第一个酶, 最后使整个代谢途径停止。
联合激活或抑制调节: 由一种生物合成的中间产物参与两个完全独立的、 不交叉的合成途径的控制。这种中间体物质浓度的变化会影响这两个独立代谢途径的代谢速率。
10.能荷调节——指细胞经过改变ATP、 ADP、 AMP三者比例来调节其代谢活动, 也称腺苷酸调节。
11.克服反馈抑制和反馈阻遏的调控:
可从以下两方面着手: 降低末端产物浓度, 应用抗反馈突变株
降低末端产物浓度: 营养缺陷型的利用 渗漏缺陷型的利用: 酶活力下降而不完全丧失。
提高细胞渗透性
抗反馈调节突变株的利用:
抗反馈突变株一般能够用添加末端产物类似物的方法来筛选获得。
从营养缺陷型的回复突变株也能获得抗反馈的突变菌株。
12.克服分解代谢阻遏的调控: 避免使用有阻遏作用的碳源和氮源, 流加碳源或氮源
利用抗分解代谢阻遏的突变体
13.对诱导调节的控制: 常见手段有: 添加诱导物类似物, 添加辅酶或辅助因子, 利用组成型突变株
14.提高初级代谢产物产量的方法:1使用诱导物, 2除去诱导物——选育组成型产生菌, 3降低分解代谢产物浓度, 减少阻遏的发生, 4解除分解代谢阻遏——筛选抗分解代谢阻遏突变株, 5解除反馈抑制——筛选抗反馈抑制突变株6、 防止回复突变的产生和筛选负变菌株的回复突变株7改变细胞膜的通透性8、 筛选抗生素抗性突变株9、 选育条件抗性突变株10、 调节生长速率11、 加入酶的竞争性抑制剂
15.提高次级代谢产物产量的方法
1、 补加前体类似物2、 加入诱导物3、 防止碳分解代谢阻遏或抑制的发生4、 防止氮代谢阻遏的发生5、 筛选耐前体或前体类似物的突变株6、 选育抗抗生素突变株
7、 筛选营养缺陷型的回复突变株
16.代谢工程的研究对象: 代谢工程的研究对象就是代谢网络
代谢网络分流处的代谢产物称为节点 ( Node) 。
节点类型: 柔性节点 刚性节点 半柔性节点
其中对终产物合成起决定作用的少数节点称为 主节点。
主节点不是固定不变的。
17.代谢网络组成的途径类型: 收敛途径, 中心代谢途径, 发散途径
18.代谢网络结构的基本类型: 独立型 和 依赖型

第 四 章 生物反应器 ( 发酵罐)
1.发酵罐: 厌氧发酵罐 ( 嫌气发酵罐) 好氧发酵罐 ( 通风发酵罐)
厌氧发酵罐 : 酒精 丙酮 丁 醇 乳酸 啤酒等
好氧发酵罐 : 机械搅拌式、 自吸式、 气升式 、 高位筛板式等
味精、 柠檬酸、 抗生素、 酶制剂、 氨基酸、 SCP

第三章发酵培养基
1.培养基的类型:
按培养基成分:
合成培养基( 所用原料的化学成分明确、 稳定 如葡萄糖、 硫酸铵)
天然培养基( 原料是一些天然动、 植物产品 如花生饼粉、 蛋白胨等)
按用途分:
基础培养基、 富集培养基、 选择培养基、 鉴别培养基
孢子培养基、 种子培养基、 发酵培养基
孢子培养基: 供菌种繁殖孢子的培养基, 常见固体培养基。
种子培养基: 供孢子发芽、 生长和菌体繁殖的培养基。
发酵培养基: 供菌体生长、 繁殖和合成大量代谢产物用的培养基。
2. 发酵培养基的成分及来源:
1. 碳源:
主要功能: 1) 为菌体的生长繁殖提供能源和合成菌体所必须的成分;
2) 为合成目的产物提供所需的碳素成分
常见碳源: 糖类、 油脂、 有机酸、 低碳醇等
糖类: 发酵培养基中使用最广泛的碳源;主要有葡萄糖、 糖蜜和淀粉糊精等
2.氮源
有机氮源: 豆饼( 粕) 粉、 花生饼粉、 鱼粉、 蚕蛹粉、 酵母粉、 玉米浆、 尿素等
无机氮源: 铵盐、 硝酸盐等
无机氮源和尿素、 玉米浆等可被迅速利用, 为速效氮;
蛋白质氮则需先水解成肽和氨基酸后才能被吸收利用, 属迟效氮
3.无机盐和微量元素
磷酸盐( 缓冲剂) 硫酸镁( 激活剂)
钾盐( 许多酶的激活剂) 微量元素
4.生长因子:微生物生长不可缺少的微量有机物质。
类别: 维生素、 氨基酸、 嘌呤嘧啶及其衍生物
5.前体 (precursor):指某些化合物加入到发酵培养基中, 能直接被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去, 而其自身的结构并没有多大变化, 可是产物的产量却因加入前体而又较大的提高。
