治疗性抗体.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,第九章 治疗性抗体（,Cure Antibody,）,第一节 概述,(Introduction),1890,年,Behring,和北里柴三郎发现了可特异中和外毒素的血清组合白喉抗毒素，建立了血清疗法，开抗体制药之先河。,至今，以破伤风抗毒素血清为首紧急预防和治疗以毒血症为主要发病机制的疾病的有利武器。,抗体活性主要存在于丙种球蛋白组分。,血清中存在一种能特异中和外毒素的组分称之为抗毒素。将血清中这种具有特异性反应的组分称为抗体。,一、抗体分子的基本结构（,Structure of Antibody,）,抗体指能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。,它是机体免疫系统受抗原物质刺激后，,B,淋巴细胞被活化、增殖和分化为浆细胞，由浆细胞合成和分泌的球蛋白。,具有抗体活性及化学结构与抗体相似的球蛋白，统称为,免疫球蛋白,（,immunoglobulin,，,Ig,）。,二、抗体分子的生物学功能（,Biological function of Ab,）,抗体是体液免疫应答中发挥免疫功能最主要的免疫分子，其功能是由其分子中不同功能区的特点所决定的。,轻链,（,Light chain,）上有一个轻链易变区（,Variable region of light chain,，,VL,）及一个轻链恒定区（,Constant region of light chain,，,CL,）。,重链,（,Heavy chain,）有一个重链易变区（,Variable region of heavy chain,，,VH,）及,3-4,个重链恒定区（,CH1-CH4,）。,抗体分子的各种功能区分别发挥不同的生物学效应。,Fab,与,Ag,结合,Papain,Fab2,Fc,木瓜,E,Pepsin,F(ab,),2,pFc,胃蛋白酶,Fc,Fc,通过胎盘与,补体及,Fc,受体,c,结合,N,端,C,端,铰链区,Ig,分子的结构模式图,CDR(,互补决定区）,1,、特异性地结合抗原（,Specific combine Ag,）,是由,V,区（尤其是,V,区中的超变区）的空间构型决定的，是可逆的，并受到,pH,、温度和电解质浓度的影响。,aa,极大变化的超变区（,Hypervariable region,，,HV,）或互补决定区（,Complementarity determining region,，,CDR,），,CDR1-CDR3,（各,5-16aa,）：,可特异性结合,Ag,框架区（,Framework region,，,FR,）：为,片层结构，,aa,序列相对稳定，,不与,Ag,直接结合。,2,、活化补体（,Activate complement,）,IgM,、,IgG1,、,IgG2,和,IgG3,可通过经典途径活化补体。凝聚的,IgA,、,IgG4,和,IgE,等可通过替代途径活化补体。,3,、结合,Fc,受体,(Combined Fc receptor),不同细胞表面具有不同,Ig,的,Fc,受体，分别用,FcR,、,FcR,等表示。当抗体与相应抗原结合后，由于构型的改变，其,Fc,段可与具有相应受体的细胞结合，发挥不同的生物学作用：,（,1,）介导,型变态反应,IgE,与嗜碱性粒细胞、肥大细胞表面,IgE,高亲和力受体,FcRI,结合，发生脱颗粒，引起,型变态反应。,（,2,）调理吞噬作用,抗体在抗原颗粒与吞噬细胞之间“搭桥”，加强了吞噬细胞的吞噬作用；,抗体与相应颗粒性抗原接合后，改变抗原表面电荷，降低吞噬细胞与抗原之间的静电斥力；,抗体可中和某些细菌表面的抗吞噬物质；,吞噬细胞,FcR,结合抗原抗体复合物后，吞噬细胞可被活化。,（,3,）发挥抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（,ADCC,作用）当,IgG,抗体与带有相应抗原靶细胞结合后，可与嗜中性粒,C,、单核,C,、巨嗜,C,、,NKC,等效应,C,结合，发挥,ADCC,作用。,4,、通过胎盘（,Through placenta,）,在人类，,IgG,是唯一可通过胎盘从母体转移给胎儿的,Ig,，是一种重要的自然被动免疫，对于新生儿抗感染有重要作用。