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药学分子生物学重点
绪论
分子生物学(molecular biology）:是在分子水平研究生命现象的科学，是现代生命科学的共同语言。核心内容是通过生物的物质基础——核酸、蛋白质、酶等生物大分子的结构、功能及其相互作用等运动规律的研究来阐明生命分子基础，从而探讨生命的奥秘。
药学分子生物学(pharmaceutical molecular biology)：由于分子生物学的新理论、新技术渗入到药学研究领域，从而使药物学研究以化学、药学的培养模式转化为以生命科学、药学和化学相结合的新药模式。
分子生物学的主要研究对象：核酸、蛋白质、酶等生物大分子的结构、功能及相互作用
分子生物学在医药工业中的应用：
1、DNA重组技术与新药研究
2、药物基因组学、药物蛋白质组学与现代药物研究
3、药物蛋白质组学是基因、蛋白质、疾病三者相连的桥
梁科学
第一章 核酸的分子结构、性质和功能
核酸的基本结构（重点掌握）： 磷酸
核苷 碱基
戊糖
引起DNA构象改变的因素：
核苷酸顺序、碱基组成、盐的种类、相对湿度。
DNA双螺旋结构 有利 氢键 不利 疏水力
稳定性的影响： 碱基堆积力 静电斥力
mRNA: 遗传信息
真核生物的mRNA结构:
5'帽子 —5’非编码区— 编码区— 3’非编码区—3’polyA
原核生物的mRNA结构：
5'非编码区— 调控序列—编码区—终止子 —起始调控序列—编
码区—终止区—3’非编码区

tRNA的二级结构：三叶草形
三级结构：倒L形
功能： 接受氨基酸、携带氨基酸，把氨基酸转运到核糖体上，然后按照mRNA上的密码顺序装配成多肽或蛋白质。

rRNA：组成核蛋白体

核酸分子杂交的原理：复性（变性的DNA重新恢复成双链的过程称为复性也叫做退火。）
反义RNA的作用机制（掌握）：
Ⅰ类反义RNA:直接作用于靶mRNA的S D序列和(或)部分编
码区，直接抑制翻译，或与靶mRNA结合形成双
链RNA，从而易被RNA酶Ⅲ 降解；
Ⅱ类反义RNA：与mRNA的非编码区结合，引起mRNA构象变
化，抑制翻译；
Ⅲ类反义RNA：则直接抑制靶mRNA的转录。
双链RNA诱导诱导RNAi的过程主要分为两个阶段（重点掌握）：
Ⅰ启动阶段 Ⅱ执行阶段
启动阶段：当细胞中由于感染等原因出现双链RNA分子时，
细胞中一种称为Dicer的核酸酶就会识别这些双
链RNA，并将其降解成21-23bp长的小干扰RNA
（siRNA），单链siRNA与一些蛋白形成复合体，
构成“RNA诱导的沉默小体”（RISC）
执行阶段：当目标mRNA与RISC中的siRNA完全配对时，
RISC就会切割目标RNA，并由细胞中的核酸酶将
其进一步降解，从而抑制目标基因的表达
病毒核酸的特点（了解）：
（1）病毒只含一种核酸，构成病毒体的心髓。
（2）核酸类型多态化
（3）分子量小，基因组结构简单，所含基因组数目少
（4）病毒基因组核酸复制多样化
（5）病毒核酸更易受宿主细胞的影响而发生基因突变和重组
（6）有些病毒去除囊膜和衣壳，裸露的DNA或RNA也能感染细胞， 这
样的核酸成为传染性核酸

第二章 染色质、染色体、基因和基因组

染色质和染色体的化学成分和组成：
DNA:脱氧核糖、磷酸、碱基
组蛋白：碱性氨基酸，带正电，如精氨酸、赖氨酸。
非组蛋白：酸性氨基酸，带负电，如天冬氨酸、谷氨酸。
少量RNA
酶
DNA和组蛋白的含量比较恒定，非组蛋白的含量变化较大，RNA的含量最少。