6促进剂: 促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物, 又非前体, 但加入后却能提高产量的添加剂。
抑制剂:抑制某些代谢途径的进行, 同时刺激另一代谢途径, 以致能够改变微生物的代谢途径。
第五章 灭菌工程及空气净化
1.空罐灭菌(空消)
目的: 1) 消除罐内死角, 确保下一批发酵的成功
2) 杀灭与罐直接相通的各管路、 阀门的微生物
3) 杀灭上批发酵的活的微生物, 减轻环境污染
步骤: ( 热蒸汽法)
1) 先彻底清洗2) 从底部通入蒸汽3) 排冷气4) 升压 打开各个需灭菌的管路、 放气阀等
5) 保压6) 降温 关闭各放气阀, 切断汽源, 慢慢放气; 或自然冷却, 或泵循环水加速冷却。
2.加热灭菌原理
微生物对热的抵抗力称为热阻( heat resistance) 。
杀死微生物的极限温度称为致死温度。
热力致死时间: 在特定条件、 特定温度下, 杀死某种微生物所需的最短时间。
利用一定温度进行加热, 90%的活菌被杀死时所需的时间(min)即为D值。
在加热致死时间曲线中, 加热时间缩短90%所需升高的温度, 即为Z值。
培养基灭菌采用高温短时间的方法, 有利于减少营养成分的破坏。
3. 影响培养基灭菌的主要因素:
1、 微生物热阻 2、 pH 3、 菌的浓度4、 培养基成分5、 泡沫( 加入消泡剂) 6、 颗粒
4.实罐灭菌
操作: 1.预热 向夹套或蛇管中通入蒸汽, 间接将培养基加热至70℃左右。
作用: 利于糊化; 减少冷凝水的生成; 减轻噪音
2.开启蒸汽管, 向培养基中通入蒸汽, 升温。
3.罐压达1kg/cm2 ( 0.1 MPa)时, 按装在发酵罐封头的接种管、 补料管、 消泡剂管等应排汽。
4.保温 调节好各进汽和排汽阀门, 使罐压和温度保持在一稳定水平, 维持一定时间。
在保温阶段, 凡进口在培养基液面下的各管道都应通入蒸汽; 在液面上的其余管道则应排放蒸汽, 这样才能保证灭菌彻底, 不留死角。
6、 保温结束后, 依次关闭各排汽、 进汽阀; 待罐内压力降至0.5kg/cm2左右时, 向罐内通入无菌空气, 向夹套或蛇管中通入冷水, 使培养基降至所需温度。
通入无菌空气的作用: 加速降温; 保持罐内正压
5分批灭菌的优缺点:
优点:
●　不需专门的灭菌设备, 投资少、 设备简单、 灭菌效果可靠。
●　对蒸汽的要求较低, 一般3-4kg/cm2即可满足。
缺点: 在灭菌过程中蒸汽用量变化大, 造成锅炉负荷波动大
6. 连续灭菌的优缺点及注意事项:
优点: 1) 可采用高温短时灭菌, 培养基受热时间短, 营养成分破坏少, 有利于提高发酵产率; 2) 蒸汽负荷均衡, 锅炉利用率高, 操作方便。3) 适于自动控制, 降低劳动强度。
缺点: 设备复杂, 投资大
7. 空气的净化: 除尘; 除水; 除菌
气液分离器: 分离空气中被冷凝成雾状的水雾和油雾。
第 六 章 种 子 扩 大 培 养
实验室种子制备阶段: 琼脂斜面 固体培养基扩大培养 摇瓶液体培养
生产种子制备阶段: 种子罐扩大培养
种子罐级数是指制备种子需逐级扩大培养的次数。
对于生长快的细菌, 种子用量比例小, 故种子罐相应也少。这称为一级种子罐扩大培养, 也称二级发酵。
生长较慢的菌种, 如青霉素生产菌种, 其孢子悬浮液接入一级种子罐扩大培养于27℃培养40h, 此时孢子发芽, 长出短菌丝, 再移至含有新鲜培养基的第二级种子罐, 于27℃培养10～24h, 菌丝迅速繁殖, 获粗壮菌体, 即可移至发酵罐作为种子。这称为二级种子罐扩大培养, 也称三级发酵。
生长更慢的菌种, 链霉素生产菌种灰色链霉菌, 一般采用三级种子罐扩大培养( 四级发酵)
种龄——种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。
一般, 种龄以菌体处于生命力极为旺盛的对数期, 且培养液中菌体量还未达到最高峰时, 较为合适。
接种技术: 压差法 : 接种瓶 压力差
火焰封口法: 在种子罐接种口周围设有沟槽, 沟槽内注入少量酒精, 点燃酒精使接种口被围在一圈火焰之中; 在火焰圈中即可将菌悬液倒入种子罐中。