人类细胞质RNA的提取.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,人类细胞质RNA提取,RT-PCR的原理、方法,琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用,第六组,人类细胞质RNA提取,真核细胞质总RNA主要由rRNA（80-85%）、,tRNA和核内小分子RNA(10-15%)、mRNA（1-5%）,组成，其中rRNA、tRNA和mRNA位于细胞质中。,分离提纯RNA的目的,分析不同发育时期基因的表达状况,获得新基因,研究基因的拼接,分析相应的蛋白产物,RNA的不稳定性,由于核糖残基的2,和3,位置带有羟基，RNA,易于被RNA酶切割水解,RNA酶含量丰富，加热后仍能够正确折叠恢复活,性，不易失活。,所以需要RNA酶抑制剂来抑制RNA酶的活性。,3、分离高质量RNA,RNA的质量决定了你能够转录到cDNA上的序列信息量的最大值。,（1）常用的RNA酶抑制剂,焦碳酸二乙酯（DEPC）,：,是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。,异硫氰酸胍：,目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。,氧钒核糖核苷复合物：,由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。,RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）,：,从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。,其它：,SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。,（2）RNA提取的一般步骤,RNA提取的一般步骤是,：,破碎组织分离RNA沉淀RNA洗涤RNA融解RNA保存RNA,破碎组织和灭活RNA酶可以同步进行,可以用盐酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎组织,加入-ME可以抑制RNA酶活性,分离RNA,一,半用酚、氯仿等有机溶剂，加入少量异戊醇，经过此步，离心，RNA一般分布于上层，与蛋白层分开。,沉淀RNA,一般用乙醇、3M NaAc（pH-5.2）或异丙醇。,洗涤RNA,使用70乙醇洗涤，有时，为避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能过于干燥，否则不易溶解。,融解RNA,一般使用TE。,保存RNA,应该尽量低温。为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏、肝脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存也应该如此。,由于RNA的种类来源很多，因而提取制备方法各异。本次介绍的是Trizol法制备RNA。,Trizol法提取RNA,TRIzol是一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从,细胞或组织中提取总RNA。其含有苯酚、异硫氰酸胍,等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。,在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，因此对纯,化RNA及标准化RNA的生产十分有用。,Trizol试剂主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解细,胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。,苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶,活性，因此TRIzol中还加入了8羟基喹啉、异硫氰酸胍、-,巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）。,Trizol试剂裂解细胞并释放出RNA,酸性条件使RNA与,DNA分离,加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。,RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA可以通,过异丙醇以沉淀的方式还原。在除去水样层后，乙醇能沉淀,析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。,【试剂】,DEPC(焦碳酸二乙酯),氯仿，异丙醇，无水乙,醇，0.050.1DEPCH2O，75乙醇，TE缓冲,液，琼脂糖。,【配制】,1.DEPC水：1ml1000ml双蒸水1,DEPC水，1000ml容量瓶中静置4小时。,2.75%乙醇：无水乙醇+DEPC水，-20保存（DEPC水需先高压）,实验用品,基本过程,一、抽提,二、分相,三、RNA沉淀,四、RNA清洗,一、抽提,细胞抽提,1.组织取材后用灭菌的锡箔纸包好保存于液氮。,实验时，在液氮中,将组织研磨成粉末,，趁液氮未挥,发将粉末转移到EP管，室温5000rpm,离心去上清,。,每50-100mg组织，,加入,1m,l,Trizol,，反复抽吸均匀。,二、分相,3.在装有裂解物的离心管中加入0.2ml的,氯仿,(为Trizol总体积的1/5),振荡,混匀,30秒，室温下,静置,5分钟.,4.12000 rpm,离心,15分钟4C,分相为三层。上层：RNA(约为Trizol的,60%)；中间：DNA；下层:蛋白质(酚-氯仿)。,5.小心,吸取上清液,，,转移,到另一EP管中。1ml裂解物产生的上清液体积,约为0.40.6 ml。有机相和中间层含有DNA和蛋白质,避免触及。,三、RNA沉淀,6.上清液加入约0.5ml的,异丙醇,振荡,30秒,混匀,。室温下,静置,10分钟。,7.4C，,离心,12000rpm 10分钟。,8.RNA沉淀将在离心底的侧面形成。小心,吸弃上清液,注意避免吸弃RNA,沉淀。,四、RNA清洗,9.离心管加入1ml 预冷的75%,乙醇,(1mlTrizol至少用,1ml乙醇清洗DNA),振荡混匀,30秒，使沉淀振荡起来，,室温,离心,12000rpm12分钟。尽可能,吸弃上清液,防止RNA沉淀丢失。,重复,以上清洗步骤一次。在75%乙醇中，RNA在4至少可以保存1周，20至少可以保存1年。,10.室温选择流动性小，倒置离心管于滤纸上，,干燥,RNA,，但不能完全干燥(510分钟)。用DEPC水15,l溶解沉淀，55-60孵育1015分钟。,11.测量OD值后，样品放置70保存，一个月,RT-PCR,RT-PCR,：逆转录PCR，或者称反转录PCR(reverse,transcription-PCR,RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一,种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成,为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。,应用,RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很,低拷贝数的RNA。广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于,定量监测某种RNA的含量。,oligo:多聚体，相当于mRNA引物,AMV RT：禽类成髓细胞瘤病毒逆转录酶,MMLV RT：莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶,dNTPs：脱氧核苷酸,RNase：RNA水解酶,PCR Buffer：RT-PCR缓冲液,MgCl2：2价镁离子,基本过程,由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作,“,逆转录,”,，由依赖RNA的DNA聚合酶即逆转录酶来完成。,随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。,原先的RNA模板被RNA酶 H降解，留下互补DNA。,RT-PCR的关键步骤是在RNA的反转录，要求,RNA模版为完整的且不含DNA、蛋白质等杂质。常,用的反转录酶有两种，即鸟类成髓细胞性白细胞病,毒（avian myeloblastosis virus,AMV）反转录酶和,莫罗尼鼠类白血病病毒（moloney murine leukemia,virus,MMLV）反转录酶。,琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖凝胶电泳主要是应用琼脂糖凝胶作为支,持物的电泳法，借助琼脂糖凝胶的分子筛作用，核,酸片段因其分子量或者分子形状的不同，电泳速度,有差异而分离，这种技术是基因操作中常用的一种,方法。,与其他支持物电泳最主要区别是：它兼有,“,分,子筛,”,和,“,电泳,”,的双重作用。,PCR产物在琼脂糖凝胶上的,电泳检测,在基因组DNA的提取中，用蒸馏水溶解提,取出的DNA，在1.0%的琼脂糖胶进行电泳，以,Marker(分子质量标准)作为参照，用5V/cm的电泳30-60分钟，最后采用EB溶液进行染色后在凝胶成像系统中进行观察拍照。,结果初步分析,数量分析：条带的宽度，,荧光的亮度。,质量分析：纯度,分子量,谢谢,