,三、抗体分子的治疗作用（,Cure effect of Ab,）,各种抗体被广泛地应用于疾病的的诊断、预防及治疗，在体外诊断上，用于检测各种抗原，包括感染性病原体抗原、血清肿瘤可溶性抗原、细胞表面抗原、受体、激素、神经递质、细胞因子等。肿瘤检测方面，同位素标记的单克隆抗体可与肿瘤组织表面的抗原结合，起到免疫扫描、免疫成像的作用，优于超声波和核磁共振。在预防方面，抗体主要可用于感染性疾病的预防，如流感、乙肝等。本节将着重介绍抗体的治疗作用。,1,、抗体的治疗机制,Cure mechanism of Ab,（,1,）中和作用,(Neutrilization),用于感染性疾病，使病原体或其产生的毒素丧失致病力。,（,2,）示踪或导向作用,Tracer or targeted effect,使与其相连的功能性分子特异性地激活或封闭、破坏靶细胞或靶分子。,（,3,）竞争性抑制作用,/,拮抗作用,（,Competitive inhibition,）,与体内产生或体外进入的物质结合，阻止其与靶分子作用产生毒性损害。,（,4,）抗体依赖性细胞介导的细胞毒效应（,Ab dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC,）及补体依赖性细胞溶解作用,（,Complementarity dependent cytolysis,，,CDC,）。,（,5,）通过内影像作用模拟抗原，使疫苗更具安全性及广泛性。,2,、抗体的治疗应用（,Cure application of Ab,）,随着抗体制备技术的进步，治疗性抗体已逐渐从实验室走向临床，并在多种疾病的治疗方面展示了光辉的前景。,（,1,）抗肿瘤作用（,Anti-tumor,）,由于多克隆抗体本身的局限性，所以直到单克隆抗体出现，抗体用于抗肿瘤治疗才真正得以实现，自从,1978,年成功制备第一株抗黑色素瘤单抗以来，出现了抗胃肠癌、肺癌、乳腺癌、白血病、淋巴瘤、胰腺癌、神经胶质瘤等的单克隆抗体，并于,1980,年首次在美国开展了单克隆抗体肿瘤治疗的临床试验。,1983,年,Miller,等报道了一例经单克隆抗体治疗的淋巴瘤患者，在放疗、化疗及干扰素治疗后，使用单克隆抗体治疗存活超过了,4,年。,单克隆抗体杀伤肿瘤细胞的机制可能是：,抗体依赖性细胞介导的细胞毒效应（,ADCC,）及补体依赖性细胞溶解作用（,CDC,）。,单克隆抗体与药物、毒素或放射性物质偶联，成为一种全新的“生物导弹”，可用于导向治疗。,单抗给予,T,细胞所必需的重要表面信号分子交联的刺激信号和生长信号，体外诱导肿瘤特异性细胞毒,T,淋巴细胞（,tumor specific cytolytic T lymphocytes,，,TS-CTLs,）可用于特异性、被动性的免疫治疗。,（,2,）抗感染作用（,Anti-infection,）,应用疫苗、免疫球蛋白，预防和治疗感染性疾病，但对不能获得相应疫苗的病毒感染，,AIDS,及一些危重情况，如内毒素休克等则无效。,被动抗体疗法主要机制是中和病毒，并已证明抗体在体外及体内中和病毒的效应不依赖于,Fc,介导 的功能和双价的存在，但可能受抗体亲和力影响。,体外无中和病毒作用的抗,Gag,单抗在体内试验中表现出预防及治疗效应，显著延迟了疾病的发作，降低了中枢神经系统的病毒水平，且与剂量相关，呈单间依赖性。这些结果提示非中和性抗体的效应与病毒感染的细胞表面表达,Gag,蛋白有关，但机制不清。,（,3,）抗器官移植排斥反应（,Anti-repelling of organ transplant,）,抗体主要通过阻断异体抗原的识别及排斥途径和分子机制中的某一环节，产生免疫抑制效应，预防排斥反应发生。,Tc,共有的分化抗原,CD3,（,Cluster of differentiation,）分子及,IL-2R,对,T,细胞的活化、增殖起重要作用，因此抗,CD3,及抗,IL-2R,工程抗体的研究较为多见。,（,4,）抗血栓形成（,Anti-formation of thrombus,）,封闭血小板糖蛋白,b/a,整合素受体，是血栓性疾病治疗上的突破（,Tubeliverst,，,1999,）。,近年来许多关于抗,GPb/a,单抗,C7E3,的研究表明，,C7E3,能对,90%,以上的受体产生阻断效应，减少了,35%,高危的经皮腔冠脉介入治疗（,PTCA,）后缺血性并发症及,27%6,个月内的临床再狭窄的发生，并证明,C7E3,能预防动脉但不能预防静脉的血栓再形成。,（,5,）解毒（,Detoxicating,）,对药物或动物毒素中毒患者，免疫治疗是应用抗该药物或毒素特异性抗体或其片段。