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总RNA提取常用方案

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2020年4月19日
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试剂盒快速提取
实验方法原理
GTC和N-十二烷基肌氨酸钠的联合使用，将促使核蛋白复合体的解离，使RNA 与蛋白质分离，并将RNA 释放到溶液中。而进一步从复合体中纯化RNA ，则根据Chomc zynski和Sacchi的一步快速抽提法进行，采用酸性酚-氯仿混合液抽提。低pH值的酚将使RNA 进入水相，这样使其与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离。水相中的RNA 可用异丙醇沉淀浓缩。进一步将上述RNA 沉淀复溶于GTC溶液中，接着用异丙醇进行二次沉淀，随后用乙醇洗涤沉淀，即可去除所有残留的蛋白质和无机盐，而RNA 中如含无机盐，则有可能对以后操作中的一些酶促反应产生抑制。
实验材料
微生物动物细胞植物组织
试剂、试剂盒
RNA 提取试剂盒焦碳酸二乙酯乙醇
仪器、耗材
恒温水浴冷冻高速离心机紫外分光光度计取液器电泳仪电泳槽
实验步骤
一、细胞或组织破碎

1.  微生物材料

（1）发酵3~4天（或对数生长期）的菌体，离心收集菌丝体（动植物材料无需此步处理）。

（2）用经DEPC处理的水洗菌丝体2~3次，并尽量除去残存的水。

（3）加液氮充分研磨，使其成为粉末，以释放RNA。

（4）研磨后的样品转移至12 ml 变性液的容器中匀浆。

2.  动植物细胞培养材料 （适用的样品量为细胞：108）

（1）细胞或组织培养：按常规方法进行。

（2）深层悬浮培养细胞的破碎。

①细胞收集：含一定浓度的细胞培养液置于无菌离心管中，4℃，3 000 g 离心5分钟。

②细胞洗涤：上步沉淀用25 ml 灭菌后冰冻的1×PBS缓冲液洗涤，然后4℃，3 000 g 离心5分钟。

③细胞破碎：在沉淀细胞中加入15 ml 预冷的变性液，用无菌处理过的匀浆器匀浆。

3.  表面培养细胞的破碎

（1）确定培养瓶数量，使选定的各培养瓶细胞累加后总量达108。

（2）细胞收集：将培养液倒掉，用预冷的无菌PBS缓冲液洗涤一次，在培养瓶中加入8 ml 预冷变性液。

（3）转动培养瓶，使细胞溶解，此时可见粘度加大。

（4）用无菌吸管将第一个培养瓶中的液体吸入第二个培养瓶，旋转，溶解细胞，再吸入第三个培养瓶，以此类推。

（5）直到将所选定的培养瓶全部洗涤一次，然后从第一个培养瓶开始再加入4毫升上述变性液，将所有培养瓶洗一次。

（6）将上述12 ml 含细胞的变性液转移至一50 ml 无菌离心管中，匀浆破碎细胞。

4.  植物组织破碎 （适用的样品量为0.05 g 组织）

（1）将600 ul 变性液置于1.5 ml 离心管中，将此离心管放于冰浴中5分钟。

（2）将0.05 g 新鲜组织用液氮冰冻。

（3）在液氮下，研磨组织块。

（4）待液氮挥发后，将上述分散的组织转移至无菌离心管中。

5.  动物组织破碎 （适用的样品量为1 g 组织）

（1）将12 ml 变性液置于50 ml 离心管中，将此离心管放于冰浴中5分钟。

（2）在上述管中加入1 g 新鲜或冰冻动物组织，匀浆粉碎。

二、RNA 的抽提

1.  在经变性液匀浆的细胞或组织600 ul+60 ul pH4.0的2 M 乙酸钠彻底混匀，可用漩涡振荡器。

2.  600 ul 酚\氯仿\异戊醇（25\24\1），彻底混匀或漩涡振荡器振荡10秒。

3.  冰裕中10~15分钟，离心，4℃，10 000 g，20分钟。

4.  上层水相吸至无菌离心管中加等体积的异丙醇，-70℃，30分钟沉淀RNA。

5.  离心4℃，10 000 g，20分钟。

6.  沉淀RNA ，冷冻干燥15分钟 ， RNA 沉淀重新溶于300 ul 变性液中，可振荡（有时为了帮助溶解，可在65℃加热，但时间应极短）。

7.  60 ul pH4.0的2 M 乙酸钠彻底混匀，可用漩涡振荡器。

8.  600 ul 酚\氯仿\异戊醇（25\24\1），彻底混匀或漩涡振荡器振荡10秒。

9.  冰裕中10~15分钟，离心，4℃，10 000 g，20分钟。

10.  上层水相吸至无菌离心管中。

11.  等体积异丙醇二次沉淀（-70℃，30分钟），75%乙醇洗沉淀，沉淀冷冻干燥。

12.  复溶于去RNA 酶的水中（对于准备长期保存的RNA 可加入pH 5.0的乙酸钠至终浓度为0.25 M，再加入2.5体积的乙醇，-70℃保存。）。
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注意事项
1.  研磨组织块用于RNA 提取的样品，必须是新鲜的细胞或组织，如采样后，不能立即用于提取则样品应用液氮速冻并贮于-70℃的冰箱中保存。

2.  变性液及相应的离心管需预冷。
其它
1.  变性液组成

25 g异硫氰酸胍溶于33 ml CSB(42 mM pH4.0乙酸钠、0.83%十二烷基肌氨酸钠、0.2 mM β-巯基乙醇)，65℃溶解，过滤灭菌，4℃预冷。

2.  酸性酚配制

55℃时，500 g酚溶入500 ml 50 mM，pH4.0乙酸钠，混匀，静止分层后，去上清，再重复加500 ml 50 mM，pH4.0乙酸钠，直到pH<4.1。

