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第十一章 生物技术实践
第1讲 传统发酵技术及应用
[最新考纲]
运用发酵加工食品的基本方法
考点一 果酒与果醋的制作
1．制作原理
类型
微生物
原理
果酒
酵母菌
①有氧条件下，进行有氧呼吸，大量繁殖②无氧条件下，进行酒精发酵，反应式为C6H12O62C2H5OH＋2CO2
果醋
醋酸菌
①当氧气和糖源都很充足时、可将糖分解为醋酸②当氧气充足时，缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛转变为乙酸
2.果酒、果醋发酵实验流程：
[深度思考]
(1)葡萄汁装入发酵瓶时，要留约1/3空间，目的是什么？
提示：先让酵母菌进行有氧呼吸快速繁殖，耗尽O2后再进行酒精发酵；防止发酵过程中产生的CO2造成发酵液溢出。
(2)为什么果酒、果醋制作要严格控制温度？
提示：严格控制温度：18～25℃有利于酒精发酵，30～35℃有利于醋酸菌的繁殖和醋酸发酵。
(3)发酵装置图分析。
提示：①各部位的作用。
a．充气口：在醋酸发酵时连接充气泵进行充气。
b．排气口：排出酒精发酵时产生的CO2；与排气管相连的长而弯曲的胶管，作用是可有效阻止空气中微生物的进入，避免来自空气的污染。
c．出料口：用来取样。
②该装置的使用方法。
a．使用该装置制作果酒时，应该关闭充气口；
b．制作果醋时，应将充气口连接充气泵，输入空气。
题组一 考点诊断
(1)醋酸菌在无氧条件下利用乙醇产生醋酸。(2014·高考广东卷)( )
(2)酵母菌在无氧条件下利用葡萄汁产生酒精。(2014·高考广东卷)( )
(3)条件适宜时醋酸菌可将葡萄汁中的糖分解成醋酸。(2012·高考江苏卷)( )
(4)在果酒和果醋制作过程中，果酒的制作过程是在缺氧条件下，而果醋整个制作过程一直处于有氧条件下。(2010·江苏卷改编)( )
(5)在家庭中用鲜葡萄制作果酒时，让发酵装置接受光照并放在45℃处。(2010·高考北京卷)( )
(6)在家庭中用鲜葡萄制作果酒时，给发酵装置适时排气。(2010·高考北京卷)( )
答案：(1)(×) (2)(√) (3)(√) (4)(√) (5)(×) (6)(√)
题组二 分析果酒、果醋制作的原理与方法
1．(2016·南京四校联考)下列关于果酒和果醋的制作原理、发酵过程的叙述中，错误的是( )
A．果酒和果醋的发酵菌种不同，但代谢类型相同
B．制作果酒和果醋时都应用体积分数为70%的酒精对发酵瓶消毒
C．在变酸果酒表面所观察到的菌膜可能是醋酸菌的菌落
D．果酒和果醋的制作可用同一装置，但需控制不同发酵条件
解析：选A。用于果酒发酵的菌种是酵母菌，其代谢类型是异养兼性厌氧型；用于果醋发酵的菌种是醋酸菌，其代谢类型是异养需氧型，两者的代谢类型不同。
2．某同学设计了如图所示的发酵装置，请据图回答问题：
(1)若该装置用于果酒发酵，则该装置弯管中加入适量水的目的是_______________________________________________。
(2)若该装置用于果酒发酵，在弯管中的水中滴加适量的酚酞试剂和NaOH试剂，则随着果酒发酵的进行，弯管内的水发生的变化是______________，试分析原因
_______________________________________________
_______________________________________________。
(3)若用该装置进行果醋发酵，则必须对该装置进行的改造是
____________________________________。
(4)去除弯管中的水后，该装置也能用于果酒发酵，弯管的作用是_______________________________________________。
答案：(1)既能阻止空气进入，又能释放果酒发酵产生的CO2
(2)红色逐渐变浅，甚至消失 酚酞遇碱变红色，果酒发酵产生的CO2与NaOH反应，使pH降低，红色变浅
(3)增加通气管(意思对即可)
(4)防止杂菌进入
氧气供应状况对酒精发酵结果影响的分析方法
1．酒精发酵所需的氧气供应条件。
(1)发酵前期：需要通入空气或在发酵瓶中留有一定的空间，可以给酵母菌提供氧气以利于酵母菌通过有氧呼吸大量增殖。
(2)发酵后期：要通过密封严格控制无氧环境，以利于酵母菌通过无氧呼吸产生酒精。
