蛋白质的研究方法与原理专家讲座.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第十章 蛋白质研究方法与原理,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第1页,第一节 概 述,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第2页,蛋白质分离纯化包含以下过程：,1.,破碎生物组织，并用适当缓冲液将蛋白质抽提出来；,2.,将相关蛋白质分级沉淀下来,;,（盐析法或有机溶剂法）,3.,应用,层析法,或,电泳法,使它们各自分开,；,4.,蛋白质结晶；,5.,蛋白质纯度判定和含量测定。,直接从生物组织中提纯蛋白,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第3页,制备过程中注意事项,：,要求自始至终保持在,天然状态,防止一切过激原因,-,如过酸或过碱，高温，,重金属等影响。,2.,通常都在低温条件下操作。,3.,尽可能使样品中蛋白质浓度维持在较高,水平。,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第4页,第二节 蛋白质分离与纯化技术,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第5页,一、蛋白质沉淀与结晶,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第6页,（一）,盐析法,概念,：将,中性盐加入蛋白质溶液，破坏水化膜和电荷而使蛋白质沉淀，叫盐析。各种蛋白质盐析所需盐浓度及,PH,不一样，加入不一样浓度中性盐可,使各种蛋白质依次分别沉淀出来。,优点：操作简便,对易变性蛋白质有一定保护作用，,适用范围十分广泛。,缺点：分辨能力差，纯化倍数低,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第7页,（,1,）盐种类,对同一个,Pr,而言，,价数愈高,盐离子，盐析能力,也愈强,:,PO,3-,4,SO,4,2-,C,2,O,4,2-,（,CHOHCOO,-,）,2,AC,CL,NO,3,-,Br,-,I,-,CNS,-,K,+,Rb,+,Na,+,Cs,+,Li,+,NH,4,+,惯用中性盐,有如硫酸盐、磷酸盐等。,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第8页,硫酸铵,（惯用盐析剂）,优点：盐析能力较强,含有较高溶解度,较低溶解度温度系数,价格低廉,不产生副作用。,缺点：缓冲能力较差,PH,难控制,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第9页,（,2,）,PH,和温度,S,。代表蛋白质在无机盐溶液中溶解度,除取决于,Pr,种类，还受,PH,及温度影响,:,PH=PI,时，,S,。数值极小,S,。随温度增加而减低。,盐析过程中，若增高温度，有利于,Pr,析出。,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第10页,（,3,）蛋白质浓度,Pr,较高,，在较低无机盐浓度时,蛋白质便开,始析出，盐析界限比较宽。,Pr,较低,，需要无机盐浓度也高，即盐析,界限变窄。,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第11页,1.,基本原理,（,1,）在,PI,附近，,Pr,主要以中性离子形式存在。此时若添加,有机溶剂，因为,有机溶剂,可使溶液,电离,常数,减小，增强了,中性离子间静电引力，从而使分集合而沉淀出来。,（,2,）,有机溶剂,本身水合作用会破坏,Pr,表面水合层，也,促使,Pr,变得不稳定而聚集析出,.,惯用有机溶剂：乙醇和丙酮,（二）有机溶剂沉淀法,分辨力比盐析方法高，提纯效果好,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第12页,（三）选择性沉淀法,选择一定条件使其它蛋白质变性沉淀而不影响目标蛋白质分离方法。比如，将提取液加热至一定温度并维持一段时间，是一些不耐热蛋白质变性沉淀等。应用选择星辰殿，徐实现对系统中需除去及欲提纯蛋白质理化性质都有较全方面了解。,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第13页,（四）蛋白质结晶,蛋白质结晶即是溶液中蛋白质由随机状态转变为有规则排列状态固体，惯用语分析研究其结构。,蛋白质结晶是一个有序化过程，当蛋白质溶液到达过饱和状态，能够形成一定大小晶核，溶液中分子失去自由运动能量，不停地结合到形成晶核上，长成适合于,X,线衍射分析晶体。,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第14页,二、离心技术分离蛋白质,离心技术是利用物体告诉旋转时产生强大离心力，使置于旋转体中悬浮颗粒发生沉降或漂浮，从而使一些颗粒到达浓缩或与其它颗粒分离之目标。,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第15页,三、层析技术分离纯化蛋白质,最基本特征：,固定相,流动相,层析技术,（,chromatography,）,又称色谱技术，是利用不一样物质理化性质差异而建立起来技术。