氯化锂提取法
实验方法原理
用高浓度尿素变性蛋白并抑制RNA 酶，用氯化锂选择沉淀RNA ，其特别适合于从大量样品中提取少量组织RNA ，具有快速简洁的长处，但也存在少量DNA的污染及RNA 得率不高，小RNA 片断丢失的缺陷。
实验材料
微生物动物细胞植物组织
试剂、试剂盒
氯化锂尿素Tris-HCLEDTASDS
仪器、耗材
恒温水浴冷冻高速离心机紫外分光光度计取液器电泳仪电泳槽
实验步骤
一、组织或细胞匀浆
1.  对于大量组织或细胞，则每克组织或细胞加入5~10 ml 氯化锂-尿素溶液，匀浆器高速匀浆2分钟。
2.  对于少量细胞（107个细胞/ml），则每克组织或细胞加入0.5 ml 氯化锂—尿素溶液手工匀浆，并转移至Eppendof管中。

二、纯化
1.  匀桨液在0~4℃放置4小时后，12 000 g 离心30分钟。
 2.  取沉淀，加入原匀桨液1/2体积的氯化锂—尿素溶液，重复步骤1。
 3.  沉淀用原匀浆液1/2体积的氯化锂—尿素溶液复溶后，加入等体积酚/氯仿/异戊醇在室温放置15~30分钟并不时摇动混匀，4 000 g 离心5分钟。
 4.  取上层水相，加1/10倍体积的3 M 乙酸钠（pH5.2）及2倍体积的乙醇，-20℃放置1小时，5 000 g 离心。
 5.  70%乙醇洗沉淀一次，真空干燥。
 6.  RNA 溶解液溶解沉淀，得RNA 。

三、保存

分装，于-70℃保存。

一步法
实验材料
RNA
试剂、试剂盒
乙酸钠氯仿异戊醇异丙醇乙醇SDS酚
仪器、耗材
离心机分光光度计摇床
实验步骤
1.  组织来源材料：100 ng 组织加1 μl 变性液，在玻璃Teflon匀浆器中将其匀浆。

2.  培养细胞：离心弃悬浮细胞培养液或倒去单层培养细胞培养液（不需用生理盐水洗涤），每107细胞加入1 ml 变性液，然后用吸管抽吸7~10次。

3.  将匀浆移入5 ml 聚丙烯管子，加入0.1体积的2 mol/l pH4.0的乙酸钠缓冲液，混匀。

4.  加入1 ml 水饱和酚，混匀；再加入0.2体积的49：1氯仿/异戊醇。

5.  混匀后0~ 4℃放置15 min。

6.  于4℃用SS-34转子10 000 g 离心20 min，将上层水相移入一个干净试管中。

7.  加入1 ml （等体积）异丙醇-20℃放置30 min 沉淀RNA，于4℃ 10 000 g 离心10 min。

8.  将RNA溶解于0.3 ml 变性液，并移入1. 5 ml 微量离心管中，加0.3 ml 异丙醇,。

9.  -20℃放置30 min 沉淀，于4℃ 10 000 g 离心10 min。

10.  重悬RNA沉淀于75%乙醇，旋起沉淀，室温放置10~15 min，10 000 g 离心5 min。

11.  真空干燥RNA 5~10 min，溶解沉淀于100~200 μl DECP此处理过的水或DEPC处理过的0.5%SDS，-70℃冰冻保存或保存在-20℃的乙醇中。

CsCl法
实验材料
RNA
试剂、试剂盒
PBS异硫氰酸胍CsClDEPC无水乙醇
仪器、耗材
注射器电泳仪离心机培养箱
实验步骤
一、 用于单层培养细胞

1.  室温下用PBS冼涤细胞，每平皿用5 ml，洗2次。

2.  在不超过108细胞中加入异硫氰酸胍溶液，并使之遍布整个平皿。

3.  用橡皮细胞刮子擦刮平皿，回收粘稠的细胞裂解液。

4.  用装有20-G针头的皮下注射器往返抽吸裂解物，并合并在一起。

二、用于悬浮培养细胞

1.  用JS-4，2转子离心回收≤108细胞，重悬于相当于1/2原有体积的PBS，并再次离心回收细胞。

2.  往离心管中加入3.5 ml 异硫氰酸胍溶液。

3.  用装有20-G针头的6注射器将粘稠的细胞裂解液注返抽吸4次，并将其移至一个干净的试管中。

4.  在经硅化并高压过的13 mm×51 mm 的异质同晶聚合物超离心管中，加入1. 5 ml 5.7mol/l CsCl。

5.  并在此垫层上加入3.5 ml 细胞裂解液，界面应清晰。

6.  于18℃用Beckman SW-55转子150 000 g 离心12~20 h（缓慢加速和减速）。

7.  用巴斯德吸管的管尖在液面上吸取上清，管子随液面的下降而下降。

8.  当吸至仅剩约100 μl 时，小心倒置管子，倒出剩余液体。

9.  晾干沉淀约5~10 min，然后以360 μl TES溶液重溶沉淀，重复地以吸管上下抽吸。

10.  如此在室温进行5~10 min，转移溶液于另一干净的微量离心管。 

11.  加入40 μl 3mol/l pH5.2的乙酸钠缓冲液和1 ml 无水乙醇。

12.  在干冰/乙醇中沉淀30分钟，离心10~15 min，用360 μl 水重溶沉淀并重复沉淀过程。

13.  让沉淀晾干10 min，溶解于200 μl 水，取10 μl 稀释至1 ml 测A260和A280。

14.  以水溶液或乙醇沉淀的形式在-70℃贮存RNA。
收起 
注意事项
1.  1~5步的操作均在室温进行。