SN∕T 3391-2012 国境口岸巴贝西原虫检验规程.pdf

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 国境口岸巴贝西原虫检验规程犆 狅 犱 犲 狊狅 犳 犲 狓 犪 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳犅 犪 犫 犲 狊 犻 犪犪 狋 犳 狉 狅 狀 狋 犻 犲 狉狆 狅 狉 狋 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书犜犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行业标准国境口岸巴贝西原虫检验规程 中 国 标 准 出 版 社 出 版北京市朝阳区和平里西街甲号（ ）北京市西城区三里河北街 号（ ）总编室： （ ） 网址 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本 印张字数 千字 年月第一版 年月第一次印刷印数 书号： 定价 元书书书前言本标准按照 给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位： 中华人民共和国黑龙江出入境检验检疫局、 军事医学科学院微生物流行病研究所。本标准主要起草人： 付维明、 鞠文东、 孙毅、 杨德文、 徐宁、 包力、 程成、 王艳梅、 丁淑丽。犛 犖犜 国境口岸巴贝西原虫检验规程范围本标准规定了国境口岸巴贝西原虫检验对象、 方法、 结果报告、 生物安全要求及结果判定。本标准适用于国境口岸人、 蜱、 宿主动物感染巴贝西原虫的检验。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件， 其最新版本（ 包括所有的修改单） 适用于本文件。 实验室生物安全通用要求 国境口岸森林脑炎监测规程术语和定义下列术语和定义适用于本文件。 巴贝西原虫犅 犪 犫 犲 狊 犻 犪狆 犪 狉 犪 狊 犻 狋 犲 狊是一种隶属巴贝西属、 寄生于血液红细胞中的原生动物， 可由蜱或输血传播， 引起人和动物巴贝西原虫病。实验室生物安全防护检测样本的采集和处理应符合无菌操作原则， 进行标本检测的实验室应符合 中生物安全二级实验室要求。对象 疑似感染巴贝西原虫的入出境人员、 口岸边境人群的血液样本和其他组织样本。 蜱及宿主动物标本。试剂及器材试剂及器材参见附录 ， 或购买符合要求的商品化试剂盒。标本的采集和处理参照附录的方法进行。犛 犖犜 实验室检验方法 形态学检验 将染色的玻片置于低倍显微镜载物台上， 对准焦距。在涂片上红细胞分散均匀的部分， 滴加镜油一滴， 在油镜下耐心仔细按顺序观察。 红细胞被染成红褐色， 巴贝西原虫细胞质被染成蓝色， 细胞核染成深蓝色， 但并非任何一个蓝点或蓝环即为巴贝西原虫， 因为可能有染液沉渣及其他异物混淆， 区别异物的主要依据是掌握显微镜的细调节器， 通过它的上下移动， 若蓝点或蓝环与红细胞在同一平面， 而且具有一定的轮廊结构是巴贝西原虫， 反之则为异物。 当确定为巴贝西原虫后， 进一步辨认它为红细胞内期的某个发育阶段， 在薄血片中尚可找到其他白细胞或血小板。 对于几种常见白细胞的形态应加以区别，以免混淆： 环状体： 被寄生的红细胞尚无改变， 原虫形似宝石戒指。核呈深蓝色点状。细胞质为蓝色环状， 其大小不等， 约占红细胞的直径八分之一至四分之一左右。 