RNA提取注意事项.doc

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RNA提取心得/经验/体会/纪律( RNA提取注意事项) !
纪律一: 杜绝外源酶的污染。
  注意一: 操作环境干净无灰尘, 严格戴好口罩, 手套。
  注意二: 实验所涉及的离心管, Tip 头, 移液器杆, 电泳槽, 实验台面等要彻底处理。
  注意三: 实验所涉及的试剂/溶液, 特别是水, 必须确保 RNase-Free。
纪律二: 阻止内源酶的活性
  注意四: 选择合适的匀浆方法。
  注意五: 选择合适的裂解液。
  注意六: 控制好样品的起始量。
纪律三: 明确自己的抽提目的
  注意七: 任何裂解液系统在接近样品最大起始量时, 抽提成功率急剧下降。
  注意八: RNA 抽提成功的唯一经济的标准是后续实验的一次成功, 而不是得率。
Rnase 污染的10大来源
1: 手指头 – 手指头是外源酶的第一来源, 因此必须戴手套而且频繁更换。另外, 口罩也必须戴, 因为呼吸也是一个重要的酶来源。戴手套口罩的另外的好处是保护实验人员。
2: 枪头, 离心管, 移液器 – 单纯的灭菌是不能灭活 Rnase 的, 因此枪头和离心管要用 DEPC 处理, 即使是标明为 DEPC 处理过的。移液器最好是专用的, 用前用 75% 的酒精棉球搽拭干净, 特别是杆子; 另外, 一定不要使用褪头器。
3: 水/缓冲液 – 一定要确保无 Rnase 污染。
4: 实验台面 – 最起码要用 75% 的酒精棉球搽拭干净。
5: 内源 Rnase – 所有组织均含内源酶, 故组织用液氮速冻是降低降解的最好办法。液氮保存/碾磨方法的确不方便, 但对有一些内源酶含量很高的组织, 却是唯一的办法。
6: RNA 样品 – RNA 抽提产物可能都会含痕量的 Rnase 污染。
7: 质粒抽提 – 质粒抽提往往用到 Rnase 降解 RNA, 残留的 Rnase 要用 Proteinase K 消化, PCI 抽提。
8: RNA 保存 – 即使低温保存, 痕量的 Rnase 亦会导致 RNA 降解。长期保存 RNA 的最好办法是盐/醇悬液, 因为醇在低温时抑制所有的酶活性。
9: 阳离子 (Ca, Mg) – 在含这些离子时, 80C 加热 5 分钟会导致 RNA 被剪切, 故如果 RNA 需要被加热, 保存液需要含螯合剂 (1mM Sodium Citrate, pH 6.4)。
10: 后续实验所用的酶 – 酶均有可能被 Rnase 污染。
RNase 和 DEPC 处理
1: 高压灭菌是能够灭活部分 Rnase A 的。实验证明: 37 C 与 RNA 反应, 没有灭菌的 PBS, 活性点为 100 pg/ml; 灭菌后, 活性点为 100 ng/ml。当然, 灭菌后 Rnase 依然不能认为没有残留。
2: DEPC 在水中半衰期为 30 分钟。0.1% 的 DEPC 灭菌 15 分钟能够认为彻底破坏了 DEPC。破坏后能够闻到一点气味。
3: 在1M Tris, 1M HEPES, 1M MOPS 中分别加入 1ug/ml Rnase A 和 0.1% 及 1% DEPC 实验。结果提示, 0.1% DEPC 只对 MOPS 有效, 而 1% DEPC 对三种试剂都有效。
4: 0.01% DEPC, 0.1% DEPC, 1% DEPC 有效去除 Rnase A　的浓度分别为: 100 ng/ml, 500ng/ml, 1 ug/ml。但要注意, DEPC 灭活后的副产品, 对有些后续实验是有影响的。我也来谈谈RNA的提取, 我觉得14楼说的方法很严格, 可是有时候我们其实不必在过多的细节上太紧张。而在有些步骤一定要小心了。以下的内容, 是讲给那些既想偷懒, 有希望实验结果有保证的人听的, 如果你是习惯于每一步都很严格的人的话, 建议还是按照14楼的方法做, 因为那样才是正途啊。
  好了, 下面是给想偷懒, 但又不想搞砸实验的战友看的。用最少的时间, Money, 力气, 来做出最好的结果, 是我们的终极目标( PS: 我相信一句话, 懒人推动科技进步! 个人愚见, 大家不要拍我啊) 。我是做植物的, 因此以植物RNA提取为例子:
一、 关于器皿的处理:
  枪头ep管最好是用DEPC处理一下, 当然如果老板钱多的话, 尽管用进口的RNase-Free的吧。这里, 如果你想要偷点懒, 也是有办法的, 就是少处理一些ep管, 因为后面我们会讲到, 不是所有的ep管都一定要处理的。