,各种物质得以分离最基本原因：,就在于它们在这,两个相之间含有不一样分配系数,.,两相作相对运动时，,这些物质在两相间进行屡次分配，即使它们分,配系数只有微小差异，经过这个过程也能得到最,大分离效果。,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第16页,气相层析,按,两相状态,来分,液相层析,吸附层析,分配层析,离子交换层析,按,层析机理,来分,凝胶排阻层析,亲和层析,柱层析,按,操作方式,来分,薄层层析,纸层析,层析技术种类,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第17页,（一）凝胶过滤层析,又称,分子筛或凝胶过滤,（,gel filtration,）,原理：载体为有一定孔径多孔性亲水性凝胶。当分子大小不一样混合物经过这种凝胶柱时，直径大于孔径分子将不能进入凝胶内部，便直接沿胶粒间隙流出（全排出）。较小分子进入能容纳它孔穴，绕道而行，在柱内保留时间就比较长。这么，较大分子被先洗脱下来，而较小分子后被洗脱下来，从而到达相互分离目标。,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第18页,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第19页,离子交换层析法,*,原理：,阴,（阳）离子交换树脂颗粒（作为固定相）,填充在层析柱内，因为,阴,（阳）离子交换树,脂颗粒上带,正,（负）电荷，能吸引溶液中,阴,（阳）离子。然后再用含阴（阳）离子,溶液洗柱。含负电量小蛋白质首先被洗脱,下来，增加阴离子浓度，含负电量多蛋白,质也被洗脱下来，于是两种蛋白质被分开。,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第20页,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第21页,亲和层析法,原理,：,利用生物高分子含有能和一些相对应专一,分子可逆结合特征。,如，,酶活性部位能和底物,抑制剂,辅助因子专,一性地结合,改变条件又能使这种结合解除,.,酶变构中心与变构因子（或称效应物）之,间、抗体与抗原之间、激素与受体之间，结,合蛋白与结合物之间,。,这些被作用对象物质称之为,配基（,ligand),。,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第22页,高效液相层析法,（,High Performance Liquid Chromatography,，,HPLC,）,又称“,高压液相色谱,，是,色谱法,一个主要分支，以,液体,为,流动相,，采取高压输液系统，将含有不一样,极性,单一,溶剂,或不一样百分比混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相,色谱柱,，在柱内各成份被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样分析。,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第23页,四、电泳技术分离蛋白质,电泳（,electrophoresis,）,是指带电粒子在电场中向着与其所带电荷相反方向电极移动现象。,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第24页,SDS-,聚丙烯酰胺凝胶电泳,SDS,(,十二烷基硫酸钠,),是阴离子型去污剂,(Sodium dodecyl sulfate,SDS),Q,u=,（迁移率）,6r,u,与,Q,、,r,相关,若蛋白质分子带有足够电荷，在,SDS-PAGE,中进,行电泳，因为分子筛效应，,u,仅取决于分子大小。,所以,SDS,一凝胶电泳能够按,蛋白质分子大小不一样,将其,分开。,这时，若以分子量对数（,logM,）对相对于染料前沿,迁移率（,Rf,）作图，展现线性关系。,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第25页,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第26页,这种关系，对一个胶浓度时，只适合用于一定,分子量范围：,5,胶浓度时，适合用于分子量,6,200,万区间；,10,胶浓度时，适合用于分子量,1.6,7,万区间；,15,胶浓度时，适合用于分子量,1.2,4.5,万区间。,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第27页,聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第28页,等电聚焦电泳,（,isoelectric focusing,IEF,）,是一个依据样品等电点不一样而使它们在,pH,梯度,中相互分离一个电泳技术。,利用特殊一个缓冲液（两性电解质）在凝胶（惯用聚丙烯酰胺凝胶）内制造一个,pH,梯度。,pH,梯度制作利用两性电解质（,ampholyte,，商品名为,ampholine,），是脂肪族多胺和多羧类同系物，他们含有相近但不一样,pKa,和,pI,值。在外电场作用下，自然形成,pH,梯度。凝胶可用：聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶等,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第29页,Pr,分子有一定,PI,，它处于一个由,阳极到阴极,梯度逐步增加介质中，并经过以直流电时，它便,“,聚焦,”,在与其,PI,相同,pH,位置上。