2．酒精发酵异常的情况。
(1)酒精发酵的前期如果供氧不足，酵母菌数量少，产生的酒精少。
(2)酒精发酵后期如果密封不严，则酵母菌数量充足，但是不能产生酒精。
考点二 腐乳与泡菜的制作
1．腐乳的制作
(1)原理
①菌种：主要是毛霉。
②作用特点：
蛋白质分子肽和氨基酸
脂肪甘油和脂肪酸
(2)制作流程
→
→
→
(3)影响条件
①卤汤配制：卤汤是由酒及各种香辛料配制而成的。加酒既能抑制微生物的生长，又能使腐乳具有独特的香味。香辛料不但能调制腐乳的风味，还具有防腐杀菌作用。
②材料用量：
a．控制盐的用量：盐的浓度过低，不足以抑制微生物生长，可能导致豆腐腐败变质；盐的浓度过高，会影响腐乳的品味。
b．酒的含量一般控制在12%左右。
2．泡菜制作
(1)制作原理：在无氧条件下，乳酸菌将葡萄糖分解成乳酸。
(2)制作流程：
(3)影响因素：
①泡菜坛的选择：应选用火候好、无裂纹、无砂眼、坛沿深、盖子吻合好的泡菜坛。
②控制腌制时间、温度和食盐的用量。
③防止杂菌污染，严格密封。
[深度思考]
(1)腐乳制作过程中对前期和后期发酵条件的控制有什么不同？
提示：①前期发酵条件的控制：提供有利于毛霉生长的温度、水分，形成毛霉的生长优势，抑制杂菌的生长。
②后期发酵条件的控制。
a．加盐腌制，利用食盐抑制杂菌生长。
b．加卤汤装瓶：利用卤汤中的酒和香辛料抑制杂菌的生长。
③密封腌制：控制无氧环境，抑制好氧菌的生长。
(2)泡菜制作过程中加入食盐的作用是什么？
提示：一是防腐，二是使蔬菜组织中水分析出，使成品质地柔韧、咀嚼感强。
(3)在泡菜制作过程中为什么盐的用量、温度和时间要适宜？
提示：①盐的用量宜控制在10%～15%，盐浓度过高，乳酸发酵受抑制，泡菜会咸而不酸；盐浓度过低，杂菌易繁殖，引起变质。
②控制适宜的温度：以18～20℃为宜，温度偏高有害菌活动能力强，温度偏低不利于乳酸发酵。
③时间短，亚硝酸盐含量高，时间长，亚硝酸盐含量低，但是发酵时间过长会产生其他有害物质。
题组一 考点诊断
(1)腐乳制作利用了毛霉等微生物的蛋白酶和脂肪酶。(2014·高考广东卷)( )
(2)将长满毛霉的豆腐装瓶腌制时，底层和近瓶口处需加大用盐量。( )
(3)在腐乳制作过程中加入香辛料既能调节风味，还具有防腐杀菌作用。( )
(4)在腐乳制作过程中，盐的用量要适宜，酒的含量一般控制在12%左右。( )
(5)制备泡菜时，盐水煮沸后可以立即使用。( )
(6)泡菜坛的选择、发酵过程中坛沿要注满水都有利于泡菜的无氧发酵。( )
(7)泡菜的制作前期需要通入氧气，后期应严格保持无氧条件。( )
答案：(1)(√) (2)(×) (3)(√) (4)(√) (5)(×) (6)(√) (7)(×)
题组二 腐乳、泡菜制作的原理、制作过程分析
1．泡菜发酵的微生物主要是乳酸菌，而在发酵初期，水槽内经常有气泡产生，这些气泡产生的原因及成分分别是( )
A．乳酸菌是兼性厌氧型微生物，初期进行有氧呼吸产生CO2；气体为CO2
B．因腌制过程中的盐进入蔬菜使蔬菜体积缩小，气体被排出；气体为空气
C．发酵初期活动强烈的是酵母菌，其利用氧产生CO2；气体为CO2
D．乳酸菌在发酵过程中产生了热量，使坛内温度升高，空气受热膨胀排出；气体为空气
解析：选C。蔬菜刚入坛时，表面带入的微生物主要是乳酸菌、不抗酸的大肠杆菌和酵母菌等微生物，较为活跃，它们进行乳酸发酵和微弱的酒精发酵产生较多的乳酸、酒精、醋酸和二氧化碳等，二氧化碳以气泡的形式从水槽内放出，逐渐使坛内形成无氧环境。
2．某人利用乳酸菌制作泡菜时因操作不当而使泡菜腐烂。造成泡菜腐烂的原因是( )
①罐口密闭缺氧，抑制了乳酸菌的生长繁殖 ②罐口封闭不严，氧气抑制了乳酸菌的生长繁殖 ③罐口封闭不严，氧气抑制了其他腐生菌的生长和繁殖 ④罐口封闭不严，促进了需氧腐生菌的生长和繁殖
A．①③ B．②④
C．②③ D．①④
解析：选B。乳酸菌为厌氧细菌，在无氧的情况下将葡萄糖分解成乳酸。制作泡菜时，如果罐口封闭不严，氧气进入罐内，会抑制乳酸菌的乳酸发酵；同时进入的氧气促进了罐内需氧腐生菌的生长和繁殖，从而造成泡菜腐烂。
3．(2016·济南模拟)腐乳是我国古代劳动人民创造出的一种经过微生物发酵的大豆食品，如臭豆腐、酱豆腐等，该食品味道鲜美，易于消化吸收，而腐乳本身又便于保存，所以深受人们的喜欢。如图是腐乳制作的流程示意图，根据流程回答问题：
―→―→―→