基因的定义：
基因的生物学定义:是携带生物遗传信息的结构单位，又是控制
一个特定性状的功能单位。
基因的分子生物学定义：指DNA分子中能编码一条多肽链，并且
具有一定长度的片段。严格地说，基因不仅
包含编码蛋白质肽链或RNA的核酸序列，还
包括为保证转录所必须的调控序列。

基因组(genome)：是细胞中一套完整单体遗传物质的总和。
基因组结构的异同：
原核生物
真核生物
基因组很小
基因组庞大复杂，含多种序列成分
几乎无蛋白质和核酸结合
和蛋白质结合形成染色体
有操纵子结构
基因家族化，有重复序列
基因多连续，有重叠基因
（真核细胞病毒除外）
基因不连续
多顺反子
单顺反子
以单拷贝和多拷贝两种形式存在
以单拷贝和多拷贝两种形式存在

第三章、可移动的遗传因子（转座子)和染色体外的遗传因子
转座子(transposon)：原核生物和真核生物基因组中存在着可以从
一个部位转移到另外一个部位的DNA序列，这些序列称为转座子。
逆转录转座子（retransposon）:指内部含逆转录酶编码序列，通过
DNA RNA DNA方式进行转座，即转座子转录产生相应的RNA，再经过逆转录生成新的转座子DNA并整合到基因组中。
质粒（plasmid）:是多数细菌和某些真核生物细胞染色体外的双链环状DNA分子。
遗传重组（genetic recombination）:减数分裂时，通过同源染色体的交换和非同源染色体的独立分配，使子代细胞的遗传信息产生了重新组合，这种现象称为遗传重组。
同源重组（homologous recombination）:指发生在两条双链DNA的同源序列之间，涉及的是大片段同源DNA序列的交换。
位点特异重组（site-specific recombination）:指不依赖于DNA序列的同源性，而依赖于能与某些酶相结合的特异DNA序列的重组。
简述原核生物转座子的类型及组成特点：
①IS——两端有ITR,只能编码转座酶；
②类转座子——结构同IS，但不能独立存在，仅作为复合转座子的两端组件；
③复合转座子——两端由IS或类IS构成，可编码抗性物质；
④TnA转座子家族——两端为ITR,可编码转座酶、解离酶
和抗性物质。
解释逆转录病毒与逆转录转座子的区别：
② 转录病毒是具有感染能力的病毒颗粒，可以在细胞之间转移；
②逆转录转座子是宿主DNA基因组的组分，可以在基因组内转座， 但是不能在细胞之间转移。
简述质粒DNA特性：
⑴质粒的复制 严密型质粒的复制
松弛型质粒的复制
⑵质粒的不相容性
⑶质粒的转移性
⑷质粒的选择性标记
试述大肠杆菌同源重组酶的特点（p92）：
⑴RecBCD:具有外切核酸酶活性，序列特异性的单链内切酶的活性和解旋酶活性使DNA产生具有游离末端的单链、ATPase活性水解ATP为解旋提供能量；
⑵RecA：有单、双链DNA结合活性，有ATPase的活性，并且促进各种DNA分子进行同源配对或分子入侵，形成同源配对的联合分子；
⑶RuvAB：RuvA：识别 Holliday 结构的连接点
RuvB：为分枝迁移提供动力（ATPase）
凭借其解旋酶活性，推动Holliday中间体的分支迁移；
⑷RuvC：是一种核酸内切酶---专一性识别Holliday结构的连接点。
同源重组与位点特异重组有何不同：
① 同源重组中DNA链的切断可能是随机的；
位点特异性重组是在某些特异的DNA序列处发生重组。
② 同源重组后染色体内的DNA序列一般仍按原来的顺序排列；
位点特异性重组中DNA节段的相对位置发生了移动，即DNA
序列发生重排，从而得到不同的结果。
Holliday模型的步骤：
1、两个DNA分子单链的同一部位发生断裂；
2、两个断裂的单链的游离末端彼此交换，连接形成holliday连接体；
3、通过分支移动产生同另一分子的互补序列形成异源双链DNA；
4、Holliday交叉的上部或下部旋转180̊，中间体切开并修复，形成两个双链重组体的DNA。分别为片段重组体和拼接重组体。