,PI,不一样蛋白质泳动后形成位置不一样区带而得到分离。,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第30页,优点：,1.,有很高分辨率；,2.,能够区分等电点只有,0.01 pH,单位差异蛋白质；,3.,依据其所在位置还能够测定蛋白质分子量；,4.,对很稀样品，最终到达高度浓缩。,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第31页,双向电泳,（,two-dimensional gel electrophoresis,）,第一向采取聚丙烯酸胺凝胶等电聚焦电泳,-,PI,第二向采取,SDS,一凝胶电泳,-,分子量,因为结合了蛋白质等电点和分子量两种完全不,同特一性来进行分离，所以含有非常高分辨率,可同时分析几千上万个蛋白，分辨率高，分离度好。,是蛋白质组学研究关键技术。,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第32页,双向,PAGE,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第33页,含有以下特征蛋白质在二维电泳中还极难被检测到：,等电点（,pl),值很大或很小，比如大于,8,和小于,4,那些蛋白质；,分子质量很大蛋白质，比如大于,l00kDa,蛋白,质就比实际少了，而大于,150kDa,蛋白质就几,乎完全探测不到了（尽管在一维电泳凝胶上这些,大蛋白质都能清楚地被观察到；,疏水性蛋白质。,双向电泳技术缺点,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第34页,高效毛细管电泳,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第35页,1.,毛细管区带电泳（,CZE,）,毛细管区带电泳也称为自由溶液溶液区带电泳,这种电泳模式特征是整个系统都用同一个缓冲溶液充满，带电粒子迁移速度依赖物质荷,/,质比差异。,荷,/,质比越大，泳动越快。,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第36页,2.,毛细管凝胶电泳（,capillary gel electrophoresis,，,CGE,）,将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。,其含有多孔性，类似分子筛作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。,特点：抗对流性好，散热性好，分离度极高。,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第37页,3.,胶束电动毛细管色谱,（,Micellar electrokinetic capillary chromatography,，,MEKC,）,缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度到达临界浓度，形成一疏水内核、外部带负电胶束。中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强组分与胶束结合较牢，流出时间长；可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳应用范围。,在电场力作用下，胶束在柱中移动。,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第38页,4.,毛细管等电聚焦电泳（,Capillary isoelectric focusing,，,CIEF,）,是依据等电点差异分离生物大分子高分辨率电泳技术；,CIEF,是在毛细管内充有两性电解质，当施加直流电压（,6,8,V,）时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高,pH,梯度；,含有不一样等电点生物试样在电场力作用下迁移，分别抵达满足其等电点,pH,位置时，呈电中性，停顿移动，形成窄溶质带而相互分离；此法可用于测定蛋白质等电点、纯度判定、不一样变异体分析等。,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第39页,5.,毛细管等速电泳,（,Capillary isotachophoresis,，,CITP,）,将两种淌度差异很大缓冲液分别作为前导离子,(,充满毛细管,),和尾随离子，试样离子淌度全部位于二者之间，并以同一速度移动。,负离子分析时，前导电解质淌度大于试样中全部负离子。全部试样都按前导离子速度等速向阳极前进，逐步形成各自独立区带而分离。阴极进样，阳极检测。,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第40页,6.,亲和毛细管电泳,（,affinity capillary electrophoresis,ACE,）,是毛细管内壁涂布或在凝胶中加入亲和配基，以亲和力不一样到达分离目标。,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第41页,7.,毛细管电动色谱,（,Capillary electrokinetic chromatography,，,CEC,）,在毛细管壁上键合或涂渍高效液相色谱固定液，以“电渗泵”取代机械泵，试样组分在两相间分配为分离机理电动色谱过程。