(1)流程图中未写出的程序是________。
(2)含水量为________左右的豆腐适合用来做腐乳。
(3)传统制作腐乳，豆腐块上的毛霉来自______________________，现代腐乳生产是在严格________的条件下，将优良的毛霉菌种直接接种在豆腐上。
(4)影响腐乳的风味和质量的因素是__________________________________(至少列举两项)。
解析：(1)腐乳制作的一般流程：①让豆腐上长出毛霉，②加盐腌制，③加卤汤装瓶，④密封腌制。(2)含水量为70%左右的豆腐适合用来做腐乳，水分过多则腐乳不易成形。(3)传统制作腐乳，豆腐块上的毛霉来自空气中的毛霉孢子，现代腐乳生产是在严格无菌的条件下，将优良的毛霉菌种直接接种在豆腐上。(4)影响腐乳的风味和质量的因素有盐的用量、酒的用量、发酵温度、发酵时间等；后期发酵主要是酶与微生物协同参与生化反应的过程，因此发酵温度也影响发酵的过程。
答案：(1)加卤汤装瓶 (2)70%
(3)空气中的毛霉孢子 无菌
(4)盐的用量、酒的用量、发酵温度、发酵时间等(答出两个即可)
正确理解泡菜发酵的过程
1．发酵过程不是乳酸菌单独发酵的结果。
(1)发酵初期；多种微生物进行有氧呼吸的过程，如酵母菌等，此过程会产生气泡。此阶段是形成无氧环境的过程。
(2)发酵中期；主要是乳酸菌发酵的过程，其他微生物的生长受到抑制。
(3)发酵后期：乳酸积累，乳酸菌的生长也受抑制，数量减少。
2．泡菜发酵时间不是越长越好。
1．(2010·高考海南卷)葡萄发酵可以产生葡萄酒，请利用相关的知识回答问题：
(1)利用葡萄制作葡萄酒的过程，发挥作用的微生物是________。
(2)该微生物通过无氧呼吸可分解________，产生的终产物是________和________。
(3)甲、乙、丙三位同学将葡萄榨成汁后分别装入相应的发酵瓶中，在温度等适宜的条件下进行发酵，如图所示。发酵过程中，每隔一段时间均需排气一次。
据图分析，甲同学和丙同学的操作有误，其中甲同学的错误是_______________________________________________，
导致发酵中出现的主要异常现象是________________________，丙同学的错误是______________________________，导致发酵中出现的主要异常现象是______________________。上述发酵过程结束后，甲、乙、丙同学实际得到的发酵产品依次是________、________、________。
(4)在上述制作葡萄酒的过程中，假设乙同学的某一步骤操作错误导致发酵瓶瓶塞被冲开，该操作的错误是
_______________________________________________
_______________________________________________。
答案：(1)酵母菌 (2)葡萄糖 乙醇 CO2 (3)未夹住发酵瓶的充气管 发酵液从充气管流出，发酵液变酸 瓶中发酵液过多，淹没了排气管在瓶内的管口 排气时发酵液从排气管流出 葡萄醋或果醋 葡萄酒或果醋 葡萄酒或果醋 (4)未及时排气
2．(2012·高考海南卷)回答下列关于腐乳制作的问题：
(1)腐乳是豆腐经微生物发酵后制成的食品。多种微生物参与了该发酵过程，其中起主要作用的微生物是________，其产生的蛋白酶可将豆腐中的蛋白质水解为________和________；其产生的________能将豆腐中的脂肪水解为________和________。
(2)发酵完成后需加盐腌制，加盐还可以抑制________生长。
(3)腐乳制作的后期可加入由酒和多种香辛料配制而成的卤汤。卤汤除具有一定的防腐作用外，还能使腐乳具有独特的________。
解析：本题考查腐乳制作过程的相关知识。(1)腐乳制作时是以豆腐为原料，在毛霉以及多种微生物参与下发酵而制成的食品，富含易被人体吸收的多种营养物质，如多肽、氨基酸等。(2)在发酵完成后的腌制过程中，加盐能抑制微生物的生长，防止豆腐块腐败变质。(3)卤汤除能防腐外，还可使腐乳具有独特的风味。
答案：(1)毛霉 肽 氨基酸 脂肪酶 甘油 脂肪酸
(2)微生物
(3)风味
3．(2013·高考新课标全国Ⅰ卷)回答下列有关泡菜制作的问题：
(1)制作泡菜时，所用盐水需煮沸，其目的是__________。为了缩短制作时间，有人还会在冷却后的盐水中加入少量陈泡菜液，加入陈泡菜液的作用是__________。