第四章 DNA 的复制、突变、损伤和修复
复制（replication）:遗传物质的传代，以母链DNA为模板合成子链DNA的过程。
半保留复制：DNA生物合成时，母联DNA解开为两条单链，各自作为模板按碱基配对规律，合成与模板链互补的子链。子代细胞的DNA ，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。
复制子：两个复制起始点之间的DNA片段。
复制叉：DNA分子复制时，复制起点两条链解开成单链状态所形成的Y形结构称为复制叉。
使DNA链解离的酶：（1）解旋酶—利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链
解开成为两条单链。
（2）单链DNA结合蛋白 SSB—在复制中维持模板处于
单链状态并保护单链的完整。
（3）DNA旋转酶（拓扑异构酶）—改变DNA超螺旋状
态、理顺DNA链。
DNA聚合酶：原核生物：DNA-polⅠ: 对复制中的错误进行校读，对复制和修复
中出现的空隙进行填补
DNA-polⅡ
DNA-polⅢ: 是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。
真核生物：DNA聚合酶α：合成后随链，引物酶活性
DNA聚合酶β：DNA修复
DNA聚合酶δ:先导链合成
DNA聚合酶γ：线粒体DNA 的合成
DNA聚合酶ε：机制不明类似于δ

端粒：真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。
端粒的结构特点：
1、由末端单链DNA序列和蛋白质构成。
2、末端DNA序列是多次重复的富含G、C碱基的短序列。
端粒的功能：
1、维持染色体的稳定性；2、维持DNA复制的完整性
端粒酶的组成：端粒酶RNA；端粒酶协同蛋白；端粒酶逆转录酶
影响端粒酶的药物：1、反义核酸；2、核酶；3、逆转录酶抑制剂：3'-叠氮胸苷（AZT）
线粒体DNA复制：D环复制
噬菌体和病毒DNA的复制：滚环复制
AZT的作用原理：逆转录酶合成病毒DNA时，AZT掺入到病毒DNA中，由于AZT的3’-OH被叠氮取代，所以不能合成3’-5’磷酸二酯键，使病毒DNA合成终止。（HIV治疗）

突变可分为：自发突变；诱发突变
突变类型 碱基置换突变 点突变 （转换、颠换） 单点突变
碱基插入（较长） 多点突变
碱基缺失（较长）

移码突变：插入、缺失一个或两个碱基引起阅读框架
的改变
移码突变：是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。
根据密码子遗传信息改变分类：同义突变、错义突变、无义突变
根据突变表现型对外界环境的敏感性分类：非条件性突变、条件性突变
突变型与野生型的变换：正相突变、回复突变
突变原因：
（一）自发突变（脱氨基、脱嘌呤）　
（二）诱发突变
　１．射线
　２．化学诱变剂
　（１）碱基类似物　（２）氨基嘌呤
　（３）碱基修饰剂（亚硝酸、羟胺、烷化剂）
　（４）ＤＮＡ插入剂
（三） 基因的人工诱变
DNA 的修复系统： 尿嘧啶糖基酶系统
一、复制修复 错配修复
无嘌呤（AP）修复
光复活修复
二、损伤修复 甲基转移酶修复
切除修复
三、复制后修复 大肠杆菌的重组修复系统
SOS修复

光复活修复（原理）：胸腺嘧啶在uv的作用下生成TT二聚体（胸腺嘧啶二聚体），光复活酶在蓝光的照射下激活，是二聚体解离。
限制与修饰 限制：限制性内切酶切断外来的DNA
修饰：甲基化酶保护细胞自身的DNA
渥曼青霉素的作用机制：（抑制肿瘤细胞）抑制DNA损伤修复的蛋白激酶的活性，DNA的修复功能减弱，增加多耐药细胞对化疗药物的敏感性。

第五章 转录 、转录后加工
转录（transcription）：生物体以DNA为模板合成RNA 的过程。
转录单位：RNA链的生物合成起始于DNA模板的一个特定位点，并在另一位点处终止，这一特定区域称为转录单位。
（位于转录起点到转录终点之间的DNA模板区域。）
不对称转录：转录选择性称为不对称转录。
有两方面含义：（1）在DNA分子双链上，一股链用作模板指引转录，另一股链不转录；
（2）模板链并非总是在同一单链上