,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第42页,第三节 蛋白质含量测定方法,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第43页,测定蛋白质含量方法较多,基本上都是依据蛋白质理化性质和生物学活性建立起来。,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第44页,当前惯用有四种古老经典方法,:,定氮法,双缩脲法,(Biuret,法,),，,Folin-,酚试剂法,(Lowry,法,),和紫外吸收法,.,另外还有一个近十年才普遍使用起来新测定方法,考马斯亮蓝法,(Bradford,法,).,其中,Bradford,法和,Lowry,法灵敏度高，比紫外吸收法高,10-20,倍,比,Biuret,法高,100,倍以上,.,凯氏定氮法比较复杂,但较准确,往往以定氮法测定蛋白质作为其它方法标准蛋白质。,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第45页,一、凯氏定氮法,凯氏定氮法原理基于蛋白质平均含氮量为,16%,，经过测定样品中氮元素量来计算出蛋白质含量。,基本操作过程：,用硫酸对样品加热消化，蛋白质被硫酸氧化成,CO,2,和,H,2,O,，氮元素被还原成,NH,3,，并形成,(NH,4,),2,SO,4,；,加入强碱，使硫酸铵释放出,NH,3,，并将,NH,3,搜集在无机酸液中；,用标准碱溶液滴定，确定,NH,3,量；,依据量确定样品含氮量，进而求得样品中蛋白质含量。,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第46页,(1)H,2,NCH,2,COOH+3H,2,SO,4,2CO,2,+3SO,2,+4H,2,O+NH,3,(2)2NH,3,+H,2,SO,4,(NH,4,),2,SO,4,(3)(NH,4,)SO,4,+2NaOH 2H,2,O+Na,2,SO,4,+2NH,3,此法灵敏度低,适合用于,0.3-3.0,g,氮,误差为,2%,最大缺点,是受样品中非蛋白质含氮化合物影响。测定前需用蛋白质沉淀剂沉淀蛋白，除去非蛋白含氮化合物。,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第47页,优点,凯氏定氮法因为含有测定准确度高，可测定各种不一样形态样品等两大优点，因而被公认为是测定食品、饲料、种子、生物制品、药品中蛋白质含量标准分析方法。,1,、酒精灯,2,、蒸汽发生器,3,、长玻璃管,4,、橡皮管,5,、小玻杯,6,、棒状玻璃塞,7,、反应室,8,、反应室外壳,9,、夹子,10,、反应室中插管,11,、冷凝管,12,、锥形瓶,13,、石棉网,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第48页,二、紫外吸收法,蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基苯环含有共轭双键，所以，蛋白质含有吸收紫外光性质，其最大吸收峰位于,280 nm,附近（不一样蛋白质吸收波长略有差异）。在最大吸收波优点，吸光度与蛋白质溶液浓度关系符合朗伯,-,比耳定律，所以，可用比色法直接测定蛋白质浓度。,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第49页,在测定工作中，能够利用,280nm,及,260 nm,光密度值求出蛋白质浓度：,蛋白质浓度（,mg/mL,）,=1.45A280nm0.74A260nm,上式中,OD280nm,是蛋白质溶液在,280nm,下测得光密度，,OD260nm,是蛋白质溶液在,260nm,下测得光密度。,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第50页,优点：,1.,快速；,2.,对蛋白质无破坏性。,缺点：,1.,不是严格定量方法。因为此法是依据酪氨酸（,Tyr,）、苯丙氨酸（,Phe,）、色氨酸（,Trp,）残基强吸收值来测定，不一样蛋白质含有不一样消光系数。另外，当蛋白质分子中不含,Tyr,、,Phe,或,Trp,残基时，该方法就不能检出蛋白。（此法用于测粗提总蛋白浓度较为适宜）,2.,核酸可引发强烈干扰。,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第51页,（一）考马斯亮蓝法（,Bradford,法）,考马斯亮蓝,G-250,法是比色法与色素法相结合复合方法。考马斯亮蓝,G-250,是一个染料，在游离状态下呈棕红色，在,465nm,下有最大吸收峰；当与蛋白质结合后呈青蓝色。在一定范围内，也就是当蛋白质含量在,01000g,范围内，蛋白质,-,色素结合物在,595 nm,下吸光度与蛋白质含量成正比，所以可用比色法测定。,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第52页,优点是：,（,1,）灵敏度高：蛋白质染料复合物含有很高消光系数，所以蛋白质测定灵敏度较高，最低检出量为,1ug,蛋白质。据预计比,Lowry,法约高四倍。,（,2,）测定快速、简便：染料与蛋白质结合，大约只需,2,分钟，结合物颜色在,1,小时内是稳定。