(2)泡菜制作过程中，乳酸发酵的过程即为乳酸菌进行__________的过程。该过程发生在乳酸菌细胞的__________中。
(3)泡菜制作过程中影响亚硝酸盐含量的因素有__________、__________和__________等。
(4)从开始制作到泡菜品质最佳这段时间内，泡菜液逐渐变酸。这段时间内泡菜坛中乳酸菌和其他杂菌的消长规律是__________，原因是____________________。
解析：(1)盐水中可能含有杂菌，制作泡菜时，所用盐水需要煮沸，以便杀死盐水中的杂菌。陈泡菜中含有现成的乳酸菌，加入后，可以缩短制作时间。(2)乳酸发酵的过程即为乳酸菌进行无氧呼吸的过程，无氧呼吸的场所是细胞质基质。(4)从开始制作到泡菜品质最佳这段时间内，随着泡菜坛中乳酸菌数量逐渐增加，泡菜液逐渐变酸，抑制了其他杂菌的生长，导致其他杂菌数量逐渐减少；原因是酸性条件下，不利于杂菌生存，增加乳酸菌的数量。
答案：(1)消灭杂菌 增加乳酸菌含量 (2)无氧呼吸 细胞质基质 (3)温度 食盐用量 腌制时间 (4)乳酸菌数量增加，杂菌数量较少 乳酸菌比杂菌更为耐酸
课时规范训练(单独成册)
1．(2016·河北唐山一中)根据相关知识，回答关于果酒、果醋和腐乳制作的相关问题。
(1)当________________时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸。
(2)在________条件下，重铬酸钾与酒精发生反应呈现________色。
(3)下图为腐乳制作的实验流程示意图，据图．回答下列问题。
⇨⇨⇨
①图中A代表________，其主要目的是________，同时还能_______________________________________________；
②在配制卤汤中酒的含量一般控制在________左右，酒精含量过高腐乳成熟时间将会________；酒精含量过低，________，可能导致豆腐腐败。
解析：在氧气、糖源都充足的条件下，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸。在酸性条件下，重铬酸钾与酒精发生反应呈现灰绿色；在腐乳制作过程中，在豆腐上长出毛霉后需加盐腌制，盐的作用是析出豆腐中的水分，使豆腐块变硬，还能抑制微生物的生长，避免豆腐块腐败变质。卤汤中加酒需适量，酒精含量过高使腐乳成熟时间延长，酒精含量低，不足以抑制微生物的生长。
答案：(1)氧气、糖源都充足
(2)酸性 灰绿
(3)①加盐腌制 析出豆腐中的水分，使豆腐块变硬 抑制微生物的生长，避免豆腐块腐败变质
②12% 延长 不足以抑制微生物的生长
2．(2016·河北石家庄模拟)从古至今，酒就与人类生活息息相关。请回答与酿酒有关的问题：
(1)人类使用酿制葡萄酒的微生物主要是酵母菌，酵母菌酒精发酵的反应式是________________________；进行酒精发酵一般将温度控制在__________。
(2)葡萄酒呈现深红色的原因是__________________。
(3)现在工厂化生产果酒，为提高果酒的品质，更好地抑制其他微生物的生长，采取的措施是__________________________，并接入合适的菌种。
(4)某同学人工自酿葡萄酒时，在发酵后期向发酵液中通入空气，并将发酵液置于30～35 ℃环境中，结果发现发酵液中有__________出现，这类微生物在糖类缺乏时可以使________转化为__________，后者再转化为__________。
解析：(1)酿制葡萄酒使用的微生物主要是酵母菌，酵母菌酒精发酵的最适温度是18～25 ℃。(2)红葡萄皮的色素进入发酵液，故葡萄酒呈现深红色。(3)为提高果酒的品质，更好地抑制其他微生物的生长，需对原料和设备进行消毒和灭菌后，再接入菌种。(4)酿制葡萄酒时，若在发酵后期向发酵液中通入空气，并将发酵液置于30～35 ℃环境中，在糖类缺乏时，醋酸菌可把乙醇转化为乙醛，再转化为醋酸。
答案：(1)C6H12O62C2H5OH＋2CO2＋能量 18～25 ℃
(2)红葡萄皮的色素进入发酵液
(3)对原料和设备进行消毒和灭菌
(4)醋酸菌 乙醇 乙醛 醋酸
3．(2016·衡阳模拟)果醋有消除疲劳和减肥等功效，该饮料深受广大女士的喜爱。某果酒厂的果酒滞销，计划将生产的部分果酒“转变”为果醋。研究人员设置了如下图所示的装置：