复制与转录
相同点：以DNA为模板；由5’向3’方向延长；反应体系需要Mg2+
区别：

启动子（promoter）：是指RNA聚合酶识别、结合并起始转录的位于转录单位上游的一段具有高度保守性DNA序列。
原核生物启动子：
1、转录起始点保守序列
2、-10序列(Pribnow框）
3. -35序列(Sextama框）
4. 作用部位间隔区: 17bp转录效率最高
5. CAP结合位点
RNA聚合酶II的启动子结构：
1、起始子；2、TATA框(-25)；3、CAAT框(-75)；4、 GC框(-90)；5、增强子(远上游序列)
增强子（enhancer):1、远上游序列；2、转录频率增强；
3、增强效应与其位置和方向无关；4、大多为重复序列；5、组织特异性、细胞特异性；6、无基因专一性；
7、受外部信号调控
原核生物转录起始：需要RNA聚合酶全酶（δ；两个α、β、β’,后四个为核心酶）
ρ因子：NTP酶的活性；解旋酶的活性。
茎环结构使转录终止的机理：（非依赖ρ因子的终止）
使RNA聚合酶变构，转录停顿；
使转录复合物趋于解离，RNA产物释放。
转录因子(transcriptional factors, TF) ：RNA聚合酶在起始转录时，需要一些辅助因子（蛋白质）参与作用，称之为转录因子。（真核生物）
RNA生物合成抑制剂：
利福霉素：抑制细菌RNA聚合酶（抑制聚合酶的活性 起始阶段）
利迪链霉素：抑制细菌RNA聚合酶（作用于β亚基抑制延长）
a-鹅膏蕈碱：抑制真核生物RNA聚合酶（抑制聚合酶活性）
真核生物mRNA前体加工：
（1）5’端加帽（加帽酶；甲基转移酶；5’-5’三磷酸二酯键；5’端有N7-甲基鸟苷酸）；
（2）3’末端PolyA（聚腺苷酸化）;
（3）内含子剪接；
（4）甲基化
帽子结构的功能:
1、增加mRNA稳定性，使mRNA免遭核酸酶的攻击。
2、为核蛋白体识别mRNA提供信号，促进蛋白质的生物合成。
3、促进某些RNA的合成。

内含子分类：
I： 线粒体、叶绿体及某些低等真核生物,转录产物是rRNA
II：线粒体、叶绿体，转录产物是mRNA
III：细胞核，形成套索结构，转录产物是mRNA
IV：转录产物是tRNA
第I类的内含子的自我剪接：转录产物是rRNA自身催化过程（经过两次转酯反应）：
（1）鸟核苷-OH攻击第一个外显子与内含子之间的磷酸二酯键
（2）第一个外显子3'-OH攻击内含子与第二个外显子之间的磷酸二酯键
（3）两个外显子相连
第III类的内含子的自我剪接：GU-AG规则（套索结构）
tRNA前体的加工：
1、 核酸内切酶在tRNA两端切断
2、核酸外切酶在3'端逐个切去附加的碱基
3、在3'端加上-CCA-OH
4、核苷的修饰(碱基修饰：甲基化；还原反应；核苷内的转位反应；脱氨反应)