二分体： 主要特征是细胞质有伪足伸展， 并形成空泡， 细胞核显著增大， 呈典型对称的配对排列。 四联体： 细胞质开始变为致密， 失去空泡及伪足， 呈规则的四联排列。 血清学检验参照附录规定的方法进行， 使用符合条件商品化试剂。 聚合酶链反应（犘 犆 犚） 检验参照附录 规定的方法进行。 离体培养鉴定按照附录规定的方法进行。结果判定 形态学检验 血涂片中观察到典型的环形体或四联体， 报告“ 观察到巴贝西原虫” 。 血涂片中未观察到典型的环形体或四联体， 报告“ 未检出巴贝西原虫” 。 血清学检验 血清学检验阳性， 报告“ 巴贝西原虫抗体（ 或抗原） 阳性” 。 血清学检验阴性， 报告“ 巴贝西原虫抗体（ 或抗原） 阴性” 。 聚合酶链反应（犘 犆 犚） 检验 检验阳性， 报告“ 巴贝西原虫核酸检验阳性” 。 检验阴性， 报告“ 巴贝西原虫核酸检验阴性” 。犛 犖犜 离体培养鉴定 标本中培养出巴贝西原虫， 报告“ 细胞培养检出巴贝西原虫” 。 盲传三代未见可疑巴贝西原虫， 报告“ 细胞培养三代， 未检出巴贝西原虫” 。 阳性结果处置 离体培养阳性结果应出具阳性报告单。 离体培养阳性结果应向上级主管部门报告。犛 犖犜 附录犃（ 资料性附录）巴贝西原虫检验主要试剂及器材犃 主要试剂犃 姬姆萨（犌 犻 犿 狊 犪） 染液姬姆萨染料 甘油 甲醇 将 染料加到 甘油中， 混匀， 置 ， 不时搅拌。取出凉至与室温相同时加入甲醇 ， 用磁力搅拌过夜。用滤纸过滤， 滤液即为原液。应用时用 （ ， ） 或蒸馏水稀释十倍。犃 培养基的主要成分及制备方法犃 犘 犚犕 犐 培养液（） 溶液 高纯水或去离子水 （） 缓冲液 高纯水或去离子水 注： ，犖 犖 为犖 羟乙基哌嗪 犖 乙磺酸， 相对分子质量 。（） 将（） 和（） 分别溶解后混合在一起， 补充三蒸水至 。混合后用 或更小孔径的微孔滤膜过滤除菌。分装 瓶，保存。犃 其他组分（） 谷氨酰胺溶液 谷氨酰胺 高纯水 溶解后过滤除菌， 分装 瓶， 保存。（）抗生素配制（万单位 ）青霉素 链霉素 无菌高纯水 溶解后无菌操作分装 瓶， 保存。（）两性霉素配制（ ）两性霉素 高纯水 犛 犖犜 过滤除菌， 分装瓶， 保存。犃 犚 犘犕 犐 完全培养基 培养液 谷氨酰胺（ ） 抗生素（ 青、 链霉素） 两性霉素（ ） 灭活小牛血清 过滤除菌， 分装瓶， 保存。犃 阿氏（犃 犾 狊 犲 狏 犲 狉） 血液保存液葡萄糖 柠檬酸钠 柠檬酸 氯化钠 加蒸馏水至 ， 溶解后过滤， 分装， 灭菌 ， 保存。血液与阿氏液混合比例为体积分数。犃 原虫冻存液（ 水溶剂， 以下为体积分数）甘油 山梨醇氯化钠 犃 原虫复苏液（ 水溶剂， 以下为体积分数）山梨醇 氯化钠 犃 犘 犆 犚试剂犃 （ ） ： （ 三羟甲基氨基甲烷） ， 浓盐酸（ ） 调整 值。犃 缓冲液： （ ） ， （ ） 。犃 缓冲液： 氯化钾（ ） ， 氯化镁（ ） ， ， 。犃 电泳缓冲液： 碱， 冰乙酸， （ ） ， 加蒸馏水至 ， 使用时十倍稀释。犃 缓冲液： 在 蒸馏水中溶解 氯化钠（ ） 和 柠檬酸钠， 加入数滴 氢氧化钠（ ） 溶液调节 值至 ， 加水定容至， 分装后高压灭菌。犃 琼脂糖： 电泳级。犃 器材犃 离体培养器材 孔细胞培养板； 滤膜滤器； 旋涡振荡器； 离心机； 暗视野光学显微镜； 解剖显微镜； 全排式生物安犛 犖犜 全柜； 恒温培养箱； 除菌滤膜； 高压蒸汽灭菌器； 玻璃吸管（ 、 ） 、 量筒（ 、 ） 、 三角烧瓶（ 、 ） ； 电子天平（ 精确到 ） ； 普通冰箱。