实验室污染防治专家讲座.pptx

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,PCR,污染监测,PCR,强大扩增能力,+,检测敏感性,经,30,个周期后，特定,DNA,片段数量在理论上可增加,10,9,倍,极微量污染便可造成假阳性，尤其对定量造成很大问题,NTC,(No Template Control):,必须,设置一个不含模板,DNA,但含有,PCR,系统中全部其它成份对照反应，这一对照管须在准备好全部其它,PCR,以后才进行吸加。,实验室污染防治专家讲座,第1页,常见,PCR contamination,常规,PCR,荧光定量,PCR,NTC,4,3,2,1,7,6,5,9,8,NTC,实验室污染防治专家讲座,第2页,引发,PCR,污染原因,模板间交叉污染,容器被污染,模板放置时,因为密封不严溢于容器外,容器外粘有模板而造成相互间交叉污染,模板吸收过程中,因气溶胶（,aerosol,）或其它原因引发移液器污染，从而造成交叉污染,实验室污染防治专家讲座,第3页,引发,PCR,污染原因,PCR,试剂污染,PCR,试剂配制过程中,移液器、容器、水等原因造成试剂被,PCR,核酸模板污染。,实验室污染防治专家讲座,第4页,引发,PCR,污染原因,PCR,产物污染,-,最主要最常见,PCR,产物拷贝量大，极微量,PCR,产物污染,就可形成假阳性。,移液器吸收,PCR,产物进行电泳检测，同一支移液器去准备,PCR mix,PCR,产物气溶胶污染：,一个气溶胶颗粒可能含几万个拷贝,气溶胶（,aerosol,）：悬浮于气体介质中粒径普通为,0.001m1000m,固体、液体微小粒子形成胶溶状态散体系。空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶,在操作时比较猛烈地摇动反应管,开盖时、吸样时及移液器重复吸样都可形成气溶胶,实验室污染防治专家讲座,第5页,引发,PCR,污染原因,试验室中克隆质粒污染,克隆质粒浓度高,另外在纯化过程中需用较多用具及试剂,其污染可能性也很大,实验室污染防治专家讲座,第6页,预防,PCR,污染,首要标准,永远要设置,NTC,对照,假如不能在污染出现第一时间发觉，会造成严重后果：一大段时间数据不可信,准备,PCR,移液器要专用,千万不能,用吸收,PCR,产物,/,克隆质粒移液器去准备,PCR,体系,实验室污染防治专家讲座,第7页,预防,PCR,污染,空间：,合理分隔试验区域,:,将样品处理、配制,PCR,反应液、,PCR,循环扩增及,PCR,产物判定等步骤分区进行，尤其注意样本处理及,PCR,产物判定应与其它步骤严格分开。,理想状态：,各个区域试验用具及移液器专用，试验前应将该区域用紫外线消毒，破坏残留,DNA,或,RNA,。,实验室污染防治专家讲座,第8页,预防,PCR,污染,操作,一旦进入吸加,PCR,试剂专用场所并开始工作，就应戴上一副新手套，并应勤于更换。,准备专供自己使用,PCR,试剂，分装为小份。不要与样品存放在一起。,选择质量好,Eppendorf,管,-,密封性好且开管不需要太大力气,打开离心管前应先离心，将管壁及管盖上液体甩至管底部。开管动作要轻，以防管内液体溅出。,试验结束后及时清理台面,实验室污染防治专家讲座,第9页,预防,PCR,污染,移液器操作,因为操作时不慎将模板吸入枪内或粘上枪头是一个严重污染源，因而加样时要十分小心。,1,）准备,PCR,移液器专用,2,）吸样要慢，吸样时尽可能一次性完成，忌屡次抽吸，切勿形成喷雾，以免交叉污染或产生气溶胶污染。,3,）最好在加完全部其它反应成份后才吸加模板。,4,）推荐在准备,PCR,过程中使用滤芯枪头,实验室污染防治专家讲座,第10页,选取含,UNG,（尿嘧啶,DNA,糖基酶,Uracil-N-Glycosylase),试剂，有利于预防,PCR,产物引发污染。,UNG,：,50,摄氏度，,2,分钟，作用于含有,dU,DNA,双链或单链,然后开始,PCR,反应预变性步骤，同时,UNG,失活,预防,PCR,污染,对于不含,dU,PCR,产物无效,实验室污染防治专家讲座,第11页,出现污染后处理方法,更换试剂,更换新试剂和水，用确保无污染移液器分装备用,清洁全部可能污染源：试验台面、小离心机、冰箱门把手等等,1,）试验台面、超净工作台用现配,3%,双氧水或,10%,次氯酸钠溶液擦拭清洁。,2,）或者用,10%,漂白粉溶液擦拭,3),紫外光照射，照射距离应不超出,90 cm,，照射时间最好过夜。,试验过程中愈加小心，采取前面提到各种预防污染方法,实验室污染防治专家讲座,第12页,参考文件,Kwok S,Higuchi R.Avoiding false positives with PCRJ .,Nature,1989,339(6221):237-238.,Mifflin T.E.Setting Up a PCR Laboratory.,CSH Protocols;doi:10.1101/pdb.top14,实验室污染防治专家讲座,第13页,讨论,设置,-RT,对照后是不是能够不用设,NTC,了？,使用了滤芯枪头，是否不需要移液器专用了？,实验室污染防治专家讲座,第14页,