资源描述
第一章 概论
工业微生物育种在发酵工业中的地位
1、 决定产品种类及工业价值；2、决定发酵过程成败
一、 工业微生物菌种来源
1、 土壤；2、产品别离；3、动植物种；4、科研机构购置，发酵生产的工厂中
二、 工业生产的微生物菌种应具备的特性
1、 稳定性、遗传性，2、遗传代，易产生营养细胞，孢子或其他繁殖体，3、纯种，不带杂菌及噬菌体，4、种子生长快，节省种子罐的时间，5、产生产物时间短，6、易别离产物，对下游工程有利，7、抗污染能力强，节约本钱，无菌，消毒，8、经济性能良好，市场竞争能力，产品稳定，时间长，9、对诱变剂敏感，易筛选出高产菌，10、相应的时间内，必须产出相应数量的产物，生产稳定。
三、 菌种及发酵的关系
1、菌种是内因，是关键，起决定性作用，是由遗传性决定的。
2、发酵条件是外因，菌种受外界条件的控制。
3、选择适当的外界条件，就能充分发挥菌种固有的生产潜力。
1.2 菌种选育的遗传学根底
遗传及变异是相互联系相互渗透的，生物的不断进化是遗传及变异的结果。
1、 遗传：指单细胞生物能产生遗传学上及亲本一样的子代，生物的上一代将自己的一整套遗传因子传递给下一代的行为。
2、 变异：指微生物中发生频率很低的可遗传的变异，指生物体在某种外因的作用下所发生的遗传物质构造或数量的改变。
3、 饰变：指不涉及遗传物质构造的改变而止发生在转录，转译水平上的表型变化。其特点是整个群体中几乎每一个个体都发生同样的变化。
4、 遗传型：又称基因型，指某一生物个体所含有的全部遗传因子即基因的总与，是一种内在的可能性潜力。
5、 表型：指某一生物所有的一切外表特征及内在特性的总与。是遗传型在适宜环境下的具体表现。及遗传型不同，它是一种现实性。
二、 微生物遗传变异的特点
1、 繁殖快，2、外界环境作用的直接性，3、容易培养，4、代谢能力强，5、种类多，分布广。
解决育种原始菌种来源问题。由于微生物具有以上特点，给育种工作带来很大方便。
三、 菌种选育的任务
1、 促使菌种变异，使变异后的菌种有一定的稳定性。2、别离纯化，选择遗传学上稳定的菌种，3、找到一种最稳定的保存条件，防止菌种退化。
四、 菌种选育的手段〔方法〕
1、 诱变育种【1、人工诱变；2、自发突变〔生产育种〕】
2、 杂交育种：〔基因重组〕杂交包含重组，重组那么不限于杂交一种形式
原核生物的基因重组：1、转导【1、普遍转导；2、局限转导；3、溶源转变】； 2、转化； 3、接合； 4、原生质体融合
真核微生物的基因重组：1、准性杂交；2、有性杂交；3、原生质体杂交。
3、 基因工程
五、 菌种选育的意义
1、 提高产量；2、改善产品的质量〔风味，有效成分比例〕；3、扩大品种种类；4、改善菌种生产性能【1、降低本钱，2、净化发酵体系】
六、 菌种选育及步骤
1、 制定合理的方案；2、设计好筛选方法；3、生产观念；4、现实性，要求所选的菌种要有一定的重复性。
第二章 基因突变
变异是微生物育种的根底
一、 遗传及变异 突变：指生物遗传性突然发生变异
二、 基因突变的类型
1、 根据碱基变化与遗传信息的改变，可分为四种：【1、同义突变，2、错义突变，3、无义突变，4、移码突变】
2、 根据表型变化可分为：
（1） 、选择性突变菌株：但凡能用选择性培养基快速选择出来的突变型。 【1、营养缺陷型，2、抗性突变型，3、条件致死型】
（2） 、非选择性突变株：不能用选择性培养基快速选择出来。 【1、形态突变株，2、抗原突变株，3、产量突变型】
三、 基因突变型的特点
1、 不对应性：指突变的形状及引起突变原因之间无直接对应关系。
2、 自发性：各种突变可在没人为诱变因素下自发产生，
3、 稀有性：突变几率低10*-6--10*-9
4、 独立性：在某一群体中，发生这种突变与另一种突变几率几乎一样。基因突变是独立的，随机的。
5、 透变性：诱变剂的作用，诱变突变率提高10----100000倍。
6、 稳定性：突变由于遗传物质构造上发生稳定的变化，新的性状是可遗传的稳定的。
7、 可逆性：由野生型基因变异为突变型基因，为正向突变，反之为回复突变。可发生正向突变，也可发生回复突变。