犃 犘 犆 犚器材离心机； 仪； 电泳仪； 可调移液器： 、 、 、 ；凝胶成像仪。犛 犖犜 附录犅（ 资料性附录）标本的采集和处理犅 疑似感染者标本的采集犅 疑似感染者的血液（ 末梢血、 静脉血、 骨髓） 、 其他组织的印片可进行病原学检测， 常规采样后立即送检。犅 无菌方法采集血液， 抗凝后无菌试管保存， 立即送检。犅 用未抗凝的真空管采集患者急性期（ 发病三天内） 、 第三周、 第六周血清， 用于血清学检测。犅 疑似感染者标本的处理犅 制作血涂片犅 血液标本取， 置于一张洁净载玻片（ 甲片） 的一端， 涂片时用左手在拇指及食指持握该片的两端。犅 另取一张载玻片作推片（ 乙片） ， 将其一端接触甲片血滴， 使血滴沿推片向两侧展开， 两片之间保持 的夹角。犅 将乙片紧靠甲片， 沿着甲片的表面轻而迅速地向前推动， 直到甲片的另一端为止。推片时注意保持一定的速度和两片间的角度， 切忌过分用力或中间停顿， 否则将使血球破碎或涂布不匀。质量好的薄血膜应呈舌形， 血细胞分布均匀。犅 将制好的血片置于空气中干燥， 用甲醇一到两滴置于血片上， 均匀散开， 固定血膜， 干透后再染色。犅 血涂片染色方法血涂片染色采用国际通用的 染液进行（ ） 稀释后（ 现稀释现用） ， 染色 ， 清洗， 自然风干后观察。犅 用于血清学试验的血液处理采集后的血液以相对离心力 犵离心 ， 分离出血清。犅 蜱及宿主动物标本采集蜱及宿主动物采集， 参照 进行。宿主动物血液标本， 应常规无菌取样， 用有盖无菌或不抗凝的真空管采集保存。犅 蜱及宿主动物标本处理犅 参照 、 、 制作血涂片。犅 血液采集后以相对离心力 犵离心 ， 分离出血清。犛 犖犜 附录犆（ 资料性附录）巴贝西原虫血清学检验犆 血清抗原检验犆 原理使用抗 单克隆抗体或多克隆抗体， 利用阳性抗体血清与抗原的结合， 通过间接免疫荧光（ ） 方法， 检测病人或宿主动物或蜱中巴贝西原虫。犆 操作步骤犆 将患者的血液按 方法制作薄血涂片， 风干后， 丙酮固定 ， 晾干备用。将阳性抗体血清 覆盖于薄血片上， 湿盒孵育 。甩去多余血清， 用 （ ） 洗涤次， 风干。犆 将 标记的酶标二抗， 覆盖于薄血片上， 湿盒孵育 。甩去多余血清， 用 （ ） 洗涤次， 风干后用荧光显微镜观察。犆 结果判断阴性结果： 荧光显微镜观察， 红细胞内部或细胞间未见特异性荧光。阳性结果： 荧光显微镜观察， 红细胞内部或细胞间可见， 呈环状体或四联体状特异性绿色较强荧光。犆 血清抗体检验犆 原理利用抗体血清与阳性抗原的结合， 通过间接免疫荧光（ ） 方法， 检测病人或宿主动物中巴贝西原虫抗体。犆 操作步骤犆 将患者的血液按 方法制备血清， 或直接采血置于紫帽促凝血清分离管中分离血清。犆 将患者血清 覆盖于阳性抗原片上， 湿盒孵育 。甩去多余血清， 用 （ ） 洗涤次， 风干。犆 将 标记的酶标二抗， 覆盖于阳性抗原片上， 湿盒孵育 。甩去多余血清， 用 （ ） 洗涤次， 风干， 风干后用荧光显微镜观察。犆 结果判断阴性结果： 荧光显微镜观察， 未见特异性荧光。阳性结果： 荧光显微镜观察， 可见特异性荧光呈环状体或四联体， 如阳性荧光太强可将患者血清梯度稀释测定其抗体滴度。犛 犖犜 附录犇（ 资料性附录）巴贝西原虫聚合酶链反应检验犇 扩增引物下列是根据巴贝西原虫基因 设计的一对引物， 在 中参考序列号为 ， 具有高度特异性， 供使用时参考。