。
第六章 蛋白质生物合成——翻译及翻译后过程
蛋白质生物合成的概念
蛋白质生物合成也称翻译，是生物细胞以mRNA 为模板，按照mRNA分子中核苷酸的排列顺序所组成的密码信息合成蛋白质的过程。
蛋白质生物合成体系：
基本原料：20种编码氨基酸
模板：mRNA
适配器：tRNA
装配机：核蛋白体
主要酶和蛋白质因子：氨基酰-tRNA合成酶、转肽酶、起始因子、延长因子、释
放因子等
能源物质：ATP、GTP
无机离子：Mg2+、 K+
开放阅读框架(open reading frame, ORF)：从mRNA 5’-端起始密码子AUG到3’-端终止密码子之间的核苷酸序列，称为开放阅读框架
密码子（codon）：在mRNA的开放阅读框架区，以每3个相邻的核苷酸为一组，代表一种氨基酸(或其他信息)，这种三联体形式的核苷酸序列称为密码子。
遗传密码的性质：方向性、连续性、简并性、摆动性、通用性、偏爱性
摆动性： 反密码子与密码子之间的配对有时并不严格遵守常见的碱基配对规律，这种现象称为摆动配对。
原核生物mRNA的特点（重点）
1、 半衰期——较短，仅为几分钟
2、SD序列: 起始AUG上游, -AGGA-保守序列，是核蛋白体结合位点。
3、多顺反子：原核细胞中数个结构基因常串联为一个转录单位，转录生成的mRNA
可编码几种功能相关的蛋白质，为多顺反子(polycistron) 。
真核生物mRNA的特点（重点）
1、转录和翻译分别在细胞核和细胞浆中完成。
2、半衰期相对较长（几小时甚至几天）
3、Kozak 序列：mRNA起始密码子处的一段保守序列-CCACCAUGG-，能增加翻译起始的效率。
4、单顺反子
真核生物: 起始氨基酰-tRNA: Met-tRNAiMet
参与肽链延长的甲硫氨酰-tRNA：Met-tRNAMet
原核生物：起始氨基酰-tRNA: fMet-tRNAfMet N-甲酰甲硫氨酰-tRNA
原核生物mRNA在核蛋白体小亚基上的准确定位和结合涉及两种机制：
1.小亚基中的16S-rRNA 3ˊ-端有一富含嘧啶碱基的短序列，通过与S-D序列碱基互补而使mRNA与小亚基结合。
2.mRNA序列上紧接S-D序列后的核苷酸序列，可被核蛋白体小亚基蛋白rpS-1识别并结合。
原核生物的肽链合成起始：
指mRNA和起始氨基酰-tRNA分别与核蛋白体结合而形成翻译起始复合物的过程。
（1） 核蛋白体大小亚基分离；（IF-3）
（2） mRNA在小亚基定位结合；
（3） 起始氨基酰-tRNA的结合； (IF-1、IF-2、GTP)
（4） 核蛋白体大亚基结合。

延长：1. 进位(positioning)/注册(registration)(EF-Tu和EF-Ts催化)
2. 成肽(peptide bond formation)（肽酰基转移酶）

3. 转位(translocation)（转位酶）

核蛋白体循环：肽链延长在核蛋白体上连续循环式进行，又称为核蛋白体循环。
多聚核蛋白体：1条mRNA模板链都可附着10～100个核蛋白体，这些核蛋白体依次结合起始密码子并沿5′→3′方向读码移动，同时进行肽链合成，这种mRNA与多个核蛋白体形成的聚合物称为多聚核蛋白体。

蛋白质生物合成阻断剂（P205~208）
1. 抗生素类阻断剂（嘌呤霉素、氯霉素、放线菌酮）
2. 抗代谢药物（长春新碱、三尖杉酯碱）
3. 白喉毒素（使eEF-2失活-糖基化，阻断蛋白质合成）
4. 干扰素 (使eIF-2失活-磷酸化; 降解病毒mRNA)

分子伴侣：是细胞内一类可识别肽链的非天然构象、促进各功能域和整体蛋白质的正确折叠的保守蛋白质。
分子伴侣有以下功能：
①封闭待折叠蛋白质的暴露的疏水区段；
②创建一个隔离的环境，可以使蛋白质的折叠互不干扰；
③促进蛋白质折叠和去聚集。
翻译后加工修饰：（一）侧链氨基酸的微小修饰
1. 二硫键的形成
2.甲基化、磷酸化及乙酰化
（二）剪切和剪接加工
1．新生肽链N端的切除
2．剪切
（1）信号肽的切除
（2）前体蛋白加工
（3）活性肽的剪切释放
（三）添加化学基团