第二节 突变的分子构造
一、 自发突变：微生物未经人为诱变剂处理或杂交等生物工程手段而自然发生的突变。
二、 诱发突变：人为用化学，物理诱变剂去处理微生物而引起的突变。
自发突变与诱发突变的不同点
自发突变与诱发突变在小营上没有差异，突变基因的表型与遗传规律根本一样，只是突变速度，时间，频率的不同。
自发突变是微生物未经人为诱变剂处理或杂交等工程手段而自然发生的突变。自发突变引起的原因：1、微生物生活的环境中存在着一些低剂量的物理、化学诱变因素；2、微生物自身代谢过程中产生一些具有右边作用的物质〔H2O2〕，可以引起自发突变得到优良菌株。
诱发突变是人为用化学、物理诱变剂〔紫外线、亚硝酸等〕去处理微生物而引起的突变。
诱发突变及自发突变在效应上几乎没有差异，突变基因的表现型与遗传规律在本质上是一样的。只是人工诱发突变的时间短、速度快、突变频率高，一般为 ，而自发诱变速度慢、时间长、突变频率低，一般为 ，真菌为 。
三、 基因突变机制
（一） 、染色体数目的变化
1、 倍数发生变化：单倍体、二倍体、三倍体
2、 非整倍体：超二倍体〔2n+1〕、亚二倍体〔2n-1〕
3、 局部三倍体：原核微生物只有一条染色体，突变获得一段DNA。
（二） 、染色体构造的变化
〔染色体畸变〕：染色体受损伤断裂后，错误性愈合而造成的
1、缺失，2、重复，3、倒位，4、易位〔异位〕
（三） 、染色体局部座位内的变化〔称基因突变〕
1、 碱基置换：DNA双链中某一对碱基对变成另一对碱基对
（1） 、转换：DNA链中某一嘌呤〔嘧啶〕跟另一个嘌呤〔嘧啶〕置换。
（2） 、颠换：DNA链中某一嘌呤〔嘧啶〕被另一个嘌呤〔嘧啶〕所置换。
2、移码突位：指诱变剂使DNA分子中的一个或少数几个核苷酸的增添〔插入〕或缺失，从而使该部位后面全部遗传密码发生转录与翻译错误的一类突变。〔DNA分子的微小损伤，易发生回复突变，又称点突变。〕
第三章 微生物育种诱变剂
诱变剂：但凡能诱发生物基因突变，并且突变率远远超过自发突变率的物理因子或化学因子。
诱变剂类型：1、物理诱变剂 2、化学诱变剂 3、生物诱变剂
第一节 物理诱变剂
1、 物理诱变剂的生物学效应：物理诱变剂对微生物的诱变作用主要是由高能辐射导致生物系统损伤，继而发生遗传变异的一系列复杂的连锁反响过程。
一、紫外线的效果：效果非常好，对人体影响小，较平安，经济实惠、设备简单、操作方便、诱变效果显著。当不知道别的方法时，首先用紫外。可使DNA断裂、H键断裂，15W1/3管长，剂量及距离成反比。
1、DNA对254nm紫外有强烈的吸收作用；
2、紫外诱变剂量：15W灯管，254nm
〔1〕、用时间表示：一般相对剂量、固定强度，用时间表示。强度及距离、辐射源本身有关。
〔2〕、用死亡率表示：〔〕
有一定的菌死亡，称致死作用；在可见光作用下，其诱变与致死作用均下降称为光复活作用。
3、 光复活作用：把经紫外线照射后的微生物立即暴露于可见光下时，降低其死亡率。所以诱变后在红光或暗中培养。
原理：紫外作用后原有胸腺嘧啶二聚体的DNA黑暗下及光裂合酶结合。在可见光的作用下，该酶及二聚体重新分解成单位。光激活酶能重新执行功能修复DNA。
4、 光复活效应在高剂量的紫外线作用后，表现为致死突变回复。低剂量那么表现在致死菌与突变菌的回复上。重复使用光复活与高剂量，最终能使突变株增多。
〔加示意图〕
二、 快中子 中子是原子核的组成局部，是不带电荷的粒子。
第二节 化学诱变剂
化学诱变剂：是一类能对DNA起作用，改变其构造，并引起遗传变异的物质。包括碱基类似物、烷化剂、移码突变剂、与其他种类。剂量主要取决于其浓度与处理时间。
要求：1、选择一个效果好的〔使菌种诱变后正突变高〕；2、选择一个易得的；3、不能选太毒的，容易污染环境与伤人；4、尽量选择那种不产生回复突变的。
考前须知：化学诱变剂一般都有半衰期，应现用现配制，右边后一定要将化学诱变剂中与或稀释除去。
剂量的表示方法：常用杀菌率表示诱变剂的剂量。杀菌率=〔m-n〕/m*100%
第三节 其他诱变因素
一、 生物诱变剂 1、噬菌体；二、抗生素；三、秋水仙素；四、中草药。
五、 复合诱变剂因素的应用