抗体与毒素形成复合物，改变了毒素的药物动力学，使毒素与受体解离，从其结合部位呈梯度流出，进入血循环中。,这种方法对强心苷中毒有明确疗效。基因工程抗体对百草枯及蛇毒中毒也有一定作用。,（,6,）构建抗独特型抗体疫苗（,Constuction of anti-idiotype vaccine,）,抗独特型抗体在结构和功能上均能模拟抗原（内影像作用）而发挥效应。据此构建的独特型疫苗模拟肿瘤相关蛋白抗原，能诱导抗肿瘤免疫反应。,（,7,）在自身免疫性疾病及变态反应性疾病中的应用,自身免疫病多与单或寡克隆抗体的异常增多有关。,利用基因工程技术制备针对这些异常抗体独特型的抗抗体或与自身抗体结合并抑制其作用；或制备能模拟抗原的内影像抗体用于中和体内的自身抗体。针对不同发病机制，治疗方法趋于多样化。,许多变态反应与,IgE,有关。,Fc,片段可与变应原特异性,IgE,竞争结合嗜碱性粒细胞，封闭变应原介导的组胺释放。还可生产出与患者,IgE,竞争结合变应原的,Fab,样分子。,第二节 抗体的分类、结构、功能特点,（,Class,、,structure and function of Ab,）,一、抗体的分类（,Class,）,抗体分为单克隆抗体、多克隆抗体及基因工程抗体三类。,（一）多克隆抗体,(Polyclone Ab,）,传统的抗体制备方法是将一种天然抗原经各种途径免疫动物，由于抗原物质具有多种抗原决定簇，可刺激机体产生多种抗体形成细胞克隆，合成和分泌抗各种决定簇的抗体分泌到血清或体液中，在其血清中是含多种抗体的混合物，称为,多克隆抗体，是第一代抗体,。精制破伤风抗毒素就是一例。,（二）单克隆抗体（,Monoclone Ab,）,识别一种抗原决定簇的细胞克隆所产生的均一性抗体，称之为,单克隆抗体,。,其,特异性高、亲和力强、效价高、血清交叉反应少,等优点，已经在基础研究、临床诊断及治疗、免疫预防等领域发挥了重要作用。近年来用单抗与核素、各种毒素或药物偶联或基因重组制备成导向药物，用于肿瘤的治疗成为研究的重点。,在治疗中应用的单抗，分两种形式：,一种是全抗，另一种是其酶解片段,，由于治疗用的单抗均非人源的，所以去除,Fc,段的酶解片段可以降低抗原性，减少人抗鼠反应，主要用于导向治疗,。,1,、木瓜蛋白酶的水解片段,（,1,）裂解部位：,IgG,铰链区,H,链链间二硫键近,N,端侧切断。,（,2,）裂解片段：,两个,Fab,段（抗原结合段）,一个,Fc,段（可结晶段）,2,、蛋白酶的水解片段,（,1,）裂解部位：铰链区,H,链链间二硫键近,C,端切,（,2,）裂解片段：,F,（,ab,）,/,2,包括一对完整的,L,链和由链间二硫键相连一对略大于,Fab,中,Fd,的,H,链，称为,Fd,/,含,235,个氨基酸残基；,F,（,ab,）,/,2,具有双价抗体活性。,Fc,可继续被胃蛋白酶消化成更小的片段，失去其生物学活性。,应用单克隆抗体全抗或酶解片段在动物试验及临床试验中已经取得了较为良好的结果，一些实验结果报告如下：,131,I-CMU72,在人胃癌细胞系,MGC80-3,裸鼠移植模型的导向治疗中显示有明显的抑制作用，且清除率低，显像时间长，提示在胃癌临床导向研究上将有光辉的应用前景。,131,I,标记抗人扁豆凝聚素结合型甲胎蛋白异质性抗体（,AFP-R-LCA-McAb,）后，在裸鼠实验性肝癌模型中获得良好的治疗效果，,85%,的肿瘤生长明显抑制，表明,AFP-R-LCA-McAb,对人肝癌细胞有较高的特异性和亲和力，有希望成为肝癌放免治疗的理想载体。,抗淋巴细胞单克隆抗体（,SALM,）治疗恶性淋巴瘤临床试验显示对非何杰金氏淋巴瘤疗效显著，可能与抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用有关，另外可能由于,SALM,对此类淋巴瘤有特异性疗效。,抗绿脓杆菌单抗进行保护小鼠抗绿脓杆菌感染实验中作外敷治疗，证明可显著增强人体中性粒细胞对绿脓杆菌的吞噬，应用于烧伤创面抗绿脓杆菌感染获得满意效果，且未见过敏反应。,抗人脑胶质瘤单抗,S2-39,与阿霉素结合、胃癌单抗,3H11,与丝裂霉素交联及抗人胰腺癌,YPC3,单抗介导的,LAK,细胞体外、体内的试验也均显示较好的结果。单克隆抗体具有许多优点，但其本身也,存在一些问题,。