  研钵, 这个东西按要求是要高温干燥处理的, 可是在实际实验中, 如果你不处理的话, 也不会有太大的影响。因为在一般我们要处理的材料上都会带有很多的RNA酶, 设想一下, 一个研磨碎了的细胞会释放多少RNA酶出来。因此, 在研钵上残留的那些RNase, 不是导致你RAN降解的原因。我的做法是, 洗干净的研钵, 和枪头等一起湿热灭菌即可。如果你真的很急的话, 连湿热灭菌也免了。
  关于手套、 口罩和实验台。手套是一个很重要的东西, 这个千万不能省, 而且实验过程当中要勤换手套。因为, 一般我们在做实验是时候, 还要取用很多其它试剂、 仪器。因此手套往往是最有可能污染你样品的东西。因此千万记得要换得勤快点。还有, 顺便说一下, 最好是戴两层PE手套, 因为实验过程中, 往往手上会出汗, 戴一层手套的话, 往往脱下来, 就很难戴上去了。戴上两层, 外层的手套能够方便更换, 免得戴不上, 还把PE手套夹到ep管里面, 这样可是很危险的! 至于口罩, 我认为, 不戴也没关系, 但不戴口罩的话, 建议你少说些话了, 特别是不要对这样品。讲话是时候, 带出去的口水, 足够降解你的样品了。工作台的话, 我想, 能在一个超净台上是最好, 普通的bench也能够, 可是要保证周围没人干扰, 否则, 有人冲你打个招呼, 那喷过来的口水就够让你的RNA嗝屁了( 像口水兵? ) 。
二、 关于实验过程和试剂
  一般, 提取植物RNA的方法如下
  试剂: Trizol, 氯仿, 75％乙醇, 异丙醇, DEPC水;
  操作:
    1) 、 每100mg组织加1ml TRIZOL试剂, 用液氮匀浆后, 室温放置到变成液态;
    2) 、 将液体吸到1.5 ml EP管中( 能够用没有经DEPC处理的ep管) , 加新开的氯仿0.2ml, 振荡15秒。
    3) 、 室温静置2-3分钟后, 1 rpm, 15 min, 4℃, 离心。
    4) 、 取0.5ml上清到ep管( DEPC处理) 加等体积的氯仿重新抽提; 4℃, 1 g, 15min;
    5) 、 取上清无色水相( 约0.6 ml) 到 EP管( DEPC处理过) , 加0.5 ml新开的异丙醇, 室温下静置10分钟;
    6) 、 1 rpm, 15分钟, 4℃, 离心。观察总RNA在管底的白色沉淀, 弃去上清( 小心别倒了沉淀) , 75%乙醇1.0 ml洗涤( 用DEPC水新配制) 后, 7500 rpm, 5 min, 4℃离心。
    7) 、 重复洗涤( 可选) ;
    8) 、 去上清, 用10 ul Tip吸干液体。气干沉淀5-10分钟;
    9) 、 加DEPC水20-30 ul, 枪打匀, 溶解总RNA, 测OD值。
    10) 、 电泳, 检测RNA质量。
  讲一下注意事项和能够偷懒的地方。Trizol现在我发现好多实验室都是自己做的, 因此也不要吝啬, 多加一点吧, 这个东西能够有效的抑制RNase的活力, 情愿偏多, 不要偏少。
第1) 步, 在磨样的时候, 注意, 千万要保持低温, 特别是开始还没加Trizol的时候, 千万不要让样品的温度升高了, 否则就能够和你的RNA说拜拜了。在加了Trizol后, 情况会好些, 如果研磨充分, 那就暂时安全了。
  第2) 步的时候, 这里直接加了氯仿, 不少protocol上都还要多一步, 先离心去渣, 取上清后再加氯仿, 这两步完全能够合并, 而且感觉合并的话, 似乎RNA得率还高些! 而且省下一批ep管, 还省下一步的时间。
  3) 、 4) 和5) 就按照protocol做, 能够放松点, 注意用处理过的ep管就好了, 一般不会有降解的危险。
  第6) 和7) 两步的洗涤会明显的减少RNA的盐含量, 对提高RNA质量有很大的帮助, 当然也会同时损失掉一部分的RNA, 因此洗几次, 就看你的要求了。
  后面几步, 大家就要小心了, 现在剩下的可都是精贵的RNA了, 做了几个小时, 可别前功尽弃啊。最后一步, 推荐使用进口ep管, 进口管不容易把液体挂在管壁上, 这样, 将来取用的时候, 损失会小不少。
三、 其它
  在批量提取的时候, 建议用个大点的ep管架子, 否则ep管挤在一起, 手戴着手套, 一不小心, 就容易打翻样品( 哭吧, 如果就一份样) !