复合因子处理是指两种以上诱变因子共同诱发菌体突变。
对野生型菌株单一诱变因素有事也能取得好的效果，但对于老菌种单一诱变因素重复使用突变的效果不。这时可利用复合因素来扩大诱变幅度，提高诱变效果。
1、 两种以上的因子同时处理；
2、 不同的诱变剂交替处理〔不筛选〕；
3、 同一种诱变剂连续重复使用〔如：紫外线〕，但是单因子连续使用袋鼠不能过多，否那么也会出现“钝化〞现象。
4、 紫外线光复活交替处理。
5、 诱变剂处理时间及诱变效应的关系：复合因子处理中，为提高诱变效果，在具体使用时，要注意诱变剂的协同效应，先用弱诱变因子，后用强诱变因子处理往往具有协同效应。
低浓度、长时间比高浓度、短时间正向突变率高〔同一死亡率、同剂量情况〕
第四章 工业微生物产生菌的别离与筛选
菌种别离：将一个混杂着各种微生物的样品通过别离技术区分开，并按照实际要求与菌株的特性采取迅速、准确、有效的方法对他们进展别离、筛选，进而得到所需要的微生物的过程。
菌种的筛选与别离包括两大局部：
一、从自然界别离所需要的菌株，
二、把别离到的野生型菌株进一步纯化并进展代谢产物鉴别。
菌种的别离与筛选一般分为采集、富集、别离、产物鉴别几个步骤。
菌株的来源及途径
1、 从菌种保藏机构或个人购置有关菌种，从中筛选所需菌株。
2、 从发酵制品中别离筛选目的菌种。
3、 从自然界中采集样品，如土壤、水、动植物体……，从中别离筛选。
菌种采样原那么：1、菌种用于生产的目的；2、分布特点；3、生理生化特征。
三、 对工业微生物的根本要求
1、纯种培养，2、稳定的遗传性，3、传代方便，4、生长快、易放大，5、代谢快、易产生目的产物，6、自我保护、环境适应性强，7、产量高、并易及副产物别离。
第二节 含微生物样品的富集培养
富集培养是在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，使目的微生物在最适的环境下迅速的生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种，以利别离到所需的菌株。
一、 控制培养基的营养成分
〔1〕、特定培养基：微生物对于C、N无机盐及微生物等要求有差异，异样型微生物只能利用有机C源，自养型微生物可利用CO2作为C源。〔2〕、假设选用直接利用淀粉的糖化菌种可用淀粉作为C源。
二、 控制培养条件
1、PH：细菌、放线菌偏碱〔7.0--7.5〕；,霉菌、酵母菌偏酸〔4.5--6.0〕。 2、温度
三、抑制不需要的菌类
第三节微生物的别离
一、好氧微生物的别离
〔一〕、粗放----菌落纯
1、稀释涂布法
2、划线别离法〔简便、快〕
3、组织别离法【1、对一般有病组织的别离方法；2、食用菌孢子别离法】
〔二〕、细分----菌株纯、细胞纯〔复杂〕
1、利用平皿的生化反响进展别离 【透明圈法、变色圈法、生长圈法、抑菌圈法】
2、单细胞或单孢子别离法
二、通过控制营养与培养条件进展别离 三、厌气菌的别离
利用平皿的生化反响进展别离：是一类特殊的别离培养基对大量混杂微生物进展初步别离的方法。培养基是根据目的微生物特殊的生理特性或利用某些代谢产物生化反响来设计的。
第四节 野生型菌株的筛选与目的产物的鉴别
野生型菌株：直接从自然界样品中别离出来的具有一定生产性能的菌株，它是发生突变前的原始菌株。
一、 初筛----【快速、简便、准确、不漏筛】 1、快速〔尽快预测所筛选的目的微生物〕，
2、经济〔通过1次筛选得到的具有的广泛目标的微生物〕
菌种初筛的方法：稀释涂布法、稀释平板法、划线别离法。
二、 复筛------一个菌株通常要重复3--5个瓶，培养后的发酵液采用准确分析方法测定。
摇瓶发酵筛选
三、 再复筛：取复筛后发酵单位高的。
初筛的简化：1、平皿快速检测法；2、从菌体形态变异分析。
第七章 诱变育种
五章 诱变育种
目的：1、提高有效产 量的产量，2、改善菌种特性，提高产品质量，3、简化工艺条件，4、开发新品种。
诱变育种：是研究诱变机制的根底上，选择适宜的诱变剂处理均匀而分散的细胞群，促进其突变率提高。采用简便快速高效的筛选方法，把优良突变株选育出来。