阳性标本可扩增出 的片段。外引物上游引物： 下游引物： 内引物上游引物： 下游引物： 犇 模板制备犇 原虫虫株的模板制备犇 取原虫虫株感染率超过 的红细胞 ， 溶于 缓冲液中。犇 加入溶菌酶（ ） ， 水浴 。犇 加入 十二烷基硫酸钠溶液（ ） ， 水浴 （ 变清为止） ， 室温冷却。犇 加入蛋白酶 （ ） 。犇 加入 酶（ ） 。犇 加入 酚、 三氯甲烷、 异戊醇混匀液， 抽提三次。犇 加入冰乙醇， 离心 ， 弃上水相， 自然干燥， 加入 ，保存待测。犇 临床标本的模板制备犇 取血， ， ， 弃上清液， 加 缓冲液 。犇 煮沸 ， 室温冷却。犇 加入 酶（ ） 。犇 离心 ， 取上清液 用于 扩增。犇 蜱及宿主动物标本的模板制备犇 蜱标本处理： 取蜱一只（ 幼虫可五到十只为一组） ， 用体积分数为 的乙醇溶液浸泡 进行表面消毒， 然后用无菌蒸馏水洗涤次， 无菌滤纸吸干水分。研磨器加 缓冲液研磨至细粉末状， 然后按照 至 程序进行。犇 宿主动物血液标本按 处理。犇 第一轮扩增犇 取无菌的 扩增管， 设置阴性对照、 阳性对照， 将样品编号， 按照以下加样量加样：犛 犖犜 模板 缓冲液（ 含氯化镁） （ ） 上游引物（ ） 下游引物（ ） 聚合酶（） 超纯水 犇 混匀， 离心 ， 将管内液体甩入管底。犇 设置扩增反应条件： ； ， ， ， 个循环； 最后 ，进行第一轮 扩增。犇 第二轮扩增按照 体系， 把上下游引物改为内引物， 将第一轮扩增产物作 倍到 倍稀释后作为模板，按 混匀， 设置扩增反应条件： ： ， ， ， 个循环； 最后 ， 进行第二轮 扩增。犇 电泳取 扩增产物， 加入溴酚蓝上样缓冲液， 混匀， 加样于 琼脂糖凝胶（ 含 溴化乙锭） 胶孔中， 以 稳定电压电泳 ， 用凝胶成像系统观察是否出现目的条带（ ） 。犇 结果判定如阴性对照和空白对照未出现条带， 阳性对照和待测样品均出现预期大小的扩增条带（ 扩增片段大小为 ） ， 则可初步判定该样品巴贝西原虫核酸检验阳性， 应进一步进行测序验证； 如果待测样品中未出现 扩增产物， 则判断为待测样品巴贝西原虫核酸检验阴性。犛 犖犜 附录犈（ 规范性附录）巴贝西原虫离体培养鉴定犈 初培养将患者或宿主动物的血液标本， 用玻璃珠法机械抗凝， 加入 培养液， 以相对离心力 犵离心 ， 用无菌吸管吸弃上清液， 保留淡黄色粘层， 而后用 培养液或的 液（ ） 洗涤红细胞层次， 备用。取正常“” 型血红细胞， 加入 培养液， 以相对离心 犵离心 ， 用无菌吸管吸弃上清液， 仅留红细胞。而后用 培养液或的 液（ ） 洗涤红细胞层次， 备用。在 孔细胞板中加入 患者或宿主动物红细胞， 加入正常“” 型血红细胞 ， 然后补充 完全培养基至 ， 加盖板后用封口膜封固。将细胞培养板放置于蜡烛缸中， 点燃蜡烛， 待蜡烛即将熄灭时盖好蜡烛缸， 将蜡烛缸放置于 培养。每 换液， 无菌吸管吸弃上清培养液并加入等量新鲜 完全培养基， 取样后参照 、 、 制作血涂片， 按照 方法进行观察。犈 传代培养取 初培养中阳性培养物 ， 加入正常红细胞 ， 然后补充 完全培养基至 ， 加盖板后， 按 初培养蜡烛缸法进行培养， 监测红细胞感染率至达到 以上即可冻存。犈 冻存保种当感染率超过 时， 以相对离心 犵离心 ， 弃上清液， 将沉淀物混匀， 分别取 加入冷冻管内， 各等量加入冻存液。先放入冰箱后， 冰浴 后再放入液氮罐中冻存。犛 犖犜