,（,1,）单克隆抗体的免疫原性,由于人,/,人杂交瘤技术还存在很难,克服的障碍，目前绝大多数单克隆抗体,为鼠源性，因此对人体仍有较强的免疫,原性，使用后可产生人抗鼠抗体，从而,干扰了单克隆抗体在体内的合理分布，,重复使用会降低抗体疗效或发生超敏反应。,（,2,）半衰期短,杂交瘤制备的单克隆抗体半衰期一般较短，不利于其发挥生物学效应。,（,3,）靶吸收差,单克隆为完整的抗体分子，相对分子质量很大，很难通过血管进入细胞间隙，因此在靶部位（特别是肿瘤），单克隆抗体的摄取量非常低，大大降低了治疗效果。酶解片段较全抗在这方面有所改善。,（,4,）生产复杂，价格昂贵,（三）基因工程抗体（,Gene Engineering Ab,）,目前绝大多数单克隆抗体是鼠源的，临床重复给药时体内产生抗鼠抗体，使临床疗效减弱或消失。,因此，临床应用理想的单克隆抗体应是人源的，但人,人杂交瘤技术目前未突破，即使研制成功，也还存在人,人杂交瘤体外传代不稳定，抗体亲和力低及产量不高等问题。较好的解决办法是研制基因工程抗体，以代替鼠源单克隆抗体。,基因工程抗体兴起于,20,世纪,80,年代早期。这一技术是将对抗体基因结构与功能的了解与,DNA,重组技术相结合，根据研究者的意图在基因水平对抗体分子进行切割、拼接或修饰，甚至人工全合成后导入受体细胞表达，产生新型抗体，也称,第三代抗体,。,本章将分四个部分,：鼠单克隆抗体的人源化、小分子抗体、特殊类型的基因工程抗体、人源性抗体，对基因工作抗体的原理、制备及近年的进展加以详细介绍。,1,、鼠单克隆抗体的人源化（,Humanization of Mouse McAb,）,鼠单克隆抗体的人源化，就是为克服鼠源,McAb,的免疫原性而将其进行改造，使之和人体内的抗体分子具有极其相似的轮廓，从而逃避人免疫系统的识别，避免诱导人抗鼠免疫反应。,因而抗体的人源化有两个基本的原则：保持或提高抗体的亲和力和特异性；大大降低或消除抗体的免疫原性。,第一代人源化抗体,是将鼠,McAb,的可变区和人抗体的恒定区组成嵌合抗体（,Billeta 1993,）。其独特的抗原亲和力保持得很好，但因为有鼠单抗可变区的存在，仍有强烈的,HAMA,反应。（人抗鼠抗体反应）,进一步将鼠,McAb,可变区中相对保守的,FR,按成人的,FR,框架区（,frame-work region,），仅仅保留抗原结合部位,CDR,（即,CDR,移植互补决定区），这才是真正意义上的抗体人源化，该种抗体又称为,CDR,移植抗体或改型抗体。,（,1,）人,-,鼠嵌合抗体（,Human-mouse Chimeric Ab,）,由于人抗鼠免疫反应（,HAMA,）,90%,是针对,C,区的，因此设计用人,C,区替代鼠,C,（,constant,）区，则可能使鼠源性单克隆抗体的免疫原性明显减弱。,嵌合抗体的基本原理就是从分泌某种鼠单克隆抗体的杂交瘤细胞基因组中分离并鉴定出重排的功能性鼠,IgV,区基因，经基因重组与人,IgC,区基因按一定方式相拼接，克隆到表达载体中构建鼠,/,人嵌合的轻重链基因表达载体，并转入适当的宿主细胞表达来制备特异性嵌合抗体。,通过构建嵌合抗体，用人,C,区取代鼠,C,区，可以较好解决鼠源性单克隆抗体诱发,HAMA,等不良反应，延长单克隆抗体的半衰期，改善单克隆抗体的药物动力学。,嵌合抗体已经用于抗肿瘤、抗感染、抗自身免疫等疾病的治疗，并已显示出良好的治疗效果。,嵌合抗体诱发,HAMA,率仍较高，在导向诊断、导向治疗等方面的应用将会受到限制。,嵌合抗体已经用于治疗黑色素转移瘤，该抗体含有人,IgG1,链,C,区与鼠,V,区,14.18,，可特异识别神经母细胞瘤及黑色素瘤表面的,GD2,糖脂。大部分患者症状得到完全或部分缓解，也出现了一些副作用，如关节痛、瘙痒、短时瞳孔反应消失等。一些嵌合抗体分别用于胰腺癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、骨髓瘤、急性白血病等的治疗，证明嵌合抗体有较好的抗肿瘤活性。,（,2,）改型抗体（,Human ization Antibody,人源化,Ab,）,又称人源化抗体，尽管绝大多数,HAMA,反应是针对,C,区的，但有些单克隆抗体如,OKT3,用于人体时，其,HAMA,反应则主要是针对,V,区的，如果再把嵌合抗体的鼠,FR,区替换成人,FR,区，则可能减少单克隆抗体的免疫原性。研究指出，抗体与抗原结合的特异性和亲和力主要取决于其,V,区的,6,个互补,CDR,区（互补,Ag,决定区）。