诱变育种的步骤与方法
1、 出发菌株的选择，2、出发菌株的纯化，3、单孢子或单细胞菌悬液的制备，4、诱变剂与诱变剂量的选择，5、诱变的处理方法，6、别离与纯化。
第四节诱变育种在工业上的应用
六章 营养缺陷型菌株的选育及应用
营养缺陷性菌株：只有在根本培养基中补充所缺乏的营养因子才能生长的菌株。
原养型：营养缺陷性菌株经回复突变或重组变异后缠上的菌株，其营养要求在外表型上及野生型一样。
野生型菌株：直接从自然界样品中别离出来的具有一定生产性能的菌株，它是发生突变前的原始菌株。
筛选营养缺陷型厂用的三种培养基：
根本培养基MM：仅能满足野生型菌株生产需求的培养基。
完全培养基CM：凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基。
补充培养基SM：凡只能满足相应的营养缺陷性菌株生长需要的组合培养基。
三、 营养缺陷型获得的方法
（一） 、营养缺陷型的诱发
1、诱变剂：亚硝酸、紫外线、NTG等。
2、步骤：菌悬液----诱变----淘汰野生型----营养缺陷型
经诱变后的细胞中营养缺陷型很少，大量的野生型对别离营养缺陷型很不利，因此要先淘汰野生型。
〔二〕、淘汰野生型菌株
方法：1、抗生素法，2、菌丝过滤法，3、高温杀菌法
1、 抗生素法
诱变后的菌株接在MM培养基上，野生型生长，而营养缺陷型不生长，在MM中参加抗生素到达浓缩营养营养缺陷型的目的。青霉素杀死生长的野生型细菌，制霉菌素杀死生长的酵母菌与霉菌。
为防止营养缺陷型菌株在MM中利用自身体内的营养生长而被误杀，应将介入MM的细胞先洗涤。在MM上饥饿培养1-2h，后介入抗生素，家20%蔗糖形成高渗防止被杀四的野生菌自溶给营养缺陷型提供营养。
过程：诱变后菌悬液中间培养基CM培养----洗去营养----MM上饥饿1-2h----+抗生素----+20%蔗糖----浓缩营养缺陷型----CM培养基
2、 菌丝过滤
真菌与放线菌等丝状菌的野生型孢子在根本培养基上能萌发长成菌丝，而营养缺陷型的孢子不能萌发。通过过滤除去局部野生型，到达浓缩的目的，然后在CM上培养。
3、 高温杀菌法
利用芽孢菌类的芽孢与营养体对热敏感性的差异。此时将培养物加热到80C，维持一定时间，野生型细胞大局部被杀死，缺陷型那么得以保存，起到浓缩作用。
酵母菌的孢子虽不像细菌的芽孢那样耐热，但比起他们的营养体来也比拟耐热，可以用类似的热处理方法〔580C， 4min〕，浓缩营养缺陷型。
（三） 、检出营养缺陷型
1、 点植对照法
2、 影印法
3、 夹层法〔延迟补给法〕
4、 限量补充培养法
（四） 、营养缺陷型的鉴定
1、 鉴定方法
（1） 、在一个平皿中参加一种营养物质以测定多株缺陷型菌株对该生长因子的需求情况。
（2） 、在同一个平皿上测定一种缺陷型菌株对多种生长因子的需求情况，称为生长谱法
2、 营养缺陷型鉴定步骤
〔1〕、营养缺陷型类别的测定[生长谱法……]
〔2〕、缺陷型所需生长因子的测定【1、分组测定；2、组合补充培养基法；每一种补充培养基中只缺少一种营养物，那么，所有的营养缺陷型都可用它一次性检测，这尤其适合于检测多种营养物质的多重营养缺陷型】
〔五〕、营养缺陷型突变株的用途
1、作为杂交的手段
2、作为生产核苷酸或氨基酸等生产菌株
应用：营养缺陷型可用于工业微生物育种，协助解除代谢反响调控机制，从而到达大量积累终产物的目的，也可将营养缺陷型菌株作为生产菌中杂交、重组育种时的遗传标记。
渗漏缺陷型是一种不完全遗传障碍营养缺陷型，能自己合成微量的某一代谢终产物，但达不到反响调节的浓度，所以不会造成反响抑制而影响。
利用营养缺陷型生产的发酵产品：1、单线途径的中间产物的生产，2、分支途径。
七章 抗性突变株的筛选及特殊性能变异株的筛选
第一节 抗性突变株的筛选 相比照拟容易，只要有10*-6频率的突变体存在，就容易筛选出来。有一次性筛选法与阶梯性筛选法两种手段。
一、一次性筛选法 指在对出发菌株完全致死的环境中，一次性筛选出少量抗性变异株。噬菌体抗性菌株常用此方法。
二、阶梯型筛选法 药物抗性即抗药性突变株可在培养基中参加一定量的药物或对菌体生长有抑制作用的物质。