枪头的话都是高温成型的, 如果你使用是枪头是没开封过的, 一般不用DEPC处理也没问题。主要是怕二次污染, 有些工厂是用人工包装了, 不是机器打包的, 那建议处理一下。
  友情提示, DEPC是疑似致癌物质, 使用是时候千万小心! 我始终认为, 安全是第一位的, 如果条件允许的话, 尽量使用进口ep管和枪头, 这样就不用接触DEPC了。

(TRIZOL提取注意事项
TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。加入氯仿后离心, 样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后, RNA能够经过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后, 样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA, 在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用。
论是人、 动物、 植物还是细菌组织, 该方法对少量的组织(50-100 mg)和细胞(5×106)以及大量的组织(≥1 g)和细胞(>107)均有较好的分离效果。TRIZOL试剂操作上的简单性允许同时处理多个的样品。所有的操作能够在一小时内完成。TRIZOL抽提的总RNA能够避免DNA和蛋白的污染。故而能够作RNA 印迹分析、 斑点杂交、 poly(A)+ 选择、 体外翻译、 RNA酶保护分析和分子克隆。如果是用于PCR, 当两条引物位于单一外显子内时, 建议用级联扩大的DNase I(Cat. No. 18068)来处理抽提的总RNA。
RIZOL试剂能促进不同种属不同分子量大小的多种RNA的析出。例如, 从大鼠肝脏抽提的RNA琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙啶染色, 可见许多介于7 kb和15 kb之间不连续的高分子量条带, ( mRNA和hnRNA成分) 两条优势核糖体RNA条带位于~5 kb (28S)和~2 kb (18S), 低分子量RNA介于0.1 和 0.3 kb之间 (tRNA, 5S)。当抽提的RNA用TE稀释时其A260/A280比值≥1.8
预防RNA酶污染:
提RNA过程中任一环节的不正确操作都可能导致RNA酶的污染。由于RNA酶的活性很难完全抑制, 预防其污染是十分必要的。
在实际的操作中应遵循以下指南:
* 全程佩戴一次性手套。皮肤经常带有细菌和霉菌, 可能污染RNA的抽提并成为RNA酶的来源。培养良好的微生物实验操作习惯预防微生物污染。
* 使用灭菌的, 一次性的塑料器皿和自动吸管抽提RNA, 避免使用公共仪器所导致的RNA酶交叉污染。例如, 使用RNA探针的实验室可能用RNA酶A 或 T1来降低滤纸上的背景, 因而某些非一次性的物品( 如自动吸管) 可能富含RNA酶。
* 在TRIZOL中, RNA是隔离在RNA酶污染之外的。而对样品的后续操作会要求用无RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿能够在150°C的烘箱中烘烤4小时。塑料器皿能够在0.5 M NaOH中浸泡10分钟, 用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。其它注意事项
* 当TRIZOL用量少于2-ml时建议使用清洁的一次性的聚丙材质试管。
* 当TRIZOL用量较大时, 能够使用玻璃试管(Corex)或聚丙材质试管, 事先检验以确保该试管能够耐受加入TRIZOL和氯仿后12,000×g的离心力。不可使用有裂缝或者破损的试管。
* 离心前小心平衡试管。