,如果把人单克隆抗体的,CDR,区置换成鼠单克隆抗体,CDR,区，这样的重组抗体的人源化可达,97%,，在保留鼠源单克隆抗体特异性与亲和力的同时，又可大大降低单克隆抗体的免疫原性，发挥更佳疗效。,但是，由于人源化抗体的构建需要替换,CDR,区，而且还得预先得到抗体基因序列，技术相当复杂。,抗肿瘤治疗,:,人源化抗,CDw52,抗体用于治疗两例非何杰金氏淋巴瘤，,43d,后仍未发生,HAHA,反应，血液及骨髓中的淋巴瘤细胞全部消失，脾肿大消退，且不抑制骨髓的正常增殖，在治疗白血病的临床试验中表明，抗体无明显的毒性及抗原性。,抗类风湿性关节炎,:,人源化抗体可用于,RA,的临床治疗，但具有轻度到中度的毒性，且只能短暂改善,RA,症状，说明尚需进一步的改进。,抗移植反应,:,人源化抗体，包括,IL-2T,，抗,CD3,等抗体已经用于抗移植反应这方面的治疗。抗,IL-2R,人源化抗体抗,-Tac-H,用于食蟹猴异体心脏移植，表明抗,-Tac-H,是一种较理想的抗排斥反应物，,CD3,抗体也同样具有抗移植反应的作用。,抗病毒,:,人源化抗,HSV gB,及,gD,糖蛋白抗体的亲和力，中和,HSV,以及细胞保护力等明显高于其亲本单克隆抗体，如人源化的抗,RSV,抗体,RSHZ19,。保护性明显优于人免疫血清球蛋白。,抗,TNF:,人源化抗,TNF-,抗体,Mab780,具有部分中和,TNF-,能力，并能竞争性拮抗其亲本单克隆抗体或嵌合抗体对,TNF-,的结合。,抗过敏反应,:,人源化抗,IgE MaE11,抗体已经显示了这方面的能力。,2,、小分子抗体（,Small Molecular Ab,）,完整的抗体分子，相对分子质量较大，难以穿过血管壁，影响了靶部位对其的摄取。特别是肿瘤细胞，血供本来就不丰富，对抗体的摄取量就更少了。,因此对抗体分子进行改造，使之成为小分子抗体。,小分子抗体可分为,Fab,抗体、单链抗体、单域抗体、超变区多肽等四种。,（,1,）,Fab,抗体,抗体的,Fab,段由重链,V,区（,VH,）及,CH1,功能区与轻链间以二硫键形式连接而成，主要发挥抗体的抗原结合功能。,Fab,抗体是对,Fab,段进行改造而获得的基因工程抗体。即将抗体分子的重链,VH,区和,CH1,功能区的,cDNA,与轻链完整的,cDNA,连接在一起，克隆到适当的表达载体后，在大肠杆菌等宿主中表达出有特异性抗原结合能力的,Fab,抗体。,Fab,抗体大小只有完整,IgG,的,1/3,。下面介绍几个已应用于临床试验的治疗性,Fab,抗体。,抗地高辛,Fab,抗体,:,具有明显的抗地高辛中毒作用，可用于洋地黄中毒患者，可恢复房室传导阻滞。,抗去郁敏,Fab,抗体,:,在去郁敏（,desipramine,，,DMI,）心肌中毒的小鼠模型中应用羊抗去郁敏,Fab,后，可明显改善,QRS,间隙时间及心率，而且大剂量的效果更佳。,抗血小板,GPIIbII/IIIa,受体,Fab,抗体：,用不同剂量的抗血小板,GPIIbIIIa,受体,Fab m7E3,抗体治疗稳定型心绞痛患者，发现,Fab,抗体以依赖性方式抑制血小板凝聚。,抗,HSV Fab,抗体：,抗,HSV Fab19,可特异识别多株不同的,HSV-1,及,HSV-2.,有,100%,的中和作用。,（,2,）单链抗体（,Single chain Ab,）,在重链,V,区,cDNA3,端（,VH,端）与轻链,V,区,cDNA5,端（,VL,端）之间，用一寡聚核苷酸接头（,linker,，,14-25,个,aa,为宜）连接成单链可变区基因片段，表达出一具有抗原结合能力的单链抗体多肽，其大小只为完整抗体的,1/6,。应用现状简介如下：,放射免疫疗法,放射性免疫疗法的原理与体内成像相似，必须有足够量的放射性标,ScFv,（单链可变区片段）定位于靶部位，达到发挥放射性治疗的水平。,ScFv,的快速清除使非结合的放射性标记,ScFv,迅速排出，这也是,ScFv,有别与,Fab,片段的重要优点之一。,免疫毒素治疗,ScFv,免疫毒素的细胞毒作用有时比化学合成的免疫毒素高,15100,倍以上，其他效应功能区可与,ScFv-,毒素融合，加强靶细胞的杀伤作用。,体内药物解毒作用,由于,ScFv,的清除率比,Fab,快，因此,ScFv,可能具有更强的解毒作用，如,26-10ScFv,可用于治疗地高辛中毒。,ScFv,作为小分子抗体，保留了亲本单克隆抗体结合抗原的特异性，又使其抗原性大大降低，其药物动力学优于,Fab,抗体或,IgG,等完整抗体。