1、梯度平板法
2、纸片扩散法
第二节 抗性噬菌体的选育
方法：
1、 自然诱变 以噬菌体为筛子，敏感菌株的孢子不经任何诱变由其自然突变为抗性菌株。
2、诱发突变 敏感菌株先经诱变因素处理，然后将处理过的孢子液别离在含有高浓度的噬菌体的平板上，经诱变后的存活孢子中，如存在抗性变异菌株就能在此平板生长。
2、抗噬菌体菌株的选育程序
专一性噬菌体的获得与纯化----高效价噬菌体原液制备----菌株诱发突变----别离在含有噬菌体的平皿里挑取抗性菌落与摇瓶培养〔加噬菌体〕----别离到含噬菌体的平皿上挑取抗性菌落----抗性菌落特征性测试
三、抗性噬菌体的特性研究
1、抗性菌体稳定性实验
2、抗性菌株的产量性能〔稳定，不比原始低太多，及原始持平左右〕
抗性表现：1、细胞构造的改变，防止噬菌体吸附侵入，2、生理代谢改变，噬菌体可以吸附侵入，但不能增殖。 〔无论从自然突变或诱发突变所得到的康噬菌体菌株，在用于生产职之前，均需经过反复验证，才能使用。〕
3、 真正抗性及溶源性的区别实验
经选育的菌----〔诱导〕加敏感菌----出现噬菌斑的是假抗，不出现的是真抗。
四、 用于生产的抗性噬菌体应具备的条件
1、 产量不低于敏感株；2、不带噬菌体〔间接筛选法可以保证原始菌种不带噬菌体〕；3、稳定好；4、不是溶源性。 〔用过滤器过滤噬菌体与细菌〕
第九章 工业微生物杂交育种
第一节 杂交育种原理
一、基因重组：将两个不同形状个体内的基因转移到一起，经过重新组合，形成新的遗传型个体的过程称为基因重组。
二、杂交育种微生物传递的途径
1. 通过双亲细胞的融合,涉及到整套染色体的基因重组，如真核微生物的有性生殖、准性生殖。〔酵母菌杂交、霉菌的杂交〕
2.通过双亲细胞的沟通，涉及到局部染色体的基因重组，如原核微生物的接合，〔F因子传导〕
3.双亲细胞不接触，仅个别少数基因的重组，如原核微生物的转导、转化。〔噬菌体感染〕
三、杂交育种
一个菌种长时间使用诱变剂处理后，其生活能力逐渐下降，如生长周期延长、孢子减少、代谢减慢、产量增加缓慢等。故杂交育种就成为菌种选育的另一重要手段，杂交是细胞水平的概念，而基因重组是分子水平的概念。
供体、受体亲本。杂交育种更具在方向性，但方法复杂、进度慢，筛选工作大，应用不广。
四、杂交育种的目的
1. 改变亲株的遗传物质根底，扩大变异范围，使两亲株的优良性状集中于重组体内，获得新品种；
2. 克制因长期诱变造成的生活力下降、代谢缓慢等缺陷，也可以提高对诱变剂的敏感性，降低对诱变剂的“疲劳〞效应。
3.使不同菌株的遗传物质进展交换与重新组合，从而改变原有菌株的遗传物质根底，获得杂交株。
4.分析杂交结果，可以总结遗传物质的住那一与传递规律，丰富并促进遗传学理论的开展。
五、微生物杂交育种根本程序
选择原始亲本→ 诱变筛选直接亲本→直接亲本之间亲与力鉴定→杂交→别离到根本培养基或选择性培养基培养→筛选重组体→重组体分析鉴定。
六、 杂交育种使用的材料
1、出发菌株 2、培养基 3、器皿 4、直接亲本〔标记菌〕
第二节 原核微生物的杂交育种
一、细菌杂交育种〔重点〕
〔一〕接合是指两个性别不同的微生物细胞之间接触，遗传物质转移、交换、重组，形成一个新个体。〔指通过供体菌与受体菌的完整细胞的直接接触，传递大片的DNA〔包括质粒〕遗传信息的的现象。
〔二〕致育因子
细菌的杂交关键是性因子，即F因子。F因子是一种质粒，它存在于细菌的细胞质中，一般为游离状态，有时与染色体以结合态存在，是一种稳定的遗传物质。
1. F+菌株：具备F性因子的细胞称为有性因子菌株〔F+〕，即“雄性〞菌株，为供体菌。其F因子独立存在，细胞外表有性菌毛。又称为低频重组菌种。
2. F-菌株：不具备F性因子的细胞称为无性因子菌株〔F-〕，即“雌性〞菌株，为受体菌。无有性菌毛，可通过接合作用接收F因子变成F+。
3. Hfr菌株：有时供体菌的F因子可以整合到细胞染色体DNA上，这样使F+菌株成为高度致育细胞，称为Hfr菌株，这类菌株的特点是不仅细胞内很有F因子，而且F因子的DNA嵌入染色体的DNA中。转移染色体基因的能力很高，重组频率大，又称高频重组菌株。其细菌外表有性菌毛。