(1)果酒和果醋的制作分别利用了________________(填微生物名称)。果酒制作时温度应控制在________，果醋制作时温度应控制在________。
(2)由果酒制作过程转变成果醋的制作过程需要改变的环境条件是_______________________________________________。
(3)乙装置瓶为发酵瓶，你认为甲、丙两个装置瓶中，盛有果酒和果醋的装置瓶分别是________。在装置瓶乙中，发酵菌先将乙醇变为________，最后变为醋酸。
(4)可以用________________来检验生产出的果醋中是否含有酒精。在________条件下，该物质与酒精反应使溶液呈________色。
解析：(1)果酒、果醋的制作菌种分别是酵母菌和醋酸菌，二者的最适生长温度不同，果酒制作的最适温度为18～25℃，果醋制作的最适温度为30～35℃。(2)果酒发酵主要为无氧发酵的过程，而果醋发酵为有氧发酵的过程，二者的发酵温度也不同，因此由果酒制作过程转变成果醋的制作过程需要改变发酵温度和气体条件(氧气)。(3)由图可知，甲装置瓶内应为果酒，丙装置瓶内应为果醋，由果酒到果醋的发酵过程是醋酸菌先将乙醇变为乙醛，最后变为醋酸。(4)检测酒精的试剂是重铬酸钾溶液，条件是酸性条件，现象是溶液呈灰绿色。
答案：(1)酵母菌和醋酸菌 18～25℃ 30～35℃
(2)温度和氧气 (3)甲、丙 乙醛
(4)重铬酸钾 酸性 灰绿
4．腐乳又称豆腐乳，是我国著名的民族特产发酵食品之一。其滋味鲜美，酱香宜人，制作历史悠久，品种多样，主要有红方腐乳、酱腐乳和白腐乳等，而红曲酱腐乳既具有红方腐乳适宜的天然红曲色泽，又具有酱腐乳特有的浓郁的酱香味，深受人们的喜爱，具有广阔的市场前景。某兴趣小组按照以下工艺流程制作红曲酱腐乳。请据图回答：
毛霉→孢子悬浮液 红曲酱卤
豆腐→切块→接菌→搓毛→腌坯→装坛→兑汤→发酵
成品
(1)传统的制作过程中，豆腐块上生长的毛霉来自
____________________________。
(2)搓毛是指用手抹长满菌丝的白坯，让菌丝裹住坯体，其目的是________。
(3)在逐层加盐腌坯的过程中，随层数的加高而________盐量，接近瓶口处要________铺一些。
(4)红曲酱卤是红曲、面酱、黄酒按一定的比例配制而成的，加入黄酒的作用是
_______________________________________________。
答案：(1)空气中的毛霉孢子
(2)防止腐乳烂块 (3)增加 多
(4)可以抑制微生物的生长，能使腐乳具有独特的香味
5．家庭中泡菜的制作方法是：新鲜的蔬菜经过整理、清洁后，放入彻底清洗并用白酒擦拭过的泡菜坛中，然后向坛中加入盐水、香辛料及一些“陈泡菜水”，密封后置于温度适宜的地方。有时制作的泡菜会“咸而不酸”或“酸而不咸”，前者是用盐过多，后者是用盐过少。
(1)用白酒擦拭泡菜坛的目的是__________。密封泡菜坛的原因是：
①_______________________________________________；
②_______________________________________________。
(2)若制作的泡菜“咸而不酸”，最可能的原因是
________________________________。
(3)加入“陈泡菜水”的作用是________________。
(4)制作泡菜的过程中，有机物的干重将__________，菜坛内有机物的种类将__________。
(5)乳酸菌与酿制果醋的菌种在代谢方式上的主要区别是____________________________。
(6)有位同学在家制作泡菜时，为避免杂菌污染而向泡菜坛中加入了青霉素，结果发酵失败，原因可能是____________________________。
(7)若要获得大量乳酸菌菌种，应选用培养基培养，培养基中应有__________、__________、__________和__________等营养物质。