第八章 基因工程及其在医药工业的应用
基因工程的基本原理（简答题）：
获取目的基因—选择和构建载体—目的基因与载体的连接—重组体导入受体细胞—重组体的筛选—克隆基因的表达
限制性内切酶切割后产生的3种粘性末端：
5’-粘性末端；3’-粘性末端；平头末端
影响限制性内切酶活性的因素：
1、 DNA的纯度
2、DNA甲基化程度
3、底物DNA的分子构型
4、反应温度
5、反应系统组成：缓冲液、pH等
6、酶量、反应体积、酶切时间合理使用
DNA连接酶 (DNA ligase)：催化DNA中相邻的5´-磷酸基和3´-羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接。
DNA连接酶的分类：(1) T4噬菌体DNA连接酶 连接粘性末端或平末端的DNA分子
(2)大肠杆菌DNA连接酶 只能连接粘性末端
DNA和RNA的修饰酶：末端脱氧核苷酸转移酶——同聚物加尾
碱性磷酸酶——切除5’-末端的磷酸
限制酶在DNA的任何部位都能将DNA切开吗？
不能。 限制性核酸内切酶识别DNA的特异序列（回文序列）， 并在识别位点或其周围切割双链DNA。
DNA聚合酶和DNA连接酶有何不同点？
1、DNA连接酶：主要是连接DNA片段之间的磷酸二酯键，起连接作用，在基因工程中起作用。
2、 DNA聚合酶：主要是在DNA片段末端连接上单个脱氧核苷酸，在DNA复制中起作用
3、DNA连接酶是将DNA双链上的两个切口同时连接起来。因此DNA连接酶不需要模板
4、DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链；

载体必备条件： 1、能自主复制；
2、有多克隆位点（MCS）；
3、具有遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；
4、分子量小，以容纳较大的外源DNA。
质粒(plasmid)：是细菌染色体外的遗传单位，环状双链DNA分子。存在于宿主细胞内、独立于染色体外的、自主复制的遗传成分。
克隆载体 (cloning vector): 能使插入的外源DNA序列被复制、扩增而不能表达，这样的载体为克隆载体
表达载体: 为使插入的外源DNA序列转录，进而翻译成多肽链而设计的载体称表达载体。
蓝白筛选：质粒上存在LacZ’序列，该序列能编码β-半乳糖苷酶N端，而细菌染色体能编码β-半乳糖苷酶C端, 形成α互补产生了具有活性的β-半乳糖苷酶，培养基里存在的X-gal被杂合的β-半乳糖苷酶水解，形成蓝色化合物，因此在平板上产生蓝色菌落。
而LacZ’序列上存在多克隆位点，由于目的基因的插入，破坏了LacZ’的结构，无法产生功能性的β-半乳糖苷酶，不能水解X-gal，不能生成蓝色化合物，所以平板上出现白色菌落，白色菌落为阳性克隆的菌落。
DNA重组: 不同来源DNA分子通过共价连接（磷酸二酯键）而组合成新的DNA分子的过程。
大肠杆菌载体按功能分类：（1）克隆载体
（2）表达载体
（3）穿梭载体*
原核表达载体的表达系统元件是：
启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号
大肠杆菌基因表达载体分为3个系统：
DNA复制及重组体的选择系统：复制子、选择标记
外源目的基因的转录系统：启动子、转录终止子、抑制物基因
蛋白质的翻译系统：
核糖体结合位点（SD序列）、翻译起始密码子、翻译终止密码子

穿梭载体（shuttle vector)：原核细胞复制所需的序列结构。
真核细胞表达所需的结构元件和相应的选择标记基因。
采用不同方法获取目的基因（简答题）：
基因序列已知

基因序列未知

基因组DNA文库
cDNA文库
聚合酶链反应
化学合成法
基因组DNA文库（名解）：存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合。
PCR 反应体系：1、模板DNA ；2、dNTP；3、引物；
4、Tag DNA聚合酶；5、缓冲液。
步骤：模板DNA变性；模板DNA与引物退火；引物延伸。
人工合成基因局限性：1、长度：<60bp；
2、中性突变：密码子选择需注意；
3、二级结构和重复结构影响拼接；
4、合成费用高。