4. F’菌株：Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体，形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子称为F’因子。含有这种性因子的菌株就称为F’菌株，又称低频重组菌株。
F因子转导：当F’细胞及F-细胞接合时，把所携带的供体菌局部染色体基因也同时转移到F-细胞中去，使受体菌株遗传性状发生改变而获得重组体，这个过程称为F因子转导。
〔三〕杂交过程 详见书P259
1. F-*F+杂交---重组频率低
〔1〕F+细菌通过性毛及F-细菌接触并发生相互作用；
〔2〕F+细菌的F因子出现缺口，双链之一被切断，从断端转移F因子的一条链到F-细菌中；
〔3〕F因子的一条链进入F-细菌中，在F-细菌中复制新的F因子；
〔4〕复制完成后，F-细菌变成了F+细菌，同时原有F+细菌也完成了F因子的复制。
2. Hfr*F-杂交---杂交最好组合
杂交过程：当Hfr菌株及F-菌株接触，细胞壁沟通，Hfr细胞染色体单链翻开，远离F因子一端的染色体DNA先进入F-细胞内，F因子到最后才转入或不转入到F-菌株中，待进入F-菌株细胞的一段供体染色体与受体染色体结合形成局部合子，经过双交换或两次单交换，Hfr菌株的一段染色体整合到F-菌株细胞的环状染色体中，形成具有一定新遗传性状的重组体菌株。
中断杂交实验——如果在两个配对菌株拉倒过程中，每隔一定时间以强烈搅拌中断接合，结果导致Hfr菌株转移到F-菌株中染色体节段的断裂位置不一，由此造成进入受体细胞具在Hfr性状的基因数量与种类不同，从而可获得多样化类型的重组体，称为中断杂交实验。
〔四〕细菌杂交方法及技术P262
1. 杂交亲本菌株，根据实验选择不同遗传特性的两亲本菌株，并且要还一定选择性标记与非选择性标记。
2.标记菌株，最常用的标记为营养缺陷。
3.性别菌株的获得：F+菌株，F+菌株及F-菌株接合并把F因子转移到F-菌株中，从而使F-菌株转变为F+菌株；F-菌株，把F+菌株用缺乏以抑制其生长的低浓度吖啶橙处理即可得F-菌株；Hfr菌株，通过F+菌株与F-菌株杂交获得。
4.杂交方法，细菌杂交一般采用直接混合法〔详见P262〕：将两个直接亲本菌株分别培养至对数期，再将Hrf菌株与F-菌株细胞以1：10或1：20的比例混合，水浴振荡，菌株细胞接合，亲本菌株间的染色体进展连接、交换与重组，然后稀释涂布在根本培养基上或其他选择性培养基上筛选得到各种重级菌株或其他杂交后代。
二、放线菌的杂交育种〔重点〕
〔一〕放线菌杂交原理：通过供体向受体转移局部染色体，经过遗传物质交换，最终到达基因重组。杂交原理相似于细菌，杂交方法相似于霉菌。放线菌的杂交只发生在具有一定感受态菌株之间。P265
〔加示意图〕
1、异核现象：有些放线菌的营养缺陷型在混合培养或杂交过程中，经菌丝与菌丝间的接触与融合而形成异核体。
2、接合现行：菌丝间接触与融合后，一样细胞质里把不同基因型的细胞核在双方增殖过程中，发生局部染色体的转移或遗传信息的交换，接合现象导致局部合子的形成。
3、杂合系的形成：局部合子形成后，在繁殖复制过程中，两种不同基因型的染色体进展一次交换，产生杂合系。杂合系是由基质菌丝中长出来的，形成的菌落很小，能在选择性培养基与根本培养基上生长。
4、重组体的形成：以上检出的杂合系或重组杂合系，在以后进一步繁殖过程中，杂合状态染色体的不同区段还要进展几次交换。根据交换的位置不同，所携带的基因种类、数量也不一致，形成了一系列基因型的环状染色体细胞，从产生的菌落中可检出不同类型重组别离子。杂合系是形成重组体所必须的阶段。
〔二〕放线菌杂交过程〔示意图见P266〕
亲本→局部结合子〔局部合子〕→杂合系→重组体
1. 局部结合子是由一个供体细胞的局部染色体与一个受体细胞整套染色体相结合，同时存在于一个细胞质中，也有时两个亲本细胞的染色体都是以局部染色体进展结合。两个亲本细胞以全部染色体进展结合形成的异核体在复制过程中染色体不发生交换，所产生的分生孢子进一步培养又获得两亲本。