,ScFv,相对分子质量很小，能有效进入完整抗体无法到达的靶部位，如病毒的“峡谷”部位及肿瘤内部,ScFv,。,V,H,cDNA3,端,V,L,cDNA5,端,+,寡核苷酸,linker,重组,DNA,+,分子载体（,vector,）,限制酶,连接酶,体外重组,DNA,分子,转化,E.coli,表达,ScAb,单链抗体的制备流程图,（,3,）单域抗体（,Single domain Ab,）,抗体结合抗原主要由,V,区决定，只含有,V,区基因片段表达的小分子抗体，即只有,VH,或,VL,一个功能结构域，也能保持原单克隆抗体的特异性。这种小分子就称为,单域抗体,（,single domain antibody,），其相对分子质量仅为完整抗体分子的,1/12,，故也称之为小抗体。,单域抗体仅有一个结构域，制备相当简单，表达出有活性的抗体片段，因此也不失为一种有良好应用前景的基因工程抗体。,与,Fab,、,ScFv,相比，单域抗体的相对分子质量更小，更容易穿过靶组织，可以阻断病毒表面的“峡谷”部位，加强对实体瘤的渗透，得到分辨率更高的成像图谱。但由于,VH,单域抗体不含有,VL,片段，,VH,的疏水面暴露较大面积，致使其抗原亲和力大幅度下降，非特异性吸附有所增加，因此将单域抗体作为一种治疗性抗体应用还有许多问题要解决。,（,4,）超变区多肽（,hypervariable region polypeptide,）,抗体结合抗原都要通过,CDR,来实现，因此,CDR,是抗体结合抗原的最小结构单位。,经晶体结构等分析，发现抗体分子中,6,个,CDR,所起的作用是不同的。可以设计出那些在抗原识别及亲和力方面有重要意义的,CDR,多肽，直接用于诊断或治疗，可望获得理想的结果。,这种,只含有一个,CDR,多肽的抗体，就称之为超变区多肽（,hypervariable region peptide,）。,超变区多肽的氨基酸序列与,CDR,区完全一致，大小只有,16-30,个氨基酸，相对分子质量很小，对组织细胞具有极强的穿透性，能达到其他抗体不能到达的部位。所制备的,87,、,92,、,6McAb VH,功能区的,CDR2,多肽，其特异性与亲代抗体相似，能与某些细胞表面的呼肠孤病毒,III,型受体有效结合，使该受体表达下降，并抑制细胞内,DNA,的合成。,超变区多肽可用同位素、荧光素标记或与毒素、药物等结合，用于疾病的诊断及治疗，已经用于临床检测肿瘤。,应该看到，由于只含有一个,CDR,区，它的结合抗原能力是不完全及不稳定的，其亲和力及非特异性吸附都可能明显增加，相对分子质量极小，在体内相当不稳定，可能还没有完全发挥其生物学效应时已被清除。,3.,特殊类型的基因工程抗体,根据构建方式的不同主要分为三种：,双特异性抗体；,免疫黏连素；,催化抗体。,（,1,）双特异性抗体（,Bispecific Ab,，,BsAb,）,天然的抗体分子为双价单特异性，如果对天然的抗体分子进行改造，把其他的效应物质如毒素、酶、细胞因子、受体分子通过一定方法与两种杂交抗体,Fab,片段或,V,区（,VH,与,VL,）连接起来，使之即可与靶细胞结合，又可介导其他一些效应功能，从而最大限度地杀伤靶细胞。这种具有双特异性的抗体分子就称为双特异性抗体或双功能抗体。,BsAb,（双特异性抗体）是基因工程抗体研究的重点，已经构建了大量的,BsAb,，在基础研究、临床诊断、治疗等方面发挥了重要的作用。,抗肿瘤,介导活化的,T,淋巴细胞。,介导巨噬细胞的肿瘤免疫疗法。,除了介导肿瘤细胞与效应细胞的结合外，,BsAb,还可用于向肿瘤细胞输送免疫毒素。,BsAb,还用于介导其他药物的肿瘤杀伤作用,。,抗血栓形成,通过化学交联物制备完整抗纤维蛋白单克隆抗体与抗组织纤维蛋白酶原激活物抗体（抗,tPA,）,BsAb,。在体内、外均能有效地介导纤维蛋白酶原激活物与纤维血栓的结合，通过特异聚集,tPA,于血凝块处，在明显减少,tPA,量的情况下诱发了其强有力的治疗效应，可以对抗血栓形成，同时也避免纤维蛋白原的溶解及出血的副作用。,抗感染作用,BsAb,一样适用于介导病原体的代谢。,BsAb,构建法：,化学交联法：,SPDP,（琥珀酰胺吡啶二硫酚丙酸）随机交联,2,个,Ig,分子表面上的巯基构建出双功能,Ab,。,生物学法（杂种,杂交瘤法）：,分泌,McAb,的杂交瘤,C,分泌另一种,Ab,的脾,C,融合 杂种,-,杂交瘤,C,分泌,杂种,Ab,2,种亲代,Ab,gene,工程法：构建出的小分子双特异性,Ab,（,SCFV,）,2,（双功能,Ab,）将不同,Ab,的,VH,和,VL,区的,gene,用接头（,Linker,）连接，生成原,Ab,的分子内配对（不能形成链内的分子配对）,Bs Ab,（,SCFV,）,2,。