载体与目的基因的连接主要有以下5种连接方式：（选择简答）
1、粘性末端连接
2、平头末端连接
3、衔接体（linker）技术
4、同源多聚尾连接法
5、人工接头（adaptor）技术

粘性末端的连接方式：（选择）
1、插入失活法（单酶切）
2、定向克隆法（双酶切）
3、载体5’端脱磷法（CIP）

基因组DNA文库与cDNA文库的比较（10分）：
基因组DNA文库的构建： cDNA文库的建立：
组织或细胞染色体DNA mRNA
限制性内切酶 反转录酶
基因片段 cDNA第一链
克隆载体 复制
重组DNA分子 双链cDNA
受体菌 载体
含重组分子的转化菌 重组DNA分子
（基因文库） 受体菌
cDNA文库
1、cDNA文库比基因组DNA文库小得多。
2、从cDNA文库筛选基因比较容易。
3、基因组DNA文库：内含子和外显子
4、cDNA文库：只有外显子
感受态细胞(competent cell)： 用特殊方法（CaCL2）处理后，受体细胞才具备接受外源DNA的能力， 这种细胞称感受态细胞。
重组基因导入原核细胞：CaCl2转化法

重组基因导入哺乳动物细胞的方法：
1、磷酸钙转染；2、电穿孔；3、DEAE葡聚糖介导转染；
4、脂质体转染；5、显微注射。

重组体的筛选鉴定方法主要有：
1、遗传学方法
2、核酸杂交法（鉴定）
3、免疫学方法（鉴定）
4、利用PCR方法筛选重组子
5、酶切鉴定
6、DNA测序（鉴定）

核酸分子杂交法主要包括：
（一）菌落原位杂交
（二）Southern印迹（DNA）
（三）斑点印迹
（四）Northern印迹（RNA）
PCR的基本原理是什么?用PCR扩增某一基因，必须预先得到什么样的信息?
答：
(1)DNA半保留复制的原理，在体外进行DNA的变性、复性和引物延伸。
(2)至少要预先知道足够合成一对引物的靶DNA序列。
第七章 基因表达的调控
基因表达(gene expression)： 是基因转录及翻译的过程，即：生成具有生物学功能产物的过程。
可诱导基因：在特定环境信号刺激下，相应的基因被激活，基因表达产物增加，这种基因称为可诱导基因。
诱导(induction)：可诱导基因在特定环境中表达增强的过程，称为诱导(induction)。
可阻遏基因：如果基因对环境信号应答是被抑制，基因表达产物减少，这种基因是可阻遏基因。
阻遏(repression)：可阻遏基因表达产物水平降低的过程称为阻遏(repression)
基因表达的调控方式:
阻遏
负调控:调控蛋白+DNA序列 基因的表达
(相应蛋白质降低)
促进
正调控:调控蛋白+DNA序列 基因的表达
(相应蛋白质增加)
顺式作用元件：与相关基因处在同一个DNA分子上，起调控作用的DNA序列。
反式作用因子：对一个基因的表达具有调控作用的另一个基因的产物。
乳糖操纵子
色氨酸操纵子（转录翻译偶联对基因表达的调控）
热休克应答反应：42~50℃，大肠杆菌常规蛋白质合成开始关闭或下降，诱导产生各种热休克蛋白，与σ32有关。
沉默子(silencer)：某些基因的负性调节元件，当其结合特异蛋白因子时，对基因转录起阻遏作用。

真核生物的基因表达调控：
一、 染色体重排的调控
二、 染色质水平调控
（一）活性染色质
DNA拓扑结构变化；2. 对核酸酶（DNase I)敏感
（二）组蛋白的修饰
乙酰化修饰 作用：降低核小体的稳定性
磷酸化修饰 作用：降低与DNA的亲和力
三、DNA水平调控
（一）基因的丢失、扩增与重排
（二）DNA的甲基化和去甲基化
四、转录水平调控
（一）顺式作用元件：启动子；增强子；沉默子
（二）反式作用因子
转录调节因子分类（按功能特性） 基本转录因子
特异转录因子
五、翻译水平调控
（一） 5’UTR结构（UTR非翻译区）
（帽子结构、mRNA二级结构、先导序列）
（二）蛋白因子磷酸化
（三） 3’UTR结构
六、小分子RNA对基因表达调控（P299）
1．小干扰RNA与基因沉默
2．微小RNA与基因沉默