因而完全不用像,Lowry,法那样费时和严格地控制时间。,（,3,）干扰物质少。如干扰,Lowry,法,K+,、,Na+,、,Mg2+,离子、,Tris,缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、,EDTA,等均不干扰此测定法。,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第53页,（二）,lowry,法,在碱性条件下，蛋白质中肽键与铜结合生成复合物,Folin-,酚试剂中磷钼酸盐,-,磷钨酸盐被蛋白质中,Tyr,和,Phe,残基还原，产生深兰色钼兰和钨兰混合物。,在一定条件下，兰色深度与蛋白量成正比。在,680nm,处测定样品吸光值，确定其蛋白质含量。,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第54页,优点：,操作简单、快速，不需要复杂而昂贵设备，灵敏度比较高。,缺点：,Folin-,酚试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸引发，所以样品中酚类、柠檬酸和巯基化合物，都有干扰作用。,此方法受蛋白质特异性影响，蛋白质中酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸含量不一样使得显色强度也不一样，标准曲线也不是严格直线。,此方法初步显色是双缩脲反应，所以，凡是干扰双缩脲反应基团（原因）都会干扰,Folin-,酚反应。,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第55页,第四节 蛋白质结构分析方法,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第56页,一、蛋白质一级结构分析,步骤：,分离蛋白质样品必需纯（,97%,以上）。,测定蛋白质分子中多肽链数目。,巯基乙醇处理,，使,二硫键还原为巯基,，产生单一多肽链。,分离纯化单一多肽链。,测定多肽链氨基酸组成。,多肽链断裂 可采取特异酶或化学试剂将多肽样品断裂成肽碎片，并将其分离开来。,对每一肽段进行测序。,确定肽段在多肽链中次序。,确定蛋白质分子中二硫键及酰胺基位置 以及磷酸化、糖基化位点。,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第57页,（一）测序前准备工作,1.,多肽链氨基端和羧基端分析,2.,多肽链氨基酸组成份析,3.,多肽链有限水解为若干个肽段,N-,端：丹酰氯,丹酰肽,-,层析分离判定,C-,端：肼解法，羧肽酶法,高效液相色谱 测定氨基酸种类和含量,采取特异性酶或化学试剂将单一多肽链有限水解为含有部,分重合若干个肽段。,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第58页,（二）多肽链氨基酸序列测定,1.Edman,降解法,Edman,降解法：是肽链或蛋白质中,N-,端氨基酸序列分析方法之一。由菲尔,埃德曼（,Pehr Edman,）首先创建。,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第59页,原理：,用异硫氰酸苯酯（,PITC,）与待分析多肽,N-,端氨基在碱性条件下反应，生成苯氨基硫代甲酰胺（,PTC,）衍生物，然后用酸处理，关环，肽链,N-,端被选择性地切断，得到,N-,端氨基酸残基噻唑啉酮苯胺衍生物。接着用有机溶剂将该衍生物萃取出来，酸作用下，该衍生物不稳定，会继续反应，形成一个稳定苯基乙内酰硫脲（,PTH,）衍生物。余下肽链中酰胺键不受影响。经过用,HPLC,或电泳法分析生成苯乙内酰硫脲（,PTH-,氨基酸），能够判定出是哪一个氨基酸。,每反应一次，结果是得到一个去掉,N-,端氨基酸残基多肽，剩下肽链能够进入下一个循环，继续发生降解。,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第60页,优点：,能够可靠地测定肽链,30,个左右氨基酸残基序列，最多能够分析,50-60,个氨基酸残基。在最好条件下，每形成一次,PTH-,氨基酸，效率可保持在,99%,以上。而且此法用量少，,缺点：,因为,Edman,降解是以化学试剂对,N-,端氨基修饰为基础，所以当,N-,端被其它化学基团所封闭时，就需要先去除这些基团，然后才能进行测序。另外，蛋白质中含有半胱氨酸残基时，有时两个半胱氨酸残基会发生二硫键交联。这种情况下，需要先用过酸将二硫键氧化为,SO3H,，然后才能用,Edman,降解测定序列。,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第61页,2.,质谱法,质谱技术基于串联质谱技术氨基酸测序方法是依据质谱技术测定多肽分子质量极高准确性这一特点而设计,。,先测定某一肽段（如：,A,-B-C-D-E-F-G-,）以及从,C-,末端或,N-,末端去除一个残基同一肽段（如：,B-C-D-E-F-G-,）各自,分子质量,，二者之差值即为末端残基（,A,）分子质量。,然后与,20,种标准氨基酸分子量进行比较就能够确定末端氨基酸本质了。,测定时：,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第62页,实际操作时：,从质谱上得到是一系列多肽片段，每对大小相近片段之间仅仅相差一个氨基酸残基。,依据这一分子量差值大小，较大肽段末端残基即可准确判断。