2. 局部合子形成后，在繁殖复制过程中，两种不同基因型的染色体进展一次交换，产生了杂合系。杂合系是由基质菌丝中长出的，形成的菌落很小，能在选择性培养基与根本培养基上生长。
3. 杂合系不是封闭的环状构造而是呈线状，经过进一步繁殖，形成一系列基因型的环状染色体细胞，从而形成重组体。
〔三〕放线菌的杂交技术 图示P267
放线菌杂交方法有混合培养法、杂核系分析法、玻璃纸法与平板杂交法等。
一、混合培养法 :
(1) 直接亲本是杂交配对菌株，要求携带不同的营养缺陷型或抗性作为遗传标记。
(2) 斜面混合接种〔CM〕，即取两亲标新培养的成熟孢子或菌丝，重迭接种到完全培养基斜面。
(3) 单孢子的制备，即制单孢子悬液。
(4) 重组体的检出：用选择性平板别离得到目的重组体。
二、杂合系分析法：图示P270
从混合培养的孢子悬液中，别离筛选杂合系，再进一步从杂合第中筛选各种别离子。
两亲本混合培养→孢子悬液→MM培养基培养→取杂合系菌落〔较小的〕上的孢子制成单孢子悬液→CM培养基上培养→点种→影印到多种不同的选择性培养基平板上→得到所需要的重组体
三、玻璃纸法：
两亲本都具有营养缺陷型标记，且对同一药物一个敏感，另一个具有抗性。
两亲本孢子混合，接种到覆盖于CM培养基的玻璃纸外表，经一定时间培养，将玻璃纸转移到含有药物的SM培养基上培养，得到惟独能生长的特定杂合系菌丛。
四、平板杂交法：将CM上培养的A亲本菌落孢子影印至在CM〔或有限培养基〕上培养的B亲本菌落平板上，培养一段时间，两亲本菌丝接合形成局部合子，染色体进展单交换后形成杂合系，然后影印其孢子到各种选择性培养基平板上，从中可检出重组体别离子。
注：有限培养基〔LM〕是由CM与MM以1：9组成。
三、转导〔了解〕
定义：借助温与噬菌体为媒介，把供体细胞中DNA片段携带到受体细胞中，从而使后者获得前者局部遗传性状的现象，称为转导。 获得新遗传性状的受体细胞称为转导子。 转导过程不需要接触，而是以噬菌体为载体。
（一） 普通〔普遍〕传导：媒介为完全缺陷噬菌体〔侵染后其DNA为供体细胞的〕
（二） 局限传导：媒介为局部缺陷噬菌体〔侵染后其局部DNA为供体细胞的〕
四、转化〔了解〕
转化是受体菌直接吸收环境中供体菌的DNA片段而获得后者局部遗传性状的现象。
转化因子：起转化作用的供体细胞的DNA片段；转化子：通过转化作用形成的受体细胞。
特点：1. 一般只发生在同一物种或近缘物种之间；2.受体细胞只有处于感受态阶段才能吸收供体的DNA。
感受态：指细胞能从周围环境吸收DNA分子，将其整合入自己的基因组，并保证不被体内DNA酶破坏的生理状态，即实现转化的一种生理状态。
转化育种条件：1、感受态的出现〔a受体细胞的遗传，b生理状态，c菌龄，d培养条件〕；2、供体DNA浓度〔实现转化所需的DNA浓度极低〕；3、DNA相对分子质量〔一般为10*-7，约含有50个基因，太短那么不能转化〕；4、感受态因子〔它是一种胞外蛋白〕。
第三节 真核微生物的杂交育种
一、有性杂交：不同遗传型微生物的性细胞〔单细胞〕发生接合与重组的现象。
准性杂交：不同遗传型微生物体细胞的核融合而导致的一种低频率基因重组现象〔亲缘关系很近的亲本〕。
二、霉菌的杂交育种P277
〔一〕霉菌的准性生殖
两亲本→准性接合→基因重组→新遗传型→菌丝联结→质配→核配→有丝分裂→单倍子
准性生殖与有性生殖的区别； 准性生殖 有性生殖
参及接合的亲本细胞 形态一样的体细胞 形态、生理上存在分化的性细胞
独立生活的异核阶段 有 无
接合后双倍体细胞形态 及单倍体一样 及单倍体不同
双倍体变成单倍体的途径 有丝分裂 减数分裂
频率 偶然 、低 正常出现、高
（二） 准性生殖的三个阶段：
在菌丝体生长过程中，不同遗传类型的菌丝细胞接触融合，形成异核体、杂交二倍体，最后经染色体相互交换，产生一个具有新遗传特性的菌株。
异核体的形成〔不稳定〕→杂合双倍体的形成〔稳定〕→体细胞交换与单元化〔单倍体化〕
异核体：具有不同性状的两菌株的菌丝互相连接，导致在一个细胞或一条菌丝中并存有两种或两种以上不同遗传型的细胞核，进展质配，两个不同基因型的核独立存在，这样的菌丝体称为异核体。〔可参照P279的定义〕。异核体属于不稳定菌株，它们所产生的分生孢子会别离成两种亲本型，不能在MM上生长。