解析：理解泡菜的制作过程和原理是解题关键。(1)用白酒擦拭泡菜坛的目的是消毒。乳酸菌是厌氧生物，泡菜坛密封后造成缺氧环境，同时密封可以防止杂菌进入。(2)制作泡菜时，若放入的食盐过多，会抑制乳酸菌发酵造成泡菜“咸而不酸”。(3)“陈泡菜水”中含有大量的乳酸菌菌种，制作泡菜时加入“陈泡菜水”可以实现接种乳酸菌菌种的目的。(4)制作泡菜的过程中，由于乳酸菌呼吸作用的消耗，有机物的干重将减少，但坛内有机物的种类将增加。(5)乳酸菌是厌氧细菌，醋酸菌是好氧细菌。(6)青霉素可以杀死乳酸菌，故制作泡菜时加入青霉素会造成发酵失败。(7)若要获得大量乳酸菌菌种，应选用培养基培养，培养基中应有碳源、氮源、水和无机盐等营养物质。
答案：(1)消毒 ①乳酸菌是厌氧生物，密封后造成缺氧环境 ②防止杂菌进入
(2)大量的食盐抑制了乳酸菌发酵(大量的食盐杀死了乳酸菌)
(3)提供乳酸菌菌种(接种)
(4)减少 增加
(5)乳酸菌是厌氧细菌，醋酸菌是好氧细菌
(6)青霉素杀死了乳酸菌
(7)碳源 氮源 水 无机盐
6．(2016·永州模拟)传统发酵技术包括果酒、果醋、腐乳、泡菜的制作等，丰富了餐饮生活，根据下列要求回答问题：
(1)传统发酵技术都利用了微生物发酵，果醋和腐乳制作过程相比较，起主要作用的微生物在结构上最大的区别是前者__________________。若把它们的制作过程看作是微生物的培养过程，则从物理性质看，制作腐乳的培养基属于________。
(2)在制作果酒实验中，某同学为研究发酵罐中酵母菌的生长状况，要取样统计分析，并测定pH。判断取样先后顺序的主要依据是_______________________________________________。
(3)果酒制果醋的反应式为：
_______________________________________________。
(4)制作泡菜时，若菜坛有裂缝，即使其他操作正确规范，实验也会失败。说明了乳酸菌是
_______________________________________________。
(5)传统发酵技术中，都没有接种菌种，也没有严格的灭菌，但都可以得到相应的发酵产物。其菌种来源于________；传统酿酒技术中无氧环境的形成是通过酵母菌有氧呼吸消耗氧气来实现的。
解析：(1)果醋发酵的菌种为醋酸菌，属于原核生物，无以核膜为界限的细胞核。腐乳制作的菌种主要是毛霉，属于真核生物，有以核膜为界限的细胞核。制作腐乳的过程中，微生物在豆腐块上生长，因此其培养基属于固体培养基。(2)在制作果酒时，发酵液的pH越来越小，因此可以根据发酵液的pH变化判断发酵的过程。(3)在利用果酒制作果醋时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸，其反应式为：C2H5OH＋O2→CH3COOH＋H2O。(4)制作泡菜时，若菜坛有裂缝，无法形成无氧环境，即使其他操作正确规范，实验也会失败，说明了乳酸菌不能在有氧条件下生活，即说明乳酸菌属于厌氧生物。(5)在果酒、果醋、腐乳、泡菜的制作中，制作果酒、泡菜的菌种主要来自原材料上的现成的微生物，而制作果醋、腐乳的菌种则主要来自空气。
答案：(1)无成形细胞核 固体培养基
(2)pH的大小，pH越小取样越晚
(3)C2H5OH＋O2酶,CH3COOH＋H2O＋能量
(4)厌氧生物
(5)空气中或原材料上的现成的微生物
第2讲 微生物的培养与应用
[最新考纲]
1．微生物的分离和培养 2.某种微生物数量的测定 3.培养基对微生物的选择作用
考点一 微生物的分离与培养
1．培养基
(1)概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养物质。
(2)
(3)分类
2．无菌技术
3．制备牛肉膏蛋白胨固体培养基
计算→称量→溶化→灭菌→倒平板
4．纯化大肠杆菌
(1)上图A可表示用平板划线法接种获得的平板，菌体的分离是通过连续划线操作实现的。
(2)上图B可表示用稀释涂布平板法接种获得的平板，菌体的分散是通过一系列的梯度稀释操作实现的。
5．菌种的保存方法
(1)对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法。
(2)对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。
[深度思考]
(1)说出纯化大肠杆菌的原理。
提示：在培养基上将细菌稀释或分散成单个细胞，使其长成单个的菌落，这个菌落就是纯化的细菌菌落。
(2)通过下表比较平板划线法和稀释涂布平板法。
提示：
比较项目
平板划线法
稀释涂布平板法