换句话说，从取得一系列依次相差一个残基肽段分子质量中我们很快就能够确定最初样品多肽末端序列（从,N,一末端或,C,一末端开始）。,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第63页,二、蛋白质空间结构分析,（一）,X,射线衍射晶体分析法,（二）核磁共振法,（三）圆二色谱法,（四）傅里叶变换红外光谱法,（五）生物信息学预测蛋白质空间结构,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第64页,（一）,X,射线衍射晶体分析法,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第65页,X,射线本质,X,射线是一个短波长,(0.005,10nm),、高能量,(2.510,5,1.210,2,eV),电磁波。它是原子内层电子在高速运动电子流冲击下，产生跃迁而发射电磁辐射。,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第66页,X-,射线晶体结构分析基本原理,X,射线衍射分析所依赖基本原理是,X,射线衍射现象,X,射线衍射现象,利用,X,射线波长和晶体中原子大小及原子间距同数量级特征来分析晶体结构。,当,X,射线入射到样品晶体分子上时，分子上每个原子使,X,射线发生散射，这些散射波之间相互叠加形成衍射图形。,衍射图形能给出样品内部结构许多资料，如原子间,距离,、,键角,，分子,立体结构,、,绝对构型,、原子和分子,堆积,、有序或无序,排列,等。,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第67页,（二）核磁共振法,1946,年美国,斯坦福大学,F.Bloch,和哈佛大学,E.M.Purcell,两个研究小组首次独立观察到核磁共振现象，为此他们两人获,1952,年诺贝尔物理奖。,1983,年,，瑞士科学家,Kurt W,thrich,教授试验室首次利用核磁共振方法解析了胰高血糖素（,glucagon,）多肽溶液构象,.,创造了利用核磁共振,(NMR),技术测定溶液中生物大分子三维结构方法取得了,年度诺贝尔化学奖,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第68页,NMR,基本原理,核磁共振,(Nuclear Magnetic Resonance),，,就是处于某个静磁场中自旋核系统受到对应频率射频磁场作用时,共振吸收某一特定频率射频辐射物理过程。,核磁共振波谱,是测量原子查对射频辐射,(,约,4,600MHz),吸收，这种吸收只有在高磁场中才能产生。,核磁共振波谱仪,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第69页,核磁共振法中几个惯用参数,化学位移,耦合常数,NOE,（核欧沃豪斯效应）信号强度,谱峰面积,弛豫时间,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第70页,（,1,）化学位移,值越大，表示屏蔽作用越小，吸收峰出现在低场；,值越小，表示屏蔽作用越大，吸收峰出现在高场。,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第71页,（,2,）耦合常数,核与核之间,以价电子为媒介相互耦合引发谱线分裂现象称为自旋裂分。因为自旋裂分形成多重峰中相邻两峰之间距离被称为自旋自旋耦合常数,用,J,表示。耦合常数用来表征两核之间,耦合作用大小,。,J,耦合常数大小主要与连接两个核化学键数目相关，与影响标量耦合核之间电子云分布原因相关。,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第72页,（,3,）,NOE,信号强度,当分子内有两个空间距离小于,0.5nm,原子核时，假如用双共振法照射其中一个核，使干扰场强度增加到刚使被干扰谱线到达饱和，则另一个靠近原子核共振信号就会增加，这种现象称,核欧沃豪斯效应,（,NOE,）。,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第73页,（,4,）谱峰面积,谱峰面积和分子中同一化学环境原子核数目标多少成正比，所以峰面积积分值可用来做定量分析基础。,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第74页,（,5,）弛豫时间,原子核从激化状态回复到平衡排列状态过程叫弛豫过程。它所需时间叫,弛豫时间,。,自旋晶格弛豫：,处于高能态氢核，把能量转给周围分子，回到低能态。,自旋,-,自旋弛豫：,两个进动频率相同，进动取向不一样磁性核，在一定距离内时，它们相互交换能量，改变进动方向。,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第75页,二维核磁共振,(2DNMR,）,NMR,可取得分子内各核化学环境、核间耦合关系、空间构象等信息，不过当分子较大时候，因为裂分谱线间重合，所以在测定了同一个核一维谱之后，需要了解两种或三种不一样核之间联络关系，如,C-H,，,N-H,等就需要用到,2DNMR,，它是,2,个频率变量函数，吸收峰对,2,个频率变量作图。,1,H-,1,H COSY,、,1,H-,15,N HSQC,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第76页,核磁共振技术应用,早期,核磁共振主要用于对,核结构和性质,研究，如测量核磁矩、电四极距、及核自旋等,。