,（,2,）免疫粘连素（,Immunoadhesin,）,人细胞受体或粘附分子等基因通过一定的方式与抗体的恒定区,gene,（主要是,Fc,段）的,N,端连接起来，在真核细胞中表达出正确折叠的融合抗体样蛋白质分子，这种分子可同时发挥抗体的效应功能及其他效应功能。与双特异性抗体不同的是，免疫粘连素由于不含有抗体的,Fab,段，但可发挥抗体的特异性效应功能，还含有细胞受体的结合位点，可特异性与受体阳性细胞高亲和结合，发挥新的效应功能。,优点：,亲和力强；,半衰期长；,大大隆低了其工作浓度；,减少非特异副作用及,HAMA,发生率，应用上比亲本单克隆抗体更为安全可靠。,（,3,）催化抗体（,Catalytic Ab or Ab Enzyme,）,抗体能与抗原特异结合，酶也能与其底物特异结合，但这两种结合过程本质不同。天然的抗体不具有酶结合活性，而酶则无抗原结合能力。如果能人工设计一类新型蛋白质，使之同时具有抗原结合的专一性及催化底物的特异性，这种高效的抗体催化剂将可能应用于化学、生物学、临床医学等领域，为生物催化提供新的理论基础,.,根据免疫学及生物化学的基本原理，利用基因工程技术，目前已经成功制备了这类催化抗体或抗体酶。抗体酶的高效催化特性及位点特异性蛋白裂解酶活性为临床疾病治疗提供了新的途径，并非常有可能成为肿瘤导向治疗的新方法。,基因工程催化抗体的构建是通过在轻链,V,区中插入能与金属离子结合的氨基酸序列，再与重链,V,区重组，这种重组抗体的重链,V,区可识别抗原并选择性结合底物，轻链则可通过促进底物反应过渡态的形成而发挥催化作用。,4.,人源性抗体,由于鼠源性抗体治疗应用中存在着程度不一的人抗鼠的,Ab,的,HAMA,反应，由于人,-,人杂交瘤的不稳定等缺点使得通过传统杂交瘤技术分离高亲和力的稳定人抗体克隆变得十分困难。,近年来，创建了噬菌体抗体库技术和基因敲除、置换技术，并利用这两种技术成功地制备了完全人源化的抗体片段及全抗。,（,1,）噬菌体抗体库（,phage Ab Library,）,利用基因工程的方法可将全套人抗体重链和轻链,V,区基因克隆出来，并在噬菌体表面表达、分泌，经筛选后获得特异性抗体，这种技术称为,噬菌体抗体库,（,phage antibody library,），所构建的抗体库称为,全套抗体库,（,repertoire antibody,）,或组合抗体库,（,combinatorial antibody library,）。,基本原理,该技术以噬菌体为载体，将抗体基因（,Fab,或,ScFv,基因等）与噬菌体编码的外壳蛋白,（,CP,）或,（,CP,）相连，在噬菌体表面以抗体,-,外壳蛋白融合蛋白的形式表达。经辅助病毒感染后，借助,CP,的信号肽穿膜作用，进入宿主细胞的外周基质，在正确折叠后被包装于噬菌体尾部，随后携带有表达载体的宿主菌就会释放出带有抗体片段噬菌体颗粒。可以特异识别抗原，又能感染宿主进行再扩增，因此可以采用类似于亲和层折原理从噬菌体抗体库中筛选出特异性抗体。,1990,年,Mullinax,等首次从受破伤风毒素免疫的供者外周血,B,细胞中组建了人抗体库，容量达,107,，筛选出,10,株抗,TT,单抗。这是首例用抗体库技术获得的全人源化抗体，开创了单抗制备的新纪元。,噬菌体抗体库技术与传统的杂交瘤技术相比具有,明显的优越性：,简便易行，节省时间；,筛选的容量大，用杂交瘤技术只能在数月内筛选数千个克隆，而噬菌体抗体库技术则可以数周内筛选出,106-108,个克隆；,抗体库技术直接得到抗体基因，避免了杂交瘤细胞克隆不稳定的缺点；,抗体库抗体可用原核细胞表达，无需组织培养，可大大降低单克隆抗体生产的成本。噬菌体抗体库技术在不久在将来将有可能取代杂交瘤技术。,（,2,）,Xenomouse,（异源性或异基因鼠）产生的人源性抗体,噬菌体抗体库制备的抗体通常为,Fab,片段或,ScFv,抗体，由于没有,Fc,段，亲和力受到极大影响，人们试图通过基因工程的手段来制备人源性抗体全抗。,1997,年,Abgenix,公司在这方面取得了重大突破，研制成功了,Xenomouse,，利用这种小鼠可制备高亲和力的人源性抗体全抗。原理就是：将小鼠的全套抗体基因去除，同时将人的大部分轻链、重链基因插入到小鼠的染色体当中，这样用抗原刺激小鼠时就可以发生人抗体基因的重排，从而产生人源性抗体。