关键操作
接种环在固体平板培养基表面连续划线
①一系列的梯度稀释②涂布平板法操作
注意事项
每次划线先后均需灼烧接种环
稀释度要足够高，为确保实验成功可以增加稀释度的范围
菌体获取
在具有显著的菌落特征的区域菌落中挑取菌体
从适宜的稀释度的平板上的菌落中挑取菌体
优点
可以根据菌落的特点获得某种微生物的单细胞菌落
既可以获得单细胞菌落，又能对微生物计数
缺点
不能对微生物计数
操作复杂，需要涂布多个平板
(3)说出平板划线法纯化大肠杆菌时不同阶段灼烧接种环的目的。
提示：①第一次操作：杀死接种环上原有的微生物。
②每次划线之前：杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端。
③划线结束后：杀死接种环上残存的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
题组一 考点诊断
(1)培养基分装到培养皿后进行灭菌。(2013·高考江苏卷)( )
(2)转换划线角度后需灼烧接种环再进行划线。(2013·高考江苏卷)( )
(3)接种后的培养皿须放在光照培养箱中培养。(2013·高考江苏卷)( )
(4)培养过程中每隔一周观察一次。(2013·高考江苏卷)( )
(5)在琼脂固体培养基上长出的单个菌落含有多种细菌。(2011·高考重庆卷)( )
(6)在培养基中加入青霉素可抑制真菌而促进细菌生长，向液体培养基中通入氧气能促进破伤风杆菌的生长。(2011·高考重庆卷)( )
(7)对新配制的培养基灭菌时所用的设备是高压蒸汽灭菌锅。实验前需对超净工作台进行消毒处理。(2010·高考山东卷)( )
(8)用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板。(2009·高考安徽卷)( )
答案：(1)(×) (2)(√) (3)(×) (4)(×) (5)(×) (6)(×) (7)(√) (8)(√)
题组二 微生物的培养与分离技术
1．下图中甲是涂布平板法中的部分操作，乙是平板划线法的操作结果。
下列叙述中错误的是( )
A．甲中涂布前要将涂布器灼烧，冷却后才能取菌液
B．对于浓度较高的菌液，如甲中的稀释倍数仅为102，则所得的菌落不是由单一的细胞或孢子繁殖而成
C．乙中培养皿中所得的菌落都符合要求
D．乙中的连续划线的起点是上一次划线的末端
解析：选C。灼烧后的涂布器如果没有冷却就接触菌种，会将菌体杀死，A正确。稀释倍数过低会导致多个菌体聚集在一起繁殖成菌落，B正确。平板划线法中最后一次划线的末端处形成的菌落才是由单一的细胞或孢子繁殖而成，这种菌落才符合要求，C错误。连续划线中，除了第一次划线外，每一次划线的起点是上一次划线的末端，目的是使得菌体密度越来越小，保证最后划线末端处的菌落是由单一的细胞或孢子繁殖而成。
2．(2014·高考四川卷)有机农药苯磺隆是一种除草剂，长期使用会污染环境。研究发现，苯磺隆能被土壤中某些微生物降解。分离降解苯磺隆的菌株和探索其降解机制的实验过程如图甲、乙所示。
(1)微生物生长繁殖所需的主要营养物质有碳源、水、________四类，该实验所用的选择培养基只能以苯磺隆作为唯一碳源，其原因是_______________________________________________
_______________________________________________。
(2)与微生物培养基相比，植物组织培养的培养基常需添加生长素和________，这些植物激素一般需要事先单独配制成________保存备用。
(3)纯化菌株时，通常使用的划线工具是________。划线的某个平板培养后，第一划线区域的划线上都不间断地长满了菌，第二划线区域所划的第一条线上无菌落。其他划线上有菌落。造成划线无菌落可能的操作失误有
_______________________________________________
_______________________________________________。
(4)为探究苯磺隆的降解机制，将该菌种的培养液过滤离心，取上清液做图乙所示实验。该实验的假设是________________，该实验设计是否合理？为什么？