,以后,广泛应用于,分子,组成和结构分析，,生物,组织与,活体,组织分析，病理分析、医疗诊疗、产品无损监测等方面,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第77页,（三）圆二色谱法,圆二色谱是研究,稀溶液,中蛋白质结构一个简单、快速而又较准确方法。,圆二色谱是利用不对称分子对,左、右圆偏振光,吸光率不一样来分析蛋白质结构。,1969年，Greenfield用圆二色光谱数据预计了蛋白质二级结构。今后，关于利用圆二色谱研究蛋白质空间结构报道逐步增多。,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第78页,平面偏振光,：,指振动方向在同一平面内电磁波。,圆偏振光,：,当两束,振幅相等,、,相互垂直,偏振光位相相差,1/4波长(90)时，其合成矢量绕光传输方向旋转前进，朝着光源方向观察时，电场矢量E末端轨迹为圆形，所以称之为,圆偏振光,。电场矢量方向顺时针方向旋转称为,右圆偏振光,，逆时针方向旋转则称,左圆偏振光,。,椭圆偏振光,：,振幅不等左、右圆偏振光合成,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第79页,圆二色性和圆二色谱,圆二色性,：,当左、右圆偏振光进入物质时，光学活性物质分子对它们吸收不一样，它们差值就是圆二色性,光学活性物质分子对左、右圆偏振光吸收不一样，这种吸收差造成矢量振幅差，从介质出来光成为椭圆偏振光，用,椭圆度,或,吸收差,表示,圆二色谱,：,指,椭圆度,(或比椭圆度等)与,波长,关系，它在本质上与旋光色散谱是一样。,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第80页,圆二色谱应用,在分子生物学中，圆二色仪主要应用于测定,生物大分子空间结构,。,生物大分子很多是不对称，即,光学活性分子,，经过圆二色谱测定和计算能够了解生物大分子在溶液状态下二级结构,。,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第81页,蛋白质或多肽是由氨基酸经过肽键连接而成含有特定结构生物大分子，主要光学活性生色基团是肽链骨架中,肽键、芳香氨基酸残基,及,二硫键,，另外，有蛋白质,辅基,对蛋白质圆二色性有影响。,肽键不对称性使得它总有光活性,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第82页,蛋白质圆二色性主要由活性生色基团及折叠结构两方面圆二色性总和。依据电子跃迁能级能量大小，蛋白质,CD,光谱分为三个波长范围,:,1,）,250nm,以下,远紫外光谱区,，圆二色性主要由肽键,n,*,电子跃迁引发；远紫外,CD,主要应用于蛋白质,二级结构解析,2,）,250,300nm,近紫外光谱区,，主要由侧链芳香基团,*,电子跃迁引发；近紫外,CD,主要揭示蛋白质,三级结构信息,3,）,300,700nm,紫外,-,可见光光谱区,，主要由蛋白质辅基等外在生色基团引发。紫外,-,可见光,CD,主要用于,辅基偶合分析,。,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第83页,肽键,是高度有规律排列，其排列方向性决定了肽键能级跃迁分裂情况。含有不一样二级结构蛋白质或多肽所产生,CD,谱带位置、吸收强弱都不相同。所以，依据所测得蛋白质或多肽远紫外,CD,谱，能反应出蛋白质或多肽链二级结构信息，从而揭示蛋白质或多肽二级结构。,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第84页,-,螺旋,结构在靠近,192nm,有一正谱带，在,222,和,208nm,处表现出两个负特征肩峰谱带；,-,折叠,CD,光谱在,216nm,有一负谱带，在,185,200nm,有一正谱带；,-,转角,在,206nm,附近有一正,CD,谱带，而左手螺旋,P2,结构在对应位置有负,CD,谱带，如上图和表所表示。,-band(nm),+band(nm),-,螺旋,222,，,208,192,-,折叠,216,195,-,转角,220-230(,弱,),，,180-190,（强）,205,左手螺旋,P2,结构,190,210-230,（弱）,无规则卷曲,200,212,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第85页,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第86页,CD,数据拟累计算蛋白质二级结构方法基本原理是假设蛋白质在波长,处,CD,信号,(),是蛋白质中或多肽各种二级结构组分及由芳香基团引发噪音线性加，,()=f,i,(),i,+noise,。,(),i,是第,i,个二级结组成份,CD,信号值，,f,i,为第,i,个二级结组成份含量分数，,f,i,要求值为,1,；经过已知蛋白（或称参考蛋白）二级结构圆二色数据库，曲线拟合未知蛋白或多肽圆二色数据，估算未知蛋白或多肽二级结构。,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第87页,蛋白质或多肽二级结构拟累计算方法中，主要采取多聚氨基酸为参考多肽。