α螺旋-β转角-α螺旋
锌指结构
碱性亮氨酸拉链
转录因子的结构： DNA结合域 螺旋-环-螺旋
（填空） 酸性激活域
转录激活域 谷氨酰胺富活域
脯氨酸富含域

第七章 基因表达的调控
基因表达(gene expression)： 是基因转录及翻译的过程，即：生成具有生物学功能产物的过程。
可诱导基因：在特定环境信号刺激下，相应的基因被激活，基因表达产物增加，这种基因称为可诱导基因。
诱导(induction)：可诱导基因在特定环境中表达增强的过程，称为诱导(induction)。
可阻遏基因：如果基因对环境信号应答是被抑制，基因表达产物减少，这种基因是可阻遏基因。
阻遏(repression)：可阻遏基因表达产物水平降低的过程称为阻遏(repression)
基因表达的调控方式:
阻遏
负调控:调控蛋白+DNA序列 基因的表达
(相应蛋白质降低)
促进
正调控:调控蛋白+DNA序列 基因的表达
(相应蛋白质增加)
顺式作用元件：与相关基因处在同一个DNA分子上，起调控作用的DNA序列。
反式作用因子：对一个基因的表达具有调控作用的另一个基因的产物。
乳糖操纵子
色氨酸操纵子（转录翻译偶联对基因表达的调控）
热休克应答反应：42~50℃，大肠杆菌常规蛋白质合成开始关闭或下降，诱导产生各种热休克蛋白，与σ32有关。
沉默子(silencer)：某些基因的负性调节元件，当其结合特异蛋白因子时，对基因转录起阻遏作用。
真核生物的基因表达调控：
三、 染色体重排的调控
四、 染色质水平调控
（一）活性染色质
DNA拓扑结构变化；2. 对核酸酶（DNase I)敏感
（二）组蛋白的修饰
乙酰化修饰 作用：降低核小体的稳定性
磷酸化修饰 作用：降低与DNA的亲和力
三、DNA水平调控
（一）基因的丢失、扩增与重排
（二）DNA的甲基化和去甲基化
四、转录水平调控
（一）顺式作用元件：启动子；增强子；沉默子
（二）反式作用因子
转录调节因子分类（按功能特性） 基本转录因子
特异转录因子
五、翻译水平调控
（一） 5’UTR结构（UTR非翻译区）
（帽子结构、mRNA二级结构、先导序列）
（二）蛋白因子磷酸化
（三） 3’UTR结构
六、小分子RNA对基因表达调控（P299）
1．小干扰RNA与基因沉默
2．微小RNA与基因沉默
α螺旋-β转角-α螺旋
锌指结构
碱性亮氨酸拉链
转录因子的结构： DNA结合域 螺旋-环-螺旋
（填空） 酸性激活域
转录激活域 谷氨酰胺富活域
脯氨酸富含域
第九章 基因敲除与药学
基因敲除（gene knockout）：在转基因技术和DNA分子间的同源重组的基础上发展的高新技术，对生物体中的目标基因（结构已知，功能未知）进行特异性的修饰和改造，或用序列相近的基因取而代之，由此使生物体的性状发生改变，观察实验动物的整体效应，从而推测相应基因的功能以及建立相关疾病治疗模型等。
二、基因敲除载体导入ES细胞
1. 显微注射法
2. 电穿孔法（常用）
3. 病毒感染法（常用）
4. DNA-磷酸钙共沉淀法
5. DEAE葡聚糖介导法

6. 脂质体法
四、基因敲除动物的产生
1.显微注射法
2.胚胎聚合法
3.核移植法
条件性基因敲除（conditional gene knockout）：是一种将目标基因的敲除限制在某一特定的组织、细胞或发育的特定阶段的特殊的基因敲除方法。

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