杂合双倍体的形成：异核细胞不够稳定，异核体中不同基因型的两个核有少数可发生细胞融合，进展核配，形成二倍体核，其存在较稳定。采用天然樟脑蒸气熏蒸或紫外线照射异核体，可以诱发异核体形成杂合二倍体。 体细胞交换：是指杂合二倍体核在有丝分裂过程中的交换现象，染色体之间发生交换而产生局部标记。〔频率0.001〕 单倍化：指杂合二倍体细胞在增殖过程中，基因借助整条染色体的随机交换而得到单倍重组体或单倍的亲本别离子。〔频率0.01〕
〔三〕霉菌杂交技术
〔1〕选择亲本；〔2〕强制异合；〔3〕移单菌落；〔4〕稳定性检验〔杂合二倍体稳定，而异核体不稳定〕；〔5〕促进变异〔紫外线处理……〕。
说明：杂合二倍体常常在异核体菌落上以角变或斑点形态出现，用接种针挑取其分生孢子，那么可别离、纯化得到杂合二倍体。〔移单菌落〕
三、酵母菌的有性杂交
〔一〕有性杂交：指性细胞间的接合与随之发生的染色体重组，并产生新遗传型的一种育种技术。
雌雄菌株→有性接合→染色体重组→新遗传型
〔二〕酵母有性杂交育种的根本过程
1.亲株的选择：具有亲合性与遗传标记，考虑育种的目的性； 2.形成子囊孢子〔用产孢培养基〕
3.接合：酶法或机械法破碎子囊，释放孢子，再平板涂布培养得到单倍体细胞，然后将两个亲本的单倍体细胞密集在一起，就可能的发生接合获得各种类型杂合子
4.杂交二倍体的筛选，从不同的杂合子中筛选初优良性状的个体。
酵母的双倍体及单倍体差异大
双倍体 单倍体
细胞 大，椭圆形 小，球形
菌落 大，形态均一 小，形态变化较多
液体培养 繁殖较快、细胞较分散 繁殖较慢，细胞常聚集成团
在产孢培养基上 能形成子囊 不能形成子囊
问：为什么有性杂交亲本可以不做标记，而准性杂交亲本需要做标记？
1、有性杂交频率比准性杂交频率高。
2、有性杂交亲本一、亲本二及重组体的细胞、菌落形态都不一样。【原核微生物杂交亲本也做标记】
第十一章〔第九章〕
第一节 ：菌种的衰退及复壮的概念
1、退化〔衰退〕：菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的存在，出现某些原有优良生产形状的劣化，遗传标记的丧失等现象，称为菌种的衰退。
原因：1、基因突变，主要原因，根本原因，基因突变引起的生产能力的下降，其中包括细胞内控制产量的基因突变或质粒脱落造成的。 2、别离现象。
3、连续移代〔传代〕：是加速退化发生的直接原因。
菌种退化的表现：
1、菌落、细胞形态发生变化，2、生长速度减慢，产孢子越来越少。3、抵抗力下降，抗不良环境能力下降。4、代谢产物生产能力下降，对宿主寄生能力下降。
2、菌种的复壮：狭隘的复壮是指菌种已发生衰退的情况下，通过纯种别离与生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未衰退的个体，以恢复原有菌体。
二、 菌种复壮的措施：1、纯种别离〔平板划线法、涂布法、倾注法、单细胞挑取法〕，2、淘汰法〔淘汰已衰退的个体〕，3、通过宿主体内生长进展复壮，4、采用有效的菌种保藏方法。
三、 防止菌种衰退的方法：
采用减少传代，经常纯化，创造良好的培养条件，用单细胞移植传代与科学的保藏等措施，不但可以使菌种保持优良的生产能力，而且还能是已退化的菌种得到恢复提高。
第二节 菌种保藏
目的：1、存活、不丧失、不污染，2、防止优良性状丧失，3、随时为生产，科技提供优良品种。
方法： 1、低温保藏法〔斜面保藏方法〕：菌种管置于4度冰箱保藏，定时传代。原理：低温下，微生物代谢强度明显下降。 2、液体石蜡油低温保藏法：橡皮塞取代棉塞，加石蜡油。 3、枯燥保藏法〔沙土保藏法、滤纸保藏法……〕。
4、真空冷冻枯燥法：适用于各种微生物，便于大量保藏，菌种生长时间长。
5、液氮超低温保藏法：讲菌种置于保护剂中，预冷冻之后保护在液氮超低温冰箱中，使用于各种微生物的的较理想的保藏方法。
第 18 页
展开阅读全文
浙ICP备2021020529号-1 | 浙B2-20240490 