,第三节 单克隆抗体（,McAb,）,1986,年许多研究人员和公司花费了巨大的人力、物力和财力进行了治疗性抗体的研制和开发，使治疗性抗体的发展达到高潮。,如今单克隆抗体再次成为生物技术研发的热点课题。记录在案的,Mabs,（双特异鼠,Ab,）至少有,69,种。,大部分的,Mabs,是为治疗癌症而设计的，这些精心研制的抗体可识别出癌症细胞所显示的抗原；,另一部分的,Mabs,是为了治疗多发性硬化、类风湿性关节炎和其他一些疾病而设计的。,另外，甚至完全人源化的,Mabs,也正在开发之中。,称为,17-1A,的,Mab,已在德国获准上市，这是第一种用以治疗癌症的,Mab,。最早获得美国,FDA,批准上市的治疗性单抗是抗,CD3,单抗和,Cpb/a,单抗。,我国自,20,世纪,80,年代开始进行治疗性抗体的研究和开发，经过,10,多年的努力，特别是近,5,年来，治疗性抗体有了重大的进展，到目前为止已有几种治疗性单抗获得国家批准进入临床试验。,马文煜教授及其课题组经过,9,年艰辛探索，在国内外首次将流行性乙型脑炎单克隆抗体用于临床治疗，并成功地建立了猴体乙脑模型及治疗实验，作为国家,I,类新药已通过国家卫生部新药审评，进入了,期临床试验。,细胞工程中心陈志南主任开发的肝癌单克隆抗体导向治疗剂,131I,标记的,Hab18,及,131I,标记的酶解片段,F,（,ab,）,2,作为国家,I,类新药均获得国家批准，进入了,期临床试验。,现将美国正在开发的治疗性抗体列表如下：,名称,属性,研制单位,用途,开发现状,2B1,双特异鼠,Mab,National Cancer Institute,乳腺癌,/,期,4197X-RA,免疫毒素,Houston Biotech,预防继发性白内障,期,AD-439MAb,中和抗体抗,HIV-gp130,蛋白的,V3,环,Tanox Biosystems,HIV,感染，爱滋病,期,AD-439,和,AD-519,组合,全抗,Tanox Biosystems,HIV,感染，爱滋病,期,AD-519Mab,中和抗体抗,HIV-gp210,蛋白的,C4,区,Tanox Biosystems,HIV,感染，爱滋病,期,AL-901,抗人,IgE,Tanox Biosystems,过敏性疾病，包括对过敏性鼻炎和哮喘,期,ALG-991,嵌合,Mab,Allergene,有毒常春藤,临床试验,Herceptin,抗,-HER-2,人源化,Mab,Genetech,乳腺癌,上市,抗,IgE,人源化,Mab,Genetech,哮喘,期,Avicidin,Mab,结合物,NeoRx,各种实体瘤,期,Biostent,NeoRx,消除血管成形术后血管痉挛,期,RB96,阿霉素结合物,Bristol-Myers Squibb,癌症,期,BTI-322,Mab,MedImmune,，,BioTransplant,急性肾排斥，移植物抗宿主病,/,期,C225,抗,EGFR,嵌合,Mab,ImClone System,表皮生长因子受体阳性癌症,期,Centara,嵌合抗,CD4,抗体,Centocor,风湿性关节炎，,T,细胞淋巴瘤,期,Cen TNF,嵌合抗,CD4,抗体,Centocor,风湿性关节炎，炎性肠道疾病,期,CMA-676,Wyeth-Ayerst Lab,复发的急性髓性白血病,期,CMB-401,Wyeth-Ayerst Lab,卵巢癌,期,Corsevin M 12D10-Fab,Fab,抗体,Centocor,，,Corvas,PTCA,的溶血栓并发症，分散血管内凝血,期,E5Mab,Pizer,，,XOMA,革兰氏阴性脓毒症,期,Enlimomab,抗,ICAM-1 Mab,Bochringer Ingelhein,中风,热损伤,/,期,期,Hu23F2G,重组人源化单抗,ICOS,出血性休克,多发性硬化,期,期,人抗乙肝抗体,工程的全,-B,抗体,Protein Design Labs,因慢性乙肝炎感染引起的晚期肾病的肝移植患者和慢性活动期乙型肝炎患者,/,期,IDEC-Y2B8,IDEC,制药公,司,非何杰金氏,B-,细胞淋巴瘤,期,IDEC-InB8,IDEC,制药公司,非何杰金氏,B-,细胞淋巴瘤,期,IDEC-Y2B8,IDEC,制药公司,非何杰金氏,B-,细胞淋巴瘤,期,Immu RAIT-CEAI,I,131,-,完整的,IgG,Immunomedics,结直肠癌,期,I