_______________________________________________。
解析：(1)微生物生长繁殖所需的主要营养物质包括水、碳源、氮源和无机盐；在培养基中加入苯磺隆作为唯一碳源，可将只能利用此碳源的菌种筛选出来。(2)植物组织培养基与微生物培养基相比，常常需要添加植物激素，包括生长素和细胞分裂素；这些植物激素事先按一定的质量浓度单独配成母液保存备用。(3)纯化菌株时，通常用接种环进行划线操作；第二区域划第一条线时，接种环灼烧后未冷却，致使所划第一条线上无菌落。若第二次划线未从第一区域末端开始，则也会导致第二划线区域第一条线上无菌落。(4)由图乙可知本实验的目的是探究能降解苯磺隆的物质是否是该菌种所产生的蛋白质。为使实验设计更合理还需再设置一个对照组，将蛋白酶溶液改为等量的蒸馏水，其余设置不变。
答案：(1)氮源和无机盐 只有能利用苯磺隆的微生物能正常生长繁殖
(2)细胞分裂素 母液
(3)接种环 ①接种环灼烧后未冷却；②划线未从第一区域末端开始
(4)目的菌株能分泌降解苯磺隆的蛋白质 不合理，缺少空白对照
微生物纯化的三种途径
1．单菌落挑取法：利用平板划线法或稀释涂布平板法接种到固体平板培养基表面，直接根据微生物菌落的特征利用单菌落挑取的方法获得目的微生物。
2．选择培养法：利用选择培养基对微生物进行选择培养，直接获得目的微生物。
3．鉴定培养法：利用鉴别培养基使目的微生物菌落呈现特有的特征，然后筛选目的微生物。
考点二 微生物的筛选与计数
1．土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
(1)分离原理
土壤中细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起到催化作用。
(2)统计菌落数目
统计样品中的活菌一般用稀释涂布平板法。
(3)实验流程
土壤取样→样品的稀释→微生物的培养与观察→细菌的计数。
2．分解纤维素的微生物的分离
(1)纤维素酶
①组成：纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。
②作用：
纤维素纤维二糖葡萄糖
(2)纤维素分解菌的筛选
①原理：
纤维素分解菌
↓
红色复合物红色消失，出现透明圈
②筛选方法：刚果红染色法，即通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。
③培养基：以纤维素为唯一碳源的选择培养基。
④实验流程：
土壤取样：富含纤维素的环境
↓
选择培养：用选择培养基培养，以增加纤维素分解菌的浓度
↓
梯度稀释：制备系列稀释液
↓
涂布平板：将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上
↓
挑选产生透明圈的菌落
[深度思考]
(1)筛选微生物的两个实例比较。
提示：
比较项目
土壤中分解尿素的细菌的分离
分解纤维素的微生物的分离
方法
利用以尿素为唯一氮源的选择培养基进行选择培养
利用富含纤维素的选择培养基进行选择培养
原理
只有分解尿素的细菌能够合成脲酶，才能在以尿素为唯一氮源的培养基上生长
因为培养基中含有丰富的纤维素，因此能够分解纤维素的微生物具有更多的生存机会而大量繁殖
鉴定
在培养基中加入酚红指示剂，指示剂变红说明菌落中的菌体为分解尿素的细菌
刚果红染色法，菌落周围出现不变红的透明圈的菌落为分解纤维素的微生物的菌落
(2)两种计数方法的比较。
提示：
比较
项目
间接计数法(稀释涂布平板法)
直接计数法(显微计数法)
原理
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌
利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量
公式
每克样品中的菌落数：(C÷V)×M C：某稀释度下平板上生长的平均菌落数；V：涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)；M：稀释倍数
每毫升原液所含细菌数：每小格平均细菌数×400×10 000×稀释倍数
缺点
当两个或多个菌体连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
不能区分细胞死活
结果
比实际值偏小
比实际值偏大
题组一 考点诊断
(1)筛
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