基因表达量实时荧光定量PCR检测步骤.docx

基因表达量实时荧光定量PCR检测步骤
1 材料（试剂和耗材）
1.1 样本（小鼠组织）-2个
1.2 引物（life technology公司合成）
1.3 BestarTMqPCR RT Kit（德国DBI货号：DBI-2220）
1.4 Bestar® SybrGreenqPCRmastermix（德国DBI货号：DBI-2043）
1.5 96孔板（美国life technology）
2 材料（仪器）
2.1 ABI7500荧光定量PCR仪（life technology公司）
2.2 TGL-16M低温冷冻离心机（湘仪）
2.3 SW-CJ-1D单人净化工作台（泸净净化）
2.4 HR40-Ⅱ A2生物安全柜（Haier）
3 实验步骤
3.1 RNA的抽提
RNA 的提取按life technology公司提供的Triozol RNA提取试剂盒的使用说明进行。程序如下：
（1）将组织在液氮中磨碎，每50-100mg组织加入1ml TRIzol；
（2）加入0.2mL氯仿，盖紧离心管管盖，上下颠倒混匀60s（请勿涡漩激烈振荡），室温静置3min，12,000g，4℃离心 15min，置于冰上；
（3）溶液分为三层，RNA溶解在水相中，小心吸取 500μl水相至另一个新的RNase free的EP管中；
（4）加入500μl异丙醇，-20度放置1h，12,000g，4℃离心10min，离心后管底出现RNA沉淀，弃上清；
（5）加入1ml 75％乙醇，用手轻轻颠倒，12,000g离心5min，去上清；
（6）超净工作台上吹干样品10min，加入适量DEPC水溶解RNA。加入40μl DEPC水溶解沉淀。
3.2 RNA质量检测
紫外分光光度计测定RNA浓度：
sample ID
concentration(ng/μL)
260/280
a
998
1.87
b
1024
1.97
3.3去基因组DNA和cDNA的合成
将RNA加入到gDNA吸附柱，室温10,000g离心1min，收集滤液即为去除基因组DNA的RNA。
把RNA在65°C条件下热变性5分钟后，立即置于冰上冷却。
逆转录反应：
5×RT Buffer
2μL
RT Enzyme Mix
0.5μL
Primer Mix
0.5μL
RNA
6μL
RNase-free Water
1μL
Toal
10μL
反应条件：
37°C, 15min
98°C, 5min
4°C,hold
反应结束后，-20°C保存。
3.4cDNA的实时荧光定量PCR
3.4.1实验步骤
每个样本分别设置3个目的基因和3个内参基因的平行实验。PCR反应体系为20μL，根据表1.配置。反应条件为：
95°C2min
95°C10s
45个循环
60°C34s（采集荧光信号）
72°C 30s
循环结束后从60℃升高到98℃获取熔解曲线。
表1 20μl荧光定量PCR反应体系
试剂
体积（μL）
终浓度
灭菌蒸馏水
4.46
/　
Bestar® SybrGreenqPCRmastermix
10
1×
Forward Primer(20μM)
0.25
0.25μM
Reverse Primer(20μM)
0.25
0.25μM
50×ROX
0.04
0.1×
模板
5
/　
Total
20
/　

表2 使用的引物
基因名称
Genebank ID
引物序列
扩增长度（bp）
Mus-GAPDH
NM_001289726.1
Forward：
TCCACTCACGGCAAATTCAAC
146
Reverse：
GTAGACTCCACGACATACTCAGC
x
NM_*****
Forward：

Reverse：

y
NM_*****
Forward：

Reverse：

3.4.2实验结果的分析方法
本实验采用2-△△Ct法进行分析，计算公式为：

F为相对表达量，根据此次试验的设计，对照组中的目的基因表达量为1。
4结果
4.1 扩增曲线

GAPDH基因扩增曲线
x基因扩增曲线

y基因扩增曲线

4.2 熔解曲线

GAPDH基因熔解曲线

x基因熔解曲线

y 基因熔解曲线-2
4.3实验数据
见EXCEL表格。
备注：DCt=目的基因Ct - 管家基因Ct ；
DDCt=待测样品DCt - 对照样品DCt；
2-DDCt=相对表达量。
4.4 柱形图

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