,Greenfield,等采取多聚,L-lys,作参考多肽，建立,-,螺旋、,-,折叠及无规卷曲等二级结构参考,CD,光谱曲线，采取单一波长法（,208nm,）计算出,-,螺旋含量后，然后假设不一样,-,折叠含量（,X,）值，并假设,CD,值是,-,螺旋含量,(X,H,),、,-,折叠含量,(X,),无规卷曲,(X,R,),三者贡献值加和，即：,X,H,+X,+X,R,=1,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第88页,经过计算得到不一样波长,(),，得出计算曲线。假设一些不一样,X,值，分别求出它们对应计算曲线，找出与试验曲线最靠近曲线，对应于该最靠近曲线,X,及,X,R,即认为是该蛋白质对应结构含量。,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第89页,Example fit:myoglobin(,肌红蛋白,),In this case:,q,t,=,x,a,q,a,+,x,b,q,b,+,x,c,q,c,fits best with,x,a,=80%,x,b,=0%,x,c,=20%,agrees well with structure,78%helix,22%coil,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第90页,（四）傅里叶变换红外光谱法,傅里叶变换红外光谱法,(Fourier transform infrared spectrometer,FTIS),主要是对其红外光谱中酰胺,I,谱带进行分析。酰胺,I,谱带为,-,螺旋、,-,折叠、,-,转角和无规卷曲等不一样结构振动峰加和带，彼此重合，在,12601700cm,-1,范围内通常为一个不易分辨宽谱带。当前常应用去卷积、微分等数学方法，使加合带中处于不一样波数,-,螺旋、,-,折叠、,-,转角和无规卷曲等各个吸收峰得以分辨。最终经谱带拟合，取得各个吸收峰信息。,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第91页,（五）生物信息学预测蛋白质空间结构,1.,同源模建法,是预测蛋白质三维结构主要方法，经过对蛋白质数据库分析能够得到结论：任何两种蛋白质，假如二者序列同源部分超出,30%,，则它们含有相同三维结构，及他们基本折叠相同，只是在非螺旋和非折叠区域一些细节部分有所不一样。蛋白质结构比蛋白质序列更保守，假如两个蛋白质氨基酸序列有,50%,相同，那么约有,90%,碳原子位置偏差不超出,3%,。,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第92页,主要步骤：,识别模拟模板；目标序列和模板序列排列；构建模型；构建非保守,loop,区；安装侧链；模型修饰；结构合理性评定,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第93页,2.,折叠识别法,也称穿线法（,threading,）。经过对已知蛋白质结构研究发觉，大量序列同源性较差蛋白质存在相同折叠结构。折叠识别法就是利用已知蛋白质折叠子为模板，寻找给定氨基酸序列可能采取折叠类型，进而进行结构预测。,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第94页,主要步骤：,建立模板数据库；结构打分函数；比对；预测,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第95页,3.,从头预测法,蛋白质结构从头预测是不依赖模板仅从氨基酸序列信息得到天然结构。它关键是正确定义能量函数、准确选取计算机搜索算法来寻找能量最低值。,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第96页,第五节 蛋白质功效分析方法,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第97页,一、酵母双杂交技术,利用杂交基因经过激活汇报基因表示，探测蛋白质,-,蛋白质相互作用,。,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第98页,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第99页,酵母双杂交系统利用杂交基因经过激活汇报基因表示探测蛋白蛋白相互作用。主要有二类载体,:,a,含,DNA-binding domain,载体,;,b,含,Transcription-activating domain,载体。,1,）两种蛋白之间是否有相互作用,2,）寻找一个蛋白可能相互作用蛋白,应用,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第100页,二、噬菌体展示技术,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第101页,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第102页,三、表面等离子共振技术,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第103页,四、蛋白质芯片技术,蛋白质的研究方法与原理专家讲座,第104页,生,物,芯,片,基因芯片,蛋白质芯片,微流控芯片,蛋白质芯片,又称,蛋白质阵列,或,蛋白质微阵列,，是指以蛋白质分子作为配基,将其有序地固定在固相载体表面形成微阵列；用标识了荧光蛋白质或其它它分子与