* 离心前玻璃管口必须盖上铝箔并用石蜡膜封口, 聚丙烯管必须盖紧。
RNA抽提指南
注意: 用TRIZOL抽提RNA时要戴手套和护眼罩。避免接触皮肤和衣服。在化学通风橱完成操作。避免呼吸道吸入。
如无例外, 所有的操作应该在15 -25°C的条件下完成, 试剂亦在15 -25°C的条件下。

RNA提取注意事项

一些RNA提取方法, 在进行具体实验时, 应根据研究对象的性质, 提取核酸的用途而对上述方法在操作步骤和试剂使用量上作一定的修改。
1、 在核酸提取时, 为了增加细胞的裂解度, 增加核蛋白复合体破碎度, 以释放更多的游离核酸, 在操作中常要用到溶菌酶和蛋白酶K, 在确保没有核酸水解酶存在的前提下, 酶反应时间越长越好。
2、 有时在使用蛋白酶时, 为了抑制核酸水解酶的降解作用, 可在蛋白酶缓冲液中用终浓度5mM的EDTA代替NaCL, 而且可将反应温度提高到50－60℃, 并将反应时间缩短到15－25min, 但酶用量必须提高10－20倍。溶菌酶使用时缓冲液中需加EDTA, 因游离金属离子对酶有抑制。
3、 许多植物材料中富含酚, 在细胞破碎时, 在多酚氧化酶作用下, 被氧化成有色的锟类物资, 影响核酸的提取及降低提取质量, 在提取液中加入PVP和巯基乙醇对降低酚类的干挠可能有所帮助。PVP将与酚形成复杂的聚合体, 在提取时将酚从核酸成分中游离。且PVP与巯基乙醇作为强还原剂可防止多酚的褐变。另外作为还原剂的这些成分在一定程度上可抑制核酸水解酶的作用。
4、 许多生物材料在提取核酸时, 都会遇到多糖的污染问题, 具体表现为有机溶剂沉淀时, 沉淀很多, 但复溶时, 大量沉淀不溶, 电泳观察时核酸含量很低。
      克服多糖污染可采用以下一些办法
1) CTAB多次抽提。
2) 在有机溶剂沉淀时先稀释样品浓度( 可到10倍左右) , 对低浓度样品再进行沉淀。
3) 在有机溶剂沉淀时选用异丙醇和5MNaCL作为沉淀溶剂, 此时氯化钠的用量可用到1/5-1/2的体积, 异丙醇可用到0.6-1的体积。异丙醇沉淀核酸时, 高浓度盐存在将使大量多糖存在在溶液中, 从而可达到去多糖的作用。但高浓度的盐存在会影响核酸的进一步操作, 因此必须用乙醇多次洗涤脱盐。
5、 在核酸提取时, 酚与氯仿均起到变性的作用。酚的变性能力强于氯仿, 但酚与水有一定的互溶, 因此酚抽后, 除可能损失部分核酸外, 水相中还会残留酚, 而酚的存在将对核酸的酶反应产生强的抑制, 因此在操作中可单用氯仿作变性剂、 也可用酚/氯仿混合变性, 也可用单一酚作变性己, 但用单一酚后在有机溶剂沉淀时一定要用氯仿从抽提。
6、 在操作中当加入变性剂氯仿后, 为了保证核酸样品的完整性, 操作要轻, 特别在提DNA时, 更要避免剧烈操作。
7、 在沉淀核酸时可用乙醇与异丙醇, 乙醇的极性要强于异丙醇, 因此一般用2V乙醇沉淀, 但在多糖、 蛋白含量高时, 用异丙醇沉淀可部分克服这种污染, 特别用异丙醇在室温下沉淀对摆脱多糖、 杂蛋白污染更为有效。
8、 在提取核酸时, 如样品浓度低, 则应增加有机溶剂沉淀时间, －70℃下>30min;－20℃过夜将有助于增加核酸的沉淀量。
9、 在核酸提取过程中有机溶剂沉淀后复溶时可加水因此时离子浓度可能较高, 而到高度纯化后低温保存时最好复溶于TE缓冲液中, 因溶于TE的核酸储藏稳定性要高于水溶液中的核酸。另外核酸样品保存时要求以高浓度保存, 低浓度的核酸样品要比高浓度的更易降解。
10、 核酸提取后可经过PCR 、 RT－PCR直接扩增出目的基因片断, 也可首先构建文库、 然后由RACE、 dd-PCR等差异显示技术、 AFLP等标记技术、 差异杂交或文库扣除技术等方法筛选出特异探针, 再用此探针从文库中筛选出完整基因。
11、 在抽提过程中, 若蛋白质含量或其它的杂质还较多, 能够增加抽提次数.提取RNA请尽量在低温下操作, 如果条件不容许